银鲳(Pampus argenteus)隶属鲳科(Stromateidae)鲳属(Pampus)，在我国各海域均有分布[1]，以东海北部近海即吕四和舟山渔场的资源量最高，是沿海地区重要的经济鱼类，具有较高的养殖开发潜力[2]。自21世纪初，国内陆续开展了针对银鲳人工繁育及养殖方面的研究，尽管在人工繁育及养殖方面取得了一定的科技成果[3-4]，但规模化养殖及技术推广仍存在较大难度，其中运输问题是主要的限制因子之一，原因在于银鲳对闪光、噪声、人工操作、运输等都有明显的应激反应，且反应强烈，造成体表大量分泌黏液、粉鳞脱落、擦伤和撞伤，极易死亡。长链多不饱和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acids, LC-PUFA)分为n-3和n-6系列，是鱼类维持正常生长发育和生理功能的重要营养物质，且主要从外界获取[5]。鱼油中n-3 LC-PUFA含量较高，鱼类饲料中常通过添加鱼油补充LC-PUFA。由于目前鱼油原料短缺且价格昂贵，而植物油资源较丰富且价格低廉，因此植物油在饲料工业上常被用作鱼油替代品，但大部分植物油中n-6 PUFA含量较高，n-3 PUFA含量较少甚至没有[6-7]。Villasante等[8]研究显示：n-6 PUFA与n-3 PUFA摄入比例不均衡会影响脂类代谢，造成某些脂类大量积累，进而增加鱼体组织中发生脂质过氧化的风险。另外，n-3 PUFA比n-6 PUFA更容易发生脂质过氧化作用[9]。因此，饲料中保持适当的n-3/n-6 PUFA十分重要。组织中脂肪酸组成的改变会引起机体抗氧化水平的相应变化，其产生的氧化压力将削弱机体抗应激和抗氧化的能力。
应激反应是一种对外界刺激的保护性措施，包括运动协调性、激素水平、能量代谢和电解质平衡等的变化[10]。但持续处于应激状态会导致机体的需氧代谢紊乱，产生氧化自由基，并且免疫防御体系将会受到抑制，导致鱼体对病原敏感性的增加[11-12]。血液中皮质醇(COR)、葡萄糖(GLU)以及乳酸(LD)浓度随应激程度的不同呈规律性变化，可作为反映应激程度的指标[13]。另外，运输过程中的机械损伤也会引发细菌和真菌感染，导致运输后一段时间内发生持续死亡现象[14]。乙酰胆碱酯酶(acetyl-cholinesterase，AChE)是神经传导中的关键酶，在突触间降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号的正常传递。银鲳应激反应强烈，运输存活率低，运输后存活个体也会出现行为和生理异常，例如：受刺激后通常会越出水面、撞击池壁或网箱，过度兴奋后又会原地打转或打漂，并难以恢复正常。因此，本试验通过在饲料添加大豆油替代不同比例的鱼油饲喂银鲳，研究其在运输胁迫前后血清皮质醇、葡萄糖、乳酸浓度以及AChE活力和组织抗氧化能力的变化情况，旨在为银鲳运输前饲料组成配比和体质强化提供参考。
1 材料与方法 1.1 饲料制备分别以100%鱼油(FO组)、70%鱼油+30%大豆油(FSO组)、30%鱼油+70%大豆油(SFO组)、100%大豆油(SO组)为脂肪源配制等氮等能等脂的4种试验饲料，其组成及营养水平见表 1，脂肪酸组成见表 2。4种试验饲料的蛋白质水平均在50%左右，脂肪水平均在16%左右。所有饲料原料经过充分混合后经绞肉机制成粒径为2 mm的颗粒料，于25 ℃烘箱中风干后，放于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2 试验设计与取样挑选600尾体表无伤、体色正常的银鲳幼鱼(4月龄)为试验鱼，初始规格：平均体重(17.2±6.7) g，平均叉长(8.5±0.9) cm。将600尾试验鱼平均分配于12个16 m3的圆形水泥池中，并随机分为4个饲料组，每组3个重复(水泥池)，每池50尾试验鱼。预饲1周，饲养试验自2013年8月开始，于2013年9月结束，共计60 d。饲养期间，养殖水泥池24 h不间断充气，每天饱食投喂2次(08:00和16:00)，日换水量为40%。整个试验期间水温变化范围为24~29 ℃，盐度为24~27。
