2. 新疆天山畜牧生物工程股份有限公司, 昌吉 831100
2. Xinjiang Tianshan Animal Husbandry Bio-Engineering Co., Ltd., Changji 831100, China
大豆黄酮、芒柄花素是芳香环的非甾体酚类化合物，具有多样的天然生物活性，其结构和功能类似于哺乳动物的雌二醇及其代谢产物[1]，也可与雌激素受体选择性结合，起到雌激素样或抗雌激素活性作用[2]。研究表明, 给奶牛饲喂大豆黄酮、芒柄花素后可通过刺激奶牛乳腺细胞的发育[3], 提高产奶量[4]。同时大豆黄酮、芒柄花素可在动物胃肠道细菌的作用下产生雌马酚[5]。雌马酚具有促进动物生长、生殖系统的发育、降低女性有关雌激素失调引起的乳腺癌和男性前列腺癌的风险、预防心血管疾病、缓解更年期症状、预防骨质疏松等作用[6]，又由于雌马酚在体内能够稳定存在并且可以分泌到母畜乳汁中，因此生产含有具有雌马酚的乳产品将具有较好的经济价值。郝振荣等[7]使用分别含有10、20、30 mg/kg大豆黄酮的饲粮饲喂中国荷斯坦奶牛，产奶量分别提高了7.29%、12.66%、10.13%。Hñjer等[8]将含有芒柄花素的红三叶草饲喂给泌乳期奶牛后，乳中雌马酚含量显著增加。前人的研究已经证实，大豆黄酮、芒柄花素可提高奶牛的产奶量，增加乳中雌马酚含量，而饲喂大豆黄酮、芒柄花素后对奶牛血液及乳中繁殖相关的激素有何影响尚不明确。因此，本研究以泌乳期荷斯坦奶牛为研究对象，探究大豆黄酮、芒柄花素及其组合对高奶牛产奶性能的影响，以期进一步证实其提高乳中雌马酚含量的作用，同时研究大豆黄酮、芒柄花素及其组合是否会影响奶牛血液和乳中激素含量，为生产含有雌马酚的牛奶提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点试验于2015年6月至2015年11月在新疆天山畜牧生物工程股份有限公司进行。
1.2 试验动物及试验设计选取健康、年龄及泌乳期相近的40头荷斯坦奶牛，随机分为4组，分别为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组10头。对照组和试验组均饲喂全混合日粮(TMR)，试验组大豆黄酮、芒柄花素的饲喂量参考郝振荣等[7]和Mustonen等[9]的研究结果，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别添加2.50 g大豆黄酮(购自郑州赛诺康化工产品有限公司，纯度99%)、35.0 g芒柄花素(购自陕西绿清生物工程有限公司，纯度99%)、1.25 g大豆黄酮+17.5 g芒柄花素。进行127 d的饲养试验，其中预试期7 d，正试期120 d。分别于正试期的第1、30、60、90、120天记录产奶量，采集乳及血浆样品。预试期注意观察奶牛健康状况、乳房炎发病及对添加物的采食情况。
1.3 饲养管理对照组与试验组均处于同一环境条件下，结合奶牛采食习惯，每天10：00和17：00饲喂TMR，添加大豆黄酮、芒柄花素时将两者与少量TMR均匀混合后进行单槽饲喂，试验期间奶牛可自由饮水，每天定时清粪，保持圈舍清洁，每天挤奶3次。TMR组成及营养水平见表 1。
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表 1 TMR组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the TMR (air-dry basis) |
在正试期第1、30、60、90、120天采集乳样，根据奶牛泌乳规律，在挤奶时进行乳样采集，分别在04:00、11:00、17:00进行机械挤奶，将3次采集样品进行混合，取150 mL，装入干净的塑料瓶中。
在正试期第1、30、60、90、120天通过颈静脉采集血液，每头牛采血15 mL，分装于5 mL的肝素钠抗凝管中，将所有血样在离心机中3 500 r/min离心15 min，收集血浆，分装至2 mL Eppendorf管中(每管1.5 mL)，-20 ℃保存待测。
