2. 中国科学院环江喀斯特农业生态实验站, 香猪研究中心, 环江 547100
2. Research Center of Mini-Pig, Huanjiang Observation and Research Station for Karst Ecosystems, Chinese Academy of Sciences, Huanjiang 547100, China
在规模化养猪生产中，遗传、营养、环境和疾病等因素均可导致胎儿的死亡，且营养因素是其中非常重要的影响因素之一[1]。母体营养可通过调控母-胎界面的结构和胎盘的功能，影响胎儿的生长发育[2]。胎盘是连接母体和胎儿的器官[3]，母体通过胎盘血管与胎儿进行营养物质的交换，胎盘运输营养物质的能力与其血管的密度、通透性及大小密切相关[4]，充足的营养和丰富的血液循环是胎儿健康生长发育的前提。胎盘血管新生受阻与低初生重胎儿的发生密切相关[5]。低初生重可降低新生动物成活率，对后代的生长发育和繁殖性能等存在长期的负面影响，给畜牧业带来巨大损失。所以，研究胎盘血管的发育机制对提高母猪胎儿存活率、促进胎儿的生长发育具有重要意义。现有研究表明，妊娠期母体蛋白质和能量摄入不足及蛋白质和能量严重不平衡均可阻滞胎儿的生长发育，导致低初生重胎儿的发生[6]。营养调控是改善低初生重新生仔猪器官发育以及提高其出生后生长速度的重要手段[7]。例如，母猪饲粮中添加精氨酸可刺激胎盘一氧化氮(NO)的生成，有效缓解低初生重胎儿的发生[8]；饲粮中添加甘油三丁酸酯可改善低初生重仔猪的代谢效率，改善哺乳期低初生重仔猪的生长发育[9]；饲粮中添加亮氨酸可减少低初生重仔猪的肌肉萎缩[10]。营养素对机体生长发育的影响归根结底是调控相关基因表达的结果[11]。笔者前期研究发现，不同氮能比饲粮虽然对不同妊娠期环江香猪的胎儿数、窝重、胎儿个体重及母体成分无显著影响，但高氮能比饲粮可在一定程度上改善机体代谢，促进母体的生长发育[12]。高氮能比饲粮是否影响胎盘及脐带血管相关基因的表达尚不清楚。环江香猪是广西优良的地方猪品种之一，其饲养管理较为粗放，饲粮以青饲料为主，饲粮的营养成分不够全面，导致猪只生长缓慢[13]。因此，改善饲粮组成、促进母猪胎盘血管发育，是提高环江香猪产仔数和成活率的前提，同时对预防低初生重胎儿的发生具有重要参考价值。本试验以低氮能比饲粮为对照，研究高氮能比饲粮对妊娠环江香猪脐带血管发育相关基因表达的影响，并比较不同标准体重胎猪脐带中上述基因表达的差异，为低初生重胎儿的防治提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物、分组和饲养管理试验选用初次妊娠的环江香猪48头，根据体重随机分为2组，每组8个重复(栏)，每个重复3头猪。配种后称量每头母猪的空腹体重，分别饲喂高氮能比饲粮[消化能(DE)为14.73 MJ/kg，粗蛋白质(CP)含量为13.11%，氮能比为0.89]和低氮能比饲粮(DE为12.24 MJ/kg，CP含量为9.77%，氮能比为0.80)。高氮能比饲粮参照NRC(1998)饲养标准对能量、蛋白质和粗纤维的推荐需要量配制，为高能、高蛋白质、低纤维饲粮；低氮能比饲粮参照中国地方猪对能量、蛋白质和粗纤维需要量的饲养标准配制，为低能、低蛋白质、高纤维饲粮。试验饲粮组成及营养水平见表 1。2种试验饲粮的氮能比分别为0.89和0.80，其中使用的1%预混料相同，均参照NRC(1998)饲养标准的推荐需要量。整个试验期间，每日每栏母猪的总采食量为3头母猪总体重的2.5%。每日08:30和17:00各饲喂1次，自由饮水；所有试验猪按猪场饲养管理计划进行常规免疫和管理。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
根据Johnston等[14]的报道，妊娠母猪的妊娠期可分为前期(1~30 d)、中期(30~75 d)和后期(75 d~分娩)。但由于环江香猪为小型猪品种，为了便于分析妊娠早期孕体的生长发育，本试验分别于妊娠45(前期)、75(中期)和110 d(后期)，每重复随机取1头母猪，每个组共取8头母猪，心脏放血处死后屠宰，收集每窝胎猪并称重，选取每窝中最大体重、平均体重和最小体重胎猪(每窝共取3头)对应的脐带，液氮速冻后-80 ℃保存，测定血管发育相关基因的表达量。
1.3 总RNA提取与反转录按试剂盒说明采用Trizol法提取脐带总RNA。利用Nanodrop 2000分光光度计(Nano-drop Technologies,Wilmington,DE)测定RNA的浓度与纯度，吸光度(OD)260/280在1.8~2.2之间较为理想。利用TaKaRa RR036TA反转录试剂盒进行反转录，合成第1链cDNA，置于-20 ℃保存。
