锌是动物体内必需的微量元素之一。作为动物体内300多种酶和蛋白质的必需组分，锌可通过酶催化机制，实现对动物的物质代谢、生长发育、免疫功能以及繁殖性能的调节，在动物体内发挥广泛的生物学功能，被称为机体的“生命元素”^[1]。蛋氨酸锌是由蛋氨酸与无机锌在特定条件下形成的具有独特环状结构的金属螯合物^[2]。研究表明，在蛋鸡饲粮中添加适量的蛋氨酸锌，不仅可以提高蛋鸡产蛋率、改善蛋品质、提高蛋种鸡受精率和孵化率，同时有利于增强机体抗氧化能力、免疫力及抗应激能力^[3-6]。蛋氨酸锌作为一种高效的新型有机微量元素添加剂，是农业部“1224号公告”中允许使用的饲料添加剂^[7]，但其在蛋鸡饲粮中的安全限量值并未给出。因此，本试验旨在通过研究饲粮中添加高剂量蛋氨酸锌对蛋鸡生产性能、血液学指标和脏器组织病理学的影响，以确定蛋鸡对饲粮中蛋氨酸锌的耐受剂量，为科学指导蛋氨酸锌在生产实践中的应用提供参考和理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

蛋氨酸锌：由山东济宁和实生物科技有限公司提供，产品批号2014080701，锌含量≥17.72%，蛋氨酸含量≥79.34%。

1.2 饲养管理

选取采食正常[(89.17±1.27) g/d]、体重相近[(1.36±0.03) kg]、产蛋率一致[(80.23±0.98)%]的健康海兰白蛋鸡540只(20周龄)，采用封闭式鸡舍3层阶梯式笼养，每层5个鸡笼(45 cm×30 cm×30 cm)，每笼养3只鸡，各组的试验鸡保证分布在上、中、下层的数量相等。按照鸡场常规方法进行饲养管理。自由采食，每天08:00和14:30各喂料1次，匀料4次；乳头式饮水器，自由饮水；每周带鸡消毒和清理鸡粪1次。

1.3 试验设计

试验采用单因子试验设计，随机分成6个组，每组6个重复，每个重复15只鸡。在不考虑其他营养素缺乏的情况下，先前大多研究认为40~70 mg/kg的蛋氨酸锌添加量有利于蛋鸡生产性能的提高和蛋品质的改善^[8-11]。根据农业部颁布的《饲粮和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南(试行)》中的有关规定，本试验以蛋氨酸锌的最高有效添加量(70 mg/kg)作为其在蛋鸡饲粮中耐受剂量评定的推荐有效剂量，设置6个试验饲粮组，即不添加蛋氨酸锌组(对照组)、推荐有效剂量组、2倍推荐有效剂量组、5倍推荐有效剂量组、10倍推荐有效剂量组和20倍推荐有效剂量组，即饲粮中蛋氨酸锌添加水平分别为0、70、140、350、700和1 400 mg/kg(以锌计)。试验期为8周。

基础饲粮参照NRC(1994)和《鸡的饲养标准》(NY/T 33—2004)，并结合海兰白蛋鸡饲养手册配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。

1.4 样品采集与制备

在试验第2、4、6和8周末，以重复为单位，随机选取1只蛋鸡，用1支抗凝管和1支促凝管翅静脉分别采血2和5 mL。2 mL全血立即送检，测定血液常规指标；5 mL促凝血于3 000 r/min离心10 min制备血清，上清液分装于1.5 mL Eppendorf管中，-80 ℃保存待用。

试验第8周(27周龄)末，每重复随机选取1只健康、体重相近的蛋鸡，屠宰，剖取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的同一部位，放入装有4%中性甲醛中固定。

1.5 指标测定与方法 1.5.1 生产性能

以重复为单位，每天记录产蛋数(包括软壳蛋、破壳蛋)、蛋重，每周通过减量法计算耗料量，统计日产蛋重、平均蛋重、平均日采食量、产蛋率和料蛋比等生产性能指标。

1.5.2 血液常规指标

采用血细胞计数板法测定全血的白细胞计数、红细胞计数及血小板计数，用高速离心法测定红细胞压积，用紫外分光光度计测定血红蛋白含量。

1.5.3 血清生化指标

采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，利用SpectraMax M5多功能酶标仪测定碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性及总蛋白、白蛋白、尿酸、尿素氮、肌酐、葡萄糖和总胆红素含量。

1.5.4 组织病理学检测

将固定的标本经水洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋等处理后，用德国Leica RM2255石蜡切片机制成6 μm的切片，经苏木精-伊红染色后，在Eclipse 80i显微镜下观察组织病理学形态变化，并用DigiLab Ⅱ-C图像采集系统采集相应的组织切片图像。

1.5.5 基础饲粮中锌含量测定

称取基础饲粮0.5 g置于消化管中，加入6 mL浓硝酸，置于CEM-MARS5微波消解仪中消解，消解完成后于DV4000型精确控温电热消解器中赶酸，冷却后用去离子水定容至100 mL。利用ICE 3000原子吸收光谱仪测定试样中锌含量。