1.5 样品的测定将采集的乳样混匀后立即使用MilkoScan FT 120乳成分分析仪[丹麦福斯集团(中国)有限公司]进行乳成分测定。
乳中雌酮(estrone, E)、雌二醇-17β(estrogen-17β, E2-17β)、雌三醇(estriol, E3)、孕酮(progesterone, P)含量，血浆中雌酮、雌二醇-17β、雌三醇、促卵泡素(follicle stimulating hormone, FSH)、促黄体素(luteinizing hormone, LH)、孕酮、催乳素(prolactin, PRL)含量均送至北京华英生物技术研究所进行测定。
参考Hoikkala等[10]和李岩等[11]的方法，利用高效液相色谱法，测定乳中雌马酚(equol, Eq)含量。
1.6 数据处理与分析试验数据用Excel进行整理，使用SAS 8.0中Mixed混合模型统计，固定效应有组别、时间及二者之间的交互作用。方差结构采用协方差结构(CS)，数据为最小二乘平均值，显著性判断标准为P < 0.05，采用Lsmeans方法进行多重比较。
2 结果与分析 2.1 大豆黄酮、芒柄花素及其组合对奶牛产奶性能的影响大豆黄酮、芒柄花素及其组合对奶牛产奶性能的影响见表 2。大豆黄酮、芒柄花素及其组合可提高奶牛产奶量，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与对照组相比差异显著(P < 0.05)，分别比对照组提高了30.40%、27.77%、28.37%；试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的乳脂率均低于对照组，其中Ⅰ与对照组差异显著(P < 0.05)，而试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的乳脂产量均高于对照组，但组间差异不显著(P>0.05)；试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的乳蛋白率和乳蛋白产量均高于对照组，其中试验Ⅲ组与对照组相比差异显著(P < 0.05)；各试验组乳糖率与对照组相比差异不显著(P>0.05)，而试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组乳糖产量均显著高于对照组(P < 0.05)；对照组、试验Ⅲ组乳尿素氮含量显著高于试验Ⅱ组(P < 0.05)，对照组和试验Ⅰ、Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)。
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表 2 大豆黄酮、芒柄花素及其组合对奶牛产奶性能的影响 Table 2 Effects of daidzein, formononetin and their combination on milk performance of dairy cows (n=10) |
大豆黄酮、芒柄花素及其组合对血浆和乳中激素含量的影响见表 3。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血浆中雌酮含量低于对照组，而试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组乳中雌酮含量高于对照组，但差异均不显著(P>0.05)；试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血浆和乳中雌二醇-17β含量均高于对照组，其中试验Ⅲ组与对照组相比差异显著(P < 