1.4 基因表达量检测采用Premier 5.0软件设计目标基因引物序列，送上海生工生物工程股份有限公司合成。目标基因及其引物序列如下。成纤维细胞生长因子(FGF)：F:5′-TCAAAGGAGTGTGTGCGAAC-3′，R:5′-CAGGGCCACATACCAACTG-3′；血管内皮生长因子(VEGF)：F:5′-CCTGATGCGGTGCGGGGGCT-3′，R:5′-TGGTGGTGGCGGCGGCTATG-3′；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)：F:5′-TACGTTGGAGCAATCCCTGT-3′，R:5′-TACACTTTCGATGCCAAG-3′；内皮型一氧化氮合酶(eNOS)：F:5′-ATGAAGCACCTGGAGAACGA-3′，F:5′-ATGAAGCACCTGGAGAACGA-3′。按下述反应条件在ABI7 900HT型实时荧光定量(RT)-PCR仪上进行扩增，检测样品中目标基因的转录情况。PCR反应体系为10 μL，包括：5.0 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，0.4μL上、下游引物(10 μmol/L)，2 μL cDNA模板，dd H2O补齐至10 μL。PCR反应程序为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40个循环。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参，用Applied Biosystem SDS 2.3软件进行数据分析。采用2-ΔΔCT方法处理数据，待测基因的表达量计算公式为：
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利用SPSS 18.0软件对同一妊娠期、同一体重、不同饲粮组间的数据进行独立样本t检验；同一饲粮组和标准体重、不同妊娠期，同一饲粮组和妊娠期、不同标准体重的数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA,LSD)。数据以“平均值±标准误”表示。P<0.05表示差异显著，0.05≤P<0.10表示有变化趋势。
2 结 果 2.1 不同氮能比饲粮对妊娠环江香猪脐带血管FGF基因表达量的影响由表 2可知，与低氮能比饲粮组相比，高氮能比饲粮组妊娠110 d的最大体重、平均体重胎猪的脐带血管FGF基因表达量均显著升高(P<0.05)；高氮能比饲粮组妊娠45 d最大体重胎猪的脐带血管FGF基因表达量显著高于其他2个标准体重组(P<0.05)。
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表 2 不同氮能比饲粮对妊娠环江香猪脐带血管FGF基因表达量的影响 Table 2 Effects of different nitrogen/energy diets on umbilical vessel FGF gene expression level of pregnant Huanjiang mini-pigs (n=8) |
由表 3可知，与低氮能比饲粮组相比，高氮能比饲粮组妊娠45、75 d的最大体重和平均体重胎猪以及妊娠110 d的平均体重和最小体重胎猪的脐带血管VEGF基因表达量显著升高(P<0.05)，妊娠110 d最大体重胎猪的脐带血管VEGF基因表达量呈升高趋势(P=0.087)；高氮能比饲粮组妊娠45、75和110 d最大体重胎猪，妊娠75 d最小体重胎猪和妊娠110 d平均体重胎猪的脐带血管VEGFR2基因表达量显著升高(P<0.05)。随着妊娠时间的延长，低氮能比饲粮组妊娠45 d最大体重胎猪的脐带血管VEGF基因表达量显著高于妊娠110 d(P<0.05)，最小体重胎猪的脐带血管VEGF基因表达量显著高于妊娠75和110 d(P<0.05)；低氮能比饲粮组最小体重胎猪的脐带血管VEGFR2基因表达量先显著升高后显著降低(P<0.05)。低氮能比饲粮组不同体重间比较，妊娠75 d最大体重胎猪的脐带血管VEGFR2基因表达量显著低于平均体重和最小体重胎猪(P<0.05)。
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表 3 不同氮能比饲粮对妊娠环江香猪脐带血管VEGF和VEGFR2基因表达量的影响 Table 3 Effects of different nitrogen/energy diets on umbilical vessel VEGF and VEGFR2 gene expression levels of pregnant Huanjiang mini-pigs (n=8) |
由表 4可知，与低氮能比饲粮组相比，高氮能比饲粮组妊娠75 d最大体重、平均体重胎猪和妊娠110 d最大体重、最小体重胎猪的脐带血管eNOS基因表达量均显著升高(P<0.05)；妊娠45 d最大体重(P=0.052)、平均体重(P=0.065)和最小体重胎猪(P=0.057)的脐带血管eNOS基因表达量有升高趋势。随妊娠期的延长，高氮能比饲粮组最大体重胎猪的脐带血管eNOS基因表达量呈先升高后降低的趋势(P=0.055)。