饲养试验结束后从每个水泥池取3尾鱼作为胁迫前样本(n=9)。而后从每个水泥池取3尾鱼进行4 h运输胁迫，将3尾鱼放入40 L塑料打包袋，加15 L新鲜海水并充满氧气，用橡皮筋扎住袋口密封，放入50 L容积泡沫箱，共12箱。用卡车运输4 h，以碎冰保持运输水温为22~24 ℃，4 h运输胁迫后，出现少量死亡，故每袋取2尾作为胁迫后样本(n=6)。样品鱼随机选取，规格相近，平均体重为(34.8±5.8) g，平均叉长为(10.9±1.1) cm。
样品鱼捞取后立即经100 mg/L MS-222麻醉，然后用1 mL无菌注射器尾静脉采血，置于无菌离心管中，4 ℃静止12 h，4 000 r/min离心15 min，取其上清液。采血后，在碎冰上解剖取两侧肌肉、肝脏、组织，从头后部剖开取脑组织。用生理盐水润洗并用滤纸片吸干水分，血清、肌肉、肝脏和脑部组织置于-70 ℃保存备用。
1.3 指标检测血清皮质醇浓度的测定采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法，试剂盒为美国R & D公司生产的海水鱼皮质醇ELISA试剂盒。血清葡萄糖和乳酸浓度采用分光光度法测定。
AChE活力采用胆碱巯基显色剂法测定，酶活力单位(U/mg prot或U/mL)定义为：每毫克组织蛋白质或每毫升血清在37 ℃保温6 min，水解1 mol基质为1个活力单位。超氧化物歧化酶(SOD)活力采用黄嘌呤氧化酶法测定，酶活力单位(U/mg prot或U/mL)定义为：每毫克组织蛋白质或每毫升血清在1 mL反应液中超氧自由基抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位。过氧化氢酶(CAT)活力采用比色法测定，酶活力单位(U/mg prot或U/mL)定义为：每毫克组织蛋白质或每毫升血清每秒钟分解1 μmol H2O2的量为1个活力单位。上述酶活力采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，按说明书操作。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
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表 2 试验饲料脂肪酸组成(占总脂肪酸的百分比) Table 2 Fatty acid composition of experimental diets (percentage of total fatty acids) |
试验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0软件对银鲳各项指标数据进行统计与分析，运用单因素方差分析和双因素方差分析，先进行方差齐性检验，不满足方差齐性时，对数据进行自然对数或平方根转换，采用Duncan氏法对各组数据进行多重比较，P < 0.05为存在显著性差异。用t检验检测运输胁迫前后的变化，P < 0.05为存在显著性差异。用Excel 2007绘制图表。
2 结果与分析 2.1 银鲳血清皮质醇浓度4 h运输胁迫前后各组银鲳血清皮质醇浓度变化情况如图 1所示。运输胁迫前各组血清皮质醇浓度差异不显著(P>0.05)。4 h运输胁迫后，各组血清皮质醇浓度都有所升高，其中SO组上升显著(P < 0.05)，并且显著高于SFO组(P < 0.05)。血清皮质醇浓度最高值出现在胁迫后SO组，为(20.45±3.31) ng/mL，最低值出现在胁迫前SO组，为(10.81±1.75) ng/mL。
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图 1 运输胁迫对银鲳血清皮质醇浓度的影响 Figure 1 Effects of transportation stress on serum COR concentration of silver pomfret (Pampus argenteus) |
4 h运输胁迫前后各组银鲳血清葡萄糖浓度变化情况如图 2所示。运输胁迫前各组银鲳血清葡萄糖浓度差异不显著(P>0.05)。4 h运输胁迫后各组血清葡萄糖浓度都出现了上升，但胁迫前后差异不显著(P>0.05)，各组间也不存在显著差异(P>0.05)。血清葡萄糖浓度最高值出现在胁迫后SO组，为(3.37±0.44) mmol/L，最低值出现在胁迫前SFO组，为(2.53±0.42) mmol/L。