0.05)；试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血浆和乳中雌三醇含量均高于对照组，但差异不显著(P>0.05)；各试验组血浆和乳中孕酮含量均高于对照组，其中试验Ⅱ组血浆中孕酮含量显著高于对照组(P < 0.05)，试验Ⅰ、Ⅲ组乳中孕酮含量显著高于对照组(P < 0.05)；各组间血浆中促卵泡素、促黄体素含量差异不显著(P>0.05)；各试验组血浆中催乳素含量高于对照组，试验Ⅱ组与对照组差异显著(P < 0.05)；试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组乳中雌马酚含量显著高于对照组(P < 0.05)。
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表 3 大豆黄酮、芒柄花素及其组合对血浆和乳中激素含量的影响 Table 3 Effects of daidzein, formononetin and their combination on plasma and milk hormone contents of dairy cows (n=10) |
泌乳奶牛的产奶量是评价经济效益的重要指标，其与遗传水平、营养水平和生理状态有关，这些因素会直接影响泌乳奶牛的内分泌，最终影响奶牛的产奶量。一些研究表明, 低剂量的植物雌激素会增加母畜的产奶量。刘德义等[12]选取24头荷斯坦奶牛，分别饲喂2.8、3.3 g/(d·头)大豆黄酮，日产奶量分别提高11.8%、3.4%。杨建英等[13]给荷斯坦奶牛添加1 g/(d·头)的大豆黄酮，能够提高泌乳中期奶牛的产奶量。Lundh[14]研究表明，奶牛饲粮中添加大豆黄酮，能够增加日产奶量和整个泌乳期产奶量。卢志勇等[15]将不同梯度(10、100和1 000 mg/L)的大豆黄酮与奶牛乳腺上皮细胞共培养72 h后，奶牛乳腺上皮细胞分泌的β-酪蛋白、乳糖和甘油三酯含量得到提高。
在本试验中，各试验组产奶量均高于对照组，表明大豆黄酮、芒柄花素及其组合可显著提高奶牛产奶量，与前人的研究结果一致，可能是因为大豆黄酮、芒柄花素能够产生弱雌激素作用，使血液中催乳素含量上升，作用于乳腺组织后，增加了乳汁分泌[16]。饲喂大豆黄酮、芒柄花素及其组合后牛奶中乳脂率、乳糖率有所下降，这可能与奶牛的产奶量提高有关。而饲喂大豆黄酮、芒柄花素及其组合后牛奶中乳蛋白率、乳蛋白产量增加。这可能存在2个方面的原因：其一，由于大豆黄酮和芒柄花素进入奶牛体内后使血液中催乳素含量增加，催乳素与其受体结合后，引起核蛋白体RNA升高，使酪蛋白mRNA翻译转录速度增加，从而提高了乳汁中蛋白含量[17]；其二，大豆黄酮和芒柄花素在机体内代谢产生的类雌激素物质可调节机体氮代谢水平、减少尿素氮的产生，并增加氮的保留，即促进蛋白质的合成，降低蛋白质的分解，提高饲粮的转化效率，最终导致乳汁中蛋白含量升高[18]。
乳尿素氮是奶牛对饲粮中蛋白质利用率、饲粮中蛋白质与能量平衡的重要评价指标[19]。Hwang等[20]认为当乳尿素氮在12~19 mg/dL、乳蛋白率≥3%时饲粮中粗蛋白质、能量较为平衡。在本试验中，各组乳尿素氮含量在14.66~16.09 mg/dL、乳蛋白率在3.24%~3.44%，表明饲喂的饲粮中蛋白质、能量平衡。饲喂大豆黄酮、芒柄花素后，乳尿素氮含量有所下降，表明大豆黄酮、芒柄花素可能提高了机体对饲粮中粗蛋白质的利用，这也与乳蛋白率、乳蛋白产量增加的结果相一致。
3.2 大豆黄酮、芒柄花素及其组合对血浆和乳中激素含量的影响乳的分泌包括泌乳的发动和泌乳的维持2个方面。在初情期和妊娠期，雌酮和孕酮共同促进腺泡的发育[21]，同时生长激素和催乳素起协同作用共同促进乳腺的发育[16]，使乳腺细胞数量达到一定的程度，为泌乳的发动打下基础。泌乳的维持继需要保持腺泡细胞数量，又要保持每个乳腺细胞代谢活性和排乳发射功能。激素综合性控制着泌乳过程，参与维持泌乳的激素有生长激素、催乳素、糖皮质激素、甲状腺激素、胰岛素和甲状旁腺素[21]。大豆黄酮、芒柄花素在动物体内代谢后可产生类雌激素物质，可与动物的乳腺、垂体、下丘脑胞浆雌二醇受体竞争性结合，诱发血液中催乳素、生长激素和胰岛素含量的增加[22]。刘春龙等[23]选用15头泌乳中期荷斯坦奶牛，饲喂200 mg/d大豆黄酮60 d后，血清中催乳素和雌二醇-17β含量增加。杨建英等[24]选取15头泌乳晚期荷斯坦奶牛，添加20 mg/kg的大豆黄酮，血清和乳中催乳素含量分别提高13.89%、17.53%。