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表 4 不同氮能比饲粮对妊娠环江香猪脐带血管eNOS基因表达量的影响 Table 4 Effects of different nitrogen/energy diets on umbilical vessel eNOS gene expression level of pregnant Huanjiang mini-pigs (n=8) |
FGF可以刺激子宫动脉和胎儿胎盘动脉内皮细胞的增殖，胚泡中碱性FGF可能对子宫内膜的血管生成反应有放大作用，可诱导中胚层细胞分化为成血管细胞[15]。FGF也可直接作用于血管细胞，诱导血管内皮细胞生长，促进血管形成[16]。发育良好的胎盘血管密度大，运输氧气和营养物质能力较强，胎儿体重就较大[17]。本试验结果表明，高氮能比饲粮可显著上调FGF基因的表达量，进而影响血管发育和妊娠后期胎儿的生长发育。
VEGF作为主要的促血管生长因子，可促进血管内皮细胞的分裂和迁移，增强毛细血管的通透性[18]，调控血管生成和血管新生的进程，在血管的形成中发挥重要的作用[19]。血管发育过程中，VEGF主要通过血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和VEGFR2发挥其生物学作用，且VEGFR2是VEGF的主要受体，可促进血管发育[20]。Chen等[21]研究表明，宫内生长迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)动物胎盘中VEGF基因的表达量降低。本试验结果表明，与低氮能比饲粮组相比，高氮能比饲粮组可显著上调VEGF和VEGFR2基因的表达量，从而促进血管的发育，增加胎盘和脐带血的血流量；随着妊娠期的延长，低氮能比饲粮组妊娠45 d体重最大体重和最小体重胎猪的脐带血管VEGF基因表达量最高，与前人报道的妊娠早期血管就开始发育一致[22]。一般认为，到妊娠中期胎盘血管网的发育就基本成熟。本研究中，妊娠75 d时，低氮能比饲粮组最小体重胎猪的脐带血管VEGFR2基因表达量最高，平均体重和最小体重胎猪的脐带血管VEGFR2基因表达量均显著高于最大体重胎猪，这可能是由于妊娠中期平均体重和最小体重胎猪为了维持自身的生长发育，仍需要更多的血管生成。
eNOS对于调控血管的功能具有重要作用[23]。在生理状态下，由eNOS合成的NO具有松弛平滑肌细胞、促进血管生长等作用[24]。本试验中，高氮能比饲粮可显著上调胎猪的脐带血管eNOS基因的表达量，增加NO生成，进而促进血管发育。VEGF通过增加NO的量诱导血管的生成，促进血液循环[25]。NOS是血管系统NO的主要来源，且VEGF可通过激活VEGFR2增加eNOS基因的表达量[5]。本研究中，最大体重胎猪妊娠后期的脐带血管eNOS与VEGF、VEGFR2基因的表达量变化相一致，说明eNOS产生的NO可能参与了VEGF的促血管生成作用。
本研究采用的高氮能比饲粮中粗蛋白质、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸+半胱氨酸(Met+Cys)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)的含量比低氮能比饲粮分别高了34.19%、33.73%、25.00%、30.00%、38.46%、114.81%、80.00%、100.00%、55.36%、87.50%、75.00%、84.62%、37.50%、60.16%、59.26%和68.42%。高氮能比饲粮可显著上调胎猪的脐带血管FGF、VEGF、VEGFR2和eNOS基因的表达量，这与其中含有较高含量的氨基酸有关。例如，Arg可作为合成血管发育相关因子的底物，从而有利于胎儿的血管发育。Wu等[26]研究表明，在饲粮中添加Arg可上调胎盘血管VEGF和eNOS基因的表达量，从而改善胎盘血管的功能，促进胎儿的生长发育；刘俊峰等[8]研究发现，饲粮中添加Arg可显著促进胎盘中总一氧化氮合酶(TNOS)和原生型一氧化氮合酶(cNOS)的活性。因此，与低氮能比饲粮相比，高氮能比饲粮含有足够的功能性氨基酸以满足胎盘血管发育的需要。
4 结 论高氮能比饲粮可显著上调妊娠环江香猪胎猪脐带血管发育相关基因的表达量，有利于胎猪脐带血管的发育，这与其中蛋白质和氨基酸含量较高有关；不同妊娠期或同一妊娠期不同标准体重胎猪的脐带血管发育相关基因的表达量存在差异，这可能与低初生重胎儿的发生有关。
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