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图 2 运输胁迫对银鲳血清葡萄糖浓度的影响 Figure 2 Effects of transportation stress on serum GLU concentration of silver pomfret (Pampus argenteus) |
4 h运输胁迫前后各组银鲳血清乳酸浓度变化情况如图 3所示。运输胁迫前各组血清乳酸浓度差异不显著(P>0.05)。4 h运输胁迫后，各组乳酸浓度都出现显著增加(P < 0.05)，而各组间不存在显著差异(P>0.05)。血清乳酸浓度最高值出现在胁迫后FO组，为(3.14±0.52) mmol/L，最低值出现在胁迫前SO组，为(1.18±0.54) mmol/L。
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图 3 运输胁迫对银鲳血清乳酸浓度的影响 Figure 3 Effects of transportation stress on serum LD concentration of silver pomfret (Pampus argenteus) |
4 h运输胁迫前后各组银鲳血清AChE活力变化情况如图 4所示。胁迫前SFO组血清AChE活力显著高于其他组(P < 0.05)。4 h运输胁迫后，FO、FSO和SFO组血清AChE活力出现了下降，其中FSO组下降显著(P < 0.05)；而SO组略有上升，但差异不显著(P>0.05)；SFO和SO组显著高于其他组(P < 0.05)。血清AChE活力最高值出现在胁迫前SFO组，为(1.30±0.25) U/mL，最低值出现在胁迫后FSO组，为(0.66±0.10) U/mL。
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图 4 运输胁迫对银鲳血清AChE活力的影响 Figure 4 Effects of transportation stress on serum AChE activity of silver pomfret (Pampus argenteus) |
4 h运输胁迫前后各组银鲳脑部AChE活力变化情况如图 5所示。胁迫前FSO和SFO组脑部AChE活力显著高于SO和FO组(P < 0.05)。4 h运输胁迫后，各组脑部AChE活力都出现了显著下降(P < 0.05)，下降后SFO组依然显著高于FO组(P < 0.05)。脑部AChE活力最高值出现在胁迫前SFO组，为(2.39±0.22) U/mg prot，最低值出现在胁迫后FO组，为(1.19±0.20) U/mg prot。
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图 5 运输胁迫对银鲳脑部AChE活力的影响 Figure 5 Effects of transportation stress on AChE activity in brain of silver pomfret (Pampus argenteus) |
4 h运输胁迫前后各组银鲳血清SOD活力变化情况如图 6所示。胁迫前SO组血清SOD活力显著低于其他组(P < 0.05)。4 h运输胁迫后，各组血清SOD活力都出现显著增强(P < 0.05)，FSO组显著高于FO和SO组(P < 0.05)。血清SOD活力最高值出现在胁迫后FSO组，为(78.1±5.7) U/mL，最低值出现在胁迫前SO组，为(29.8±6.6) U/mL。
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图 6 运输胁迫对银鲳血清SOD活力的影响 Figure 6 Effects of transportation stress on serum SOD activity of silver pomfret (Pampus argenteus) |