1.6 数据分析

数据经Excel 2007整理后，采用SPSS 18.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行统计分析。用Bonferroni法进行差异显著性检验。试验结果均以平均值表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果及分析 2.1 蛋氨酸锌对蛋鸡生产性能的影响

由表 2可知，饲粮中添加蛋氨酸锌对平均日采食量、平均蛋重均无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，70 mg/kg组、140 mg/kg组日产蛋重和产蛋率显著提高(P<0.05)，料蛋比显著降低(P<0.05)，350 mg/kg组、700 mg/kg组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。与0~700 mg/kg组相比，饲粮中添加1 400 mg/kg蛋氨酸锌极显著降低了日产蛋重和产蛋率(P<0.01)，极显著提高了料蛋比(P<0.01)。

2.2 蛋氨酸锌对蛋鸡血液常规指标的影响

由表 3可知，饲粮中添加蛋氨酸锌对血液中的白细胞计数、红细胞计数、血小板计数、血红蛋白及红细胞压积等各项血液常规指标均无显著影响(P>0.05)。

2.3 蛋氨酸锌对蛋鸡血清生化指标的影响

由表 4可知，与对照组相比，饲粮中添加70~700 mg/kg蛋氨酸锌对蛋鸡血清各项指标无显著影响(P>0.05)，添加1 400 mg/kg蛋氨酸锌极显著提高了蛋鸡血清葡萄糖、尿酸、肌酐、总胆红素含量及谷草转氨酶、碱性磷酸酶活性(P<0.01)。

2.4 蛋氨酸锌对主要脏器组织病理变化的影响

组织病理切片(图 1)观察结果如下。

心脏：A、B、C、D和E组心脏组织结构正常，心肌排列整齐，心肌细胞为短圆柱状，细胞核位于细胞中央、椭圆形或似长方形。但F组有2例出现心肌排列杂乱、断裂，肌细胞坏死、细胞核消失，局部有明显的炎性细胞浸润。

肝脏：A、B、C、D和E组肝脏组织结构正常，以中央静脉为中心，肝细胞作辐射状排列形成肝小管，肝小管中央有胆小管，肝小管之间的间隙可见肝血窦；肝细胞呈锥体形，细胞核大而圆。但F组有3例出现肝细胞轻度肿胀，偶见肝细胞发生脂肪变性，可见汇管区附近有大量肝细胞坏死，且有团块状炎性细胞浸润。

脾脏：各组脾脏组织结构清晰正常，脾脏实质由白髓和红髓组成，小动脉有动脉周围淋巴鞘围绕，可见脾小结、条索状的脾索和通连成网的脾血窦。

肺脏：A组肺脏组织结构正常，肺脏实质由初级支气管、次级支气管、三级支气管、肺房和肺毛细血管组成，可见三级支气管与其周围的肺房组成肺小叶。B、C、D、E组与A组结果基本一致。但F组有2例出现肺间质增生、肺房内有浆液性渗出物，且有大量炎性细胞浸润。

肾脏：A、B、C、D和E组肾脏组织结构正常，肾脏实质由皮质小叶和髓质小叶构成，肾小囊包饶肾小球构成肾小体，肾小管、集合管结构正常。但F组有3例出现肾小球肿胀，局部有明显的炎性细胞浸润。

以上结果表明，饲粮中添加20倍推荐剂量(1 400 mg/kg)的蛋氨酸锌会引起主要脏器组织发生不同程度的损伤和病变。

3 讨 论 3.1 蛋氨酸锌对蛋鸡生产性能的影响

研究表明，蛋鸡饲粮中添加适量锌可避免锌缺乏症，提高蛋鸡生产性能^[12]，但添加过量会引起蛋鸡中毒效应，对产蛋性能造成负面影响^[13-15]。本试验结果显示，饲粮中添加70、140 mg/kg蛋氨酸锌显著提高了蛋鸡日产蛋重和产蛋率，显著降低了料蛋比，添加350、700 mg/kg蛋氨酸锌对蛋鸡生产性能无显著影响，但当饲粮中添加蛋氨酸锌达1 400 mg/kg时，极显著降低了蛋鸡日产蛋重和产蛋率，极显著提高了料蛋比。杨自军等^[13]研究表明，蛋鸡饲粮中添加4 000 mg/kg硫酸锌显著降低了蛋鸡产蛋率，提高了料蛋比。王安等^[14]研究发现，蛋鸡饲粮中添加3 000 mg/kg硫酸锌显著降低了蛋鸡产蛋率，降低了饲料转化率。本试验中对蛋鸡生产性能造成负面影响的锌剂量远低于上述报道的锌剂量，原因是与无机锌相比，蛋氨酸锌生物学利用率高，因而较低的锌水平即可引起毒性效应。此外，过量锌的添加不仅会对饲粮中其他养分的吸收利用起到拮抗效应^[16-17]，而且会使参与体内养分代谢的锌依赖酶构象发生异常，导致酶活性降低或丧失，从而降低碳水化合物、蛋白质、脂质等养分利用率，最终导致生产性能的下降^[18-19]。另外，Schutte等^[20]、姜元海^[21]研究报道，饲粮中添加过量蛋氨酸会导致蛋鸡饲料转化率、产蛋量降低。本研究中最高剂量(1 400 mg/kg)组饲粮中蛋氨酸水平为1.02%，高剂量的蛋氨酸可能会引起饲粮中氨基酸的不平衡，导致氨基酸之间的拮抗作用^[22]，从而降低饲粮养分利用率，最终造成生产性能下降。因而，蛋鸡生产性能的下降可能是高剂量锌和高剂量蛋氨酸共同作用的结果。