在本试验中，大豆黄酮、芒柄花素及其组合可提高血浆中雌二醇-17β、孕酮、催乳素含量，与前人的研究结果相似，这是由于大豆黄酮、芒柄花素代谢产物具有类似雌激素作用，可以与雌激素受体竞争性结合，而血浆中雌激素受体数量有限，内源性雌激素无法与受体结合，游离在血浆中，导致雌二醇-17β含量升高[25]。奶牛的泌乳过程受到了孕酮和催乳素等激素的调控，本试验中饲喂大豆黄酮、芒柄花素及其组合后血浆中孕酮和催乳素含量增加，这也与各试验组产奶量增加相一致。在正常生理条件下，促卵泡素和促黄体素有协同作用[26]，促卵泡素可促使卵泡生长发育，促黄体素具有促使卵泡成熟排卵、诱导颗粒细胞产生芳香化酶将睾酮转化为雌二醇-17β，促使子宫发育等作用。在本试验中饲喂大豆黄酮、芒柄花素及其组合后，奶牛血浆中促卵泡素、促黄体素含量无显著变化，可能是由于试验动物处于妊娠期，体内孕酮含量较高，抑制了促卵泡素、促黄体素的分泌。因此，给泌乳期奶牛短期饲喂大豆黄酮、芒柄花素及其组合后提高产奶量的同时，不会极显著影响奶牛机体内与繁殖相关的激素含量，可能是由于奶牛机体内产生的过多激素可通过泌乳的方式分泌到乳汁中，保持了机体内各种激素的平衡，而长期饲喂大豆黄酮、芒柄花素对奶牛机体内激素含量的影响值得进一步研究。
哺乳动物乳汁中主要类固醇激素有雌酮、孕酮、睾酮等物质，含量的高低受到动物品种、饲粮蛋白质水平、生理状态等的影响。饲喂高动物蛋白质的饲料在增加产奶量的同时可能也会增加乳中雌激素的含量[27]。Campbell等[28]认为奶牛妊娠后期，血浆、乳中的雌激素含量显著增加。朱河水[22]的研究表明，乳中雌二醇-17β、生长激素和催乳素含量的变化与血浆中的变化相一致。Batra[29]和Abeyawardene等[30]发现乳中雌二醇-17β含量与血浆中雌二醇-17β含量相关，并且随着妊娠期的延长，乳中雌三醇含量会有所上升。
在本试验中，各组乳中的雌酮、雌二醇-17β、雌三醇、孕酮含量的变化与血浆中雌酮、雌二醇-17β、雌三醇、孕酮含量的变化相一致，表明乳中的雌酮、雌二醇-17β、雌三醇、孕酮含量与血浆中的含量是正相关关系。Malekinejad等[31]报道，奶牛整个妊娠期间乳中雌酮、雌二醇-17β平均含量均为63 pg/mL，本试验中雌酮、雌二醇-17β含量分别在58.87~65.34 pg/mL、5.49~7.86 pg/mL，低于前人的报道。这可能与试验动物的品种、生理状态、遗传因素以及检测时乳样品的提取和分离方法等有关。袁丽君等[32]测定乳中孕酮含量在10~20 ng/mL，而本试验中测定的乳中孕酮含量低于其测定结果。饲喂大豆黄酮、芒柄花素及其组合对乳中雌三醇含量无显著影响。
大豆黄酮、芒柄花素属于异黄酮类植物雌激素，可在动物胃肠道细菌的作用下形成雌马酚[14]。Antignac等[33]测定了普通乳中的雌马酚含量为36 μg/L。Mustonen等[9]研究发现给奶牛饲喂富含大豆黄酮的红三叶草青贮后，乳中雌马酚平均含量在458~643 μg/L。本试验中，饲喂大豆黄酮、芒柄花素及其组合后乳中雌马酚含量显著增加，这一结果证实了生产富含雌马酚牛奶的可能性。因此，饲喂大豆黄酮、芒柄花素及其组合后可使乳中雌马酚含量显著增加，并使乳中雌酮、雌二醇-17β、雌三醇、孕酮含量保持在正常范围内。
4 结论饲喂大豆黄酮、芒柄花素及其组合可提高奶牛产奶量，改善乳品质，显著增加乳中雌马酚含量，同时使奶牛血浆和乳中雌二醇-17β、孕酮含量增加。
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