4 h运输胁迫前后各组银鲳肝脏和肌肉SOD活力变化情况如图 7所示。胁迫前SFO组肌肉SOD活力显著高于FO和SO组(P < 0.05)。4 h运输胁迫后，FO、FSO和SFO组肌肉SOD活力出现了下降，而SO组则有所上升，但变化均不显著(P>0.05)；SFO和SO组显著高于FO和FSO组(P < 0.05)。肌肉SOD活力最高值出现在胁迫前SFO组，为(27.1±6.6) U/mg prot，最低值出现在胁迫前SO组，为(14.7±4.6) U/mg prot。胁迫前FO组肝脏SOD活力显著高于其他组(P < 0.05)，而FSO组显著低于其他组(P < 0.05)。4 h运输胁迫后，除SFO组肝脏SOD活力有所上升外，其他组均显著下降(P < 0.05)；各组间差异不显著(P>0.05)。肝脏SOD活力最高值出现在胁迫前FO组，为(166.1±24.2) U/mg prot，最低值出现在胁迫前SFO组，为(52.4±4.8) U/mg prot。
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图 7 运输胁迫对银鲳肌肉和肝脏SOD活力的影响 Figure 7 Effects of transportation stress on SOD activity in muscle and liver of silver pomfret (Pampus argenteus) |
4 h运输胁迫前后各组银鲳血清CAT活力变化情况如图 8所示。胁迫前SFO组血清CAT活力显著高于其他组(P < 0.05)。4 h运输胁迫后，各组CAT活力都有所增加，其中SO组变化显著(P < 0.05)；各组间差异不显著(P>0.05)。血清CAT活力最高值出现在胁迫后SO组，为(1.93±0.19) U/mL，最低值出现在胁迫前FSO组，为(1.28±0.09) U/mL。
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图 8 运输胁迫对银鲳血清CAT活力的影响 Figure 8 Effects of transportation stress on serum CAT activity of silver pomfret (Pampus argenteus) |
4 h运输胁迫前后各组银鲳肝脏和肌肉CAT活力变化情况如图 9所示。胁迫前SFO组肌肉CAT活力显著高于其他组(P < 0.05)。4 h运输胁迫后，除SFO组肌肉CAT活力略有下降外，其他组都出现了增强，其中SO组变化显著(P < 0.05)；SO组显著高于FO和FSO组(P < 0.05)。肌肉CAT活力最高值出现在胁迫后SO组，为(0.97±0.18) U/mg prot，最低值出现在胁迫前SO组，为(0.45±0.08) U/mg prot。胁迫前FO组肝脏CAT活力显著高于其他组(P < 0.05)。4 h运输胁迫后，FO和FSO组肝脏CAT活力出现下降，SFO和SO组则出现上升，其中SO组变化显著(P < 0.05)；FSO组显著低于FO和SO组(P < 0.05)。肝脏CAT活力最高值出现在胁迫后SO组，为(1.73±0.24) U/mg prot，最低值出现在胁迫后SO组，为(0.40±0.09) U/mg prot。
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图 9 运输胁迫对银鲳肌肉和肝脏CAT活力的影响 Figure 9 Effects of transportation stress on CAT activity in muscle and liver of silver pomfret (Pampus argenteus) |
油脂替代与运输胁迫对各指标的交互作用如表 3所示。油脂替代、运输胁迫以及两者交互作用对肝脏SOD和肌肉、肝脏CAT活力有显著影响(P < 0.05)。油脂替代和运输胁迫对血清皮质醇、乳酸浓度，SOD、CAT活力以及脑部AChE活力都有显著影响(P < 0.05)，但两者交互作用对上述指标的影响不显著(P>0.05)。油脂替代对血清AChE、肌肉SOD活力的影响显著(P < 0.05)，运输胁迫对血清葡萄糖浓度的影响显著(P < 0.05)。