3.2 蛋氨酸锌对蛋鸡血液学指标的影响

研究表明，锌在动物血液循环及物质代谢中发挥着重要作用，尽管动物对锌的耐受性很高，但是超过一定限度，仍会引起机体锌中毒，打破机体内稳态，对血液循环、物质代谢产生负面影响^[23-24]。本试验表明，饲粮中添加蛋氨酸锌对蛋鸡血液常规指标无显著影响，说明在本试验条件下，饲粮中添加不高于1 400 mg/kg的蛋氨酸锌不会对蛋鸡血液常规指标造成负面影响。

血清生化指标是评价动物机体代谢情况及健康状况的重要指标。崔恒敏等^[25]研究报道，1 400 mg/kg硫酸锌可引起肉鸡血清谷丙转氨酶活性显著提高。Wang等^[26]研究发现，5 000 mg/kg纳米锌会引起小鼠血清碱性磷酸酶、谷丙转氨酶活性显著升高。本试验结果显示，饲粮中添加70~700 mg/kg蛋氨酸锌对蛋鸡血清生化指标无显著影响，但添加1 400 mg/kg蛋氨酸锌极显著提高了血清葡萄糖、尿酸、肌酐、总胆红素含量及碱性磷酸酶、谷丙转氨酶活性。此结果说明，饲粮中添加1 400 mg/kg蛋氨酸锌会对蛋鸡肝脏、肾脏等脏器功能及血糖等代谢产生负面影响。究其原因，可能是：1)过量的锌在肝脏沉积，造成肝细胞坏死，致使原本主要存在肝细胞浆内的转氨酶、碱性磷酸酶等大量释放到血清中，同时病变的肝脏也无法及时处理血清中的胆红素，造成血清中胆红素升高^[27]；2)过量的锌在肾脏沉积，使得肾脏发生病变，受损的肾脏也无法及时滤过清除血清中的尿酸和肌酐，因而血清中尿酸和肌酐含量升高^[28]；3)过量的锌可能会使胰岛素分子构象发生变化，分子折叠发生异常^[29-30]，因而无法发挥降低血糖的功能，从而造成蛋鸡血糖升高。

3.3 蛋氨酸锌对主要脏器组织病理变化的影响

病理切片是评价动物健康状况、诊断疾病的辅助性手段，目前将其用作饲料添加剂安全性评价的重要指标。饲粮中添加过量的锌会引起家禽中毒，对家禽器官组织造成不同程度的损伤与病变^[16-17]。Gasaway等^[31]研究发现，3 000 mg/kg碳酸锌可引起绿头鸭肝脏发生局灶性坏死病变，变为沙黄色。杨自军等^[13]研究报道，4 000 mg/kg硫酸锌可使蛋鸡肝脏淤血、肾脏坏死变性。赵翠燕等^[32]研究报道，2 400 mg/kg硫酸锌可引起艾维茵肉鸡心脏、肝脏发生损伤。本试验表明，饲粮中添加70~700 mg/kg蛋氨酸锌对蛋鸡主要脏器组织无显著影响，而添加1 400 mg/kg的蛋氨酸锌会引起蛋鸡心脏、肝脏、肺脏和肾脏发生不同程度的病变和损伤，此结果与蛋鸡生产性能、血清生化指标结果相一致。锌致毒水平的差异主要与受试锌制剂的类型、剂型、受试动物品种、生理阶段等不同有关。高剂量锌引起动物中毒的机理尚不清楚，有学者认为是锌的直接毒性作用致使膜性结构的脂质双分子层稳定性和糖蛋白含量发生变化、含锌酶构象发生改变、线粒体嵴破坏，从而引起细胞损伤或坏死^[16-17]；也有学者认为是高锌拮抗了其他矿物元素的吸收利用，从而引起间接毒性作用^[33-34]。

4 结 论

饲粮中添加70~700 mg/kg的蛋氨酸锌对蛋鸡生产性能、血液学指标以及主要器官组织无负面影响，但当添加水平达到推荐有效剂量的20倍(1 400 mg/kg)会影响蛋鸡生产性能、血清生化等部分指标，并致使主要内脏器官组织发生损伤和病变。综上所述，在本试验条件下，蛋鸡对玉米-豆粕型饲粮中蛋氨酸锌的耐受剂量为700 mg/kg。