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表 3 油脂替代与运输胁迫双因素方差分析 Table 3 Two-way analysis of variance about oil substitution and transportation stress |
鱼体体质的差异会影响其在运输过程中的应激程度以及运输后的成活率。运输期间的水质变化如溶氧浓度降低、氨氮浓度增高、pH变化，会使鱼体代谢需氧量和体表面黏液分泌量增加，也会对鱼机体和器官造成氧化压力，影响基因的表达和酶的活力[15-16]。另外，运输后银鲳存活个体经常出现头部、鳃部、鳍条和眼睛炎症，也常有打转、打漂等运动失调的状况存在。运输后恢复情况，不同银鲳个体也存在较大差异，有些个体会留下终生创伤，如失明、鳍条缺损等。本试验中，4 h运输胁迫后FO组死亡2条，FSO组和SFO组死亡各1条，SO组死亡3条，各组运输死亡率差别不大。
3.1 运输胁迫对各组银鲳应激指标的影响鱼类受外界胁迫刺激后，其下丘脑-垂体-肾间组织轴(HPI)会迅速释放促肾上腺皮质激素(ACTH)，以促进头肾细胞皮质醇激素的合成与释放[17]。杜浩等[18]研究得出，血清皮质醇浓度的增加会诱发鱼体代谢速率加快，各组织对葡萄糖的利用率降低，并导致抗病、抗氧化及耐低氧能力下降。
在运输胁迫后，鱼类体内皮质醇浓度普遍会显著上升，例如：虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[19]、大黄鱼(Larimichthys crocea)[20]、革胡子鲶(Clarias gariepinus)[21]、欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)[22]和维多利亚野鲮(Labeo victorianus)[23]都在运输不同时间后出现血清皮质醇浓度显著上升的情况。而有些鱼类反应较强烈，在2 h运输后，长江刀鲚(Coilia nasus)血清皮质醇浓度升高2.5倍[24]，而美洲鲥(Alosa sapidissima)血清皮质醇浓度升高达20倍[17]，翘嘴鲌(Culter alburnus)全鱼皮质醇浓度升高2倍[25]。
葡萄糖作为机体的主要功能物质，鱼类血清葡萄糖浓度会随应激程度的不同而发生改变。Iversen等[26]研究表明，应激反应可导致鱼类血清葡萄糖浓度明显升高，出现高血糖症，但维持高血清葡萄糖浓度有助于保障鱼体经受应激胁迫时提供能量供给。乳酸主要是肌肉在供氧不足的情况下通过糖酵解产生的，水体溶氧浓度低、血液循环缓慢以及剧烈的物理运动都可导致乳酸浓度升高。
运输胁迫后，美洲鲥[17]、虹鳟[19]血清葡萄糖浓度显著升高，大黄鱼全鱼乳酸浓度显著增加[20]，而刀鲚血清葡萄糖浓度在2 h运输后升高2倍[24]。维多利亚野鲮在淡水、低盐度(0~0.5)、高盐度(8~10)运输环境下血清葡萄糖浓度均显著上升[23]。运输胁迫后，欧洲鳗鲡血清葡萄糖浓度略有上升，而乳酸浓度则显著下降，据Boerrigter等[22]解释，乳酸转化为丙酮酸可提供能量，并可在鳃、肾脏和肝脏中作为能量来源。
彭士明等[27]对银鲳运输的相关研究(运输时间与密度以及饲料维生素C水平的关系)显示：4 h运输胁迫后，银鲳血清皮质醇、葡萄糖和乳酸浓度升高最为显著，且高密度组浓度最高，而饲料添加维生素C后，上述3各指标的上升幅度显著小于对照组[28]。本试验中，4 h运输胁迫后各组血清皮质醇浓度都有所增加，与之前其他鱼类运输胁迫的研究结果相似，其中SO组变化显著，升高了1.89倍，说明SO组的应激反应比较剧烈，而SFO组变化程度最小，应激反应相对较弱；而各组血清葡萄糖浓度都略有增加，其中SFO组增加最少。从双因素方差分析结果来看，运输胁迫对血清皮质醇、葡萄糖和乳酸浓度都有显著影响，而油脂替代仅对血清皮质醇和乳酸浓度有显著影响，可以推测血清葡萄糖浓度的升高是由于运输胁迫所造成的，而油脂替代会对鱼体皮质醇的调节以及乳酸代谢产生影响，从而造成应激性能的差异。其中血清，乳酸浓度的升高在3个指标中表现最为显著，FO组升高2.06倍、FSO组升高1.79倍、SFO组升高1.76、SO组升高2.11倍，这可能是由于银鲳在运输过程中出现了过度兴奋和剧烈的物理运动，或是有氧代谢失调导致。
植物油替代鱼油会对鱼类的消化道产生不良影响，如肠壁变薄、黏膜褶皱变少，最终会影响脂肪酸的吸收，从而影响鱼类抗应激能力[29]。本试验饲料的高不饱和脂肪酸(HUFA)组成中，虽然豆油替代鱼油后n-3/n-6 PUFA逐渐下降，但花生四烯酸(ARA)和二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量也是随之逐渐下降，而亚麻酸和亚油酸含量则出现上升，这种组分的变化应当对海水鱼类银鲳的脂类消化吸收造成了影响。从血清葡萄糖和乳酸浓度的变化看，SFO和FSO组对运输的应激程度较低，可能是幼鱼饲料中鱼粉含量较高，且鱼油中的ARA、EPA和DHA基本能满足其营养需求，提高亚麻酸和亚油酸含量反而有助于抗应激。
AChE主要分布于神经组织、红细胞和肌肉中，作为神经递质，AChE的活力变化会对鱼类运动和协调能力产生较大影响，并进一步作用于能量合成和代谢通路[30-31]。本试验中，各组银鲳脑部AChE活力都出现显著减弱，而SFO组在胁迫前后的各组中均有最高活力，说明银鲳在运输时都处于兴奋的状态，SFO组的兴奋程度在各组中相对较低，血清AChE活力则是FSO组下降程度最显著，可推测FSO组兴奋程度最高。双因素方差分析显示油脂替代对血清和脑部AChE活力都有显著影响，说明脂肪酸的组成例如EPA、DHA含量对鱼类脑部敏感性会产生一定影响。
3.2 运输胁迫对各组银鲳抗氧化性能的影响鱼类抗氧化防御系统分为酶促与非酶促两大部分[32]。SOD和CAT是2个重要的抗氧化酶，SOD与CAT能有效清除体内的超氧阴离子自由基(O2-·)、游离氧(O)、羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)等活性氧物质[33-34]。而LC-PUFA又是非酶促系统重要的抗氧化活性物质。
抗氧化功能是鱼类抗应激能力的重要组成部分，研究显示运输胁迫对鱼类抗氧化功能有显著影响。例如，运输胁迫后，日本黄姑鱼(Nibea japonica)肝脏SOD和CAT活力显著升高[35]；刀鲚肝脏CAT活力显著降低[36]；红鳍扯旗鱼(Hyphessobrycon callistus)肝脏SOD活力和总抗氧化能力增强[13]；银鲶(Rhamdia quelen)肝脏CAT活力显著下降，而SOD活力变化不显著[15]。
本试验中，4 h运输胁迫后，各组血清SOD活力均显著增强，其中SO组上升幅度最大，上升1.91倍，虽然血清CAT活力各组都有所增强，但只有SO组变化显著。肝脏和肌肉CAT活力仅SO组显著增强。4 h运输胁迫后，SFO组肝脏SOD和CAT活力变化显示其对应激的反应较迅速。SO组肝脏CAT和SOD活力变化极为显著，说明SO组的抗氧化反应十分剧烈。
肝脏是鱼类对脂类和有害物质吸收、代谢的主要器官，应激会影响肝脏的吸收和转运功能[37]。从双因素方差分析看，运输胁迫、油脂替代以及两者交互作用对肝脏SOD和CAT活力都有显著影响。饲料中n-3 LC-PUFA含量过高，导致在体内大量聚集，必然会代谢更多脂类氧化副产物，需要肝脏提高抗氧功能予以消除，同时消耗更多能量与营养储备以维持氧化平衡。作为海水鱼类，银鲳对n-3 LC-PUFA的需求量较高，其含量过低会抑制抗氧化酶的活力，从而影响机体功能。运输胁迫前FO组肝脏SOD和CAT活力均最高，说明其体内氧化和抗氧化的平衡值较高，而4 h运输胁迫后FO组肝脏SOD活力与其他组差异不显著，CAT活力与SO组类似，可能是原来运用维持平衡的抗氧化酶被氧化应激所消耗，说明饲料n-3 LC-PUFA含量偏高同样不利于银鲳机体健康。
本试验中，各组银鲳终末体重如下：FO组，(37.8±3.8) g；FSO组，(39.9±4.0) g；SFO组，(34.6±3.7) g；SO组，(26.6±3.0) g。从上面数据可知SO组体重增长明显低于其他组，可以看出豆油过多替代鱼油会对银鲳生长造成负面影响。
4 结论虽然4 h运输胁迫后各组死亡率差别不大，但结合应激和抗氧化指标，发现SO组银鲳在运输后机体健康情况较差，应激反应较为剧烈，说明投喂过量添加大豆油的饲料不利于银鲳的机体健康和长途运输，而在保持鱼油含量的前提下适当添加大豆油的效果较好。
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