2. 泰山医学院基础医学部, 泰安 271000
2. Department of Basic Medicine, Taishan Medical College, Taian 271000, China
胰岛素是糖代谢的核心物质，可以严格控制葡萄糖的利用[1]。起初的研究认为，鱼类对高碳水化合物的低效利用是由于血清中低含量的内源性胰岛素所致[2-4]。但随着胰岛素放射免疫测定方法的发展，越来越多的试验结果表明鱼类血清中胰岛素含量相似于甚至高于哺乳类动物[5-6]。有研究表明，罗非鱼胰岛素mRNA在胰岛β细胞的基础表达量是哺乳动物相应表达量的3.7倍[7]。胰岛素是依靠与细胞表面特定受体接触而发挥作用的，胰岛素与其受体之间形成二硫键，促使胰岛素发挥最大效能[8]。对于鸟类和哺乳动物而言，胰岛素受体能够介导胰岛素对脂肪合成和葡萄糖摄取的作用[9]，于是，人们进行了胰岛素受体数量及受体与胰岛素亲和力的探讨[10]。胰岛素受体的研究多集中在哺乳动物，而在鱼类上的相关研究[11-13]很少。目前已检测到多种鱼类组织中表达胰岛素受体，包括肝脏、骨骼肌、心脏和脂肪组织[13-17]。罗非鱼外周组织(如骨骼肌)也拥有功能性胰岛素受体[17-18]。但目前有关鱼类胰岛素受体数量的研究表明，鱼类胰岛素受体数量较哺乳动物少得多[19]。Ablett等[20]认为高糖能促进胰岛素受体数量的增多，也就是说饲料糖水平低，被激活的胰岛素受体数量就少。胰岛素受体数量不足也可能是鱼类对糖利用能力较低的原因之一。Mommsen等[21]根据前人研究结果进行推断，鱼类对葡萄糖的低耐受性可能是由于鱼体中胰岛素与受体的交互作用不同于哺乳动物的互作系统所致。Ablett等[20]引进了另一种方法研究胰岛素的分泌，研究人员测定了标记胰岛素与肝细胞、肌细胞膜上受体的结合，发现虹鳟胰岛素受体数量与胰岛素含量之间有一定相关性。研究发现，虹鳟心肌中胰岛素受体数量与激素含量成反比[22]，而在脂肪组织、骨骼肌和肝脏中的情况正好相反[23-24]。Planas等[25]认为胰岛素受体数量与激素含量之间的关系可能与组织的功能特征有关。本试验选择尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)作为试验对象，测定其在注射葡萄糖后血浆葡萄糖和胰岛素含量的变化，并以胰岛素受体-1(IR-1)作为研究对象，探讨IR-1在尼罗罗非鱼不同组织中的表达及其对注射葡萄糖的响应，为罗非鱼葡萄糖代谢机理提供一定的理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂试验用尼罗罗非鱼购于当地尼罗罗非鱼养殖场，在山东农业大学水产养殖基地暂养2周后，挑选健康、规格整齐、平均体重为100 g左右的鱼作为试验用鱼。试验用葡萄糖购于上海索莱宝生物科技有限公司，将葡萄糖溶于无菌蒸馏水中配制成30 mg/mL的针剂，置于4 ℃冰箱保存备用。
1.2 试验设计将160尾尼罗罗非鱼随机分配到8个水族箱(水族箱水容量为0.4 m3)中，对照组、试验组各设4个重复，每个水族箱为1个重复，每个水族箱投放罗非鱼20尾。试验鱼饲喂常规的尼罗罗非鱼基础饲料，其组成及营养水平见表 1。试验开始时先将2组鱼分别禁食24 h，用MS-222(每1 m3水20 g)麻醉鱼体后，试验组依照每100 g体重30 mg的剂量腹腔注射葡萄糖[26]，对照组以相同的剂量腹腔注射0.7%的无菌生理盐水。在注射前(0 h)和注射后的1、3、6和12 h分别进行采样。每个水族箱每次取样4尾，同样用MS-222麻醉鱼体后，尾静脉采血，血样用肝素抗凝，在4 ℃下3 000 r/min离心10 min制备血浆，将血浆移入冻存管存于液氮中备用。每次采完血的尼罗罗非鱼，取其肝胰脏、心脏和背部肌肉，并冻存于液氮中备用。
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表 1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
血浆中葡萄糖含量在美国贝克曼Cx-4型自动生化分析仪上测定。胰岛素含量使用R&D Systems公司提供的鱼胰岛素测定试剂盒，采用固相夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)测定吸光度(OD)值，由试剂盒中标准物的胰岛素含量与OD值得出标准曲线的回归方程，将样品中胰岛素的OD值代入方程，计算出样品中胰岛素的含量，若是稀释后的样品，再乘以稀释倍数即为样品中胰岛素的实际含量。
1.3.2 IR-1的cDNA克隆和序列分析取50～100 mg尼罗罗非鱼肌肉组织，加液氮研磨至粉末状，参照Trizol Reagent(Invitrogen公司)说明书的步骤提取总RNA，然后再用该公司提供的DNase Ⅰ进行纯化，纯化后的RNA在TaKaRa公司提供的反转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase)的作用下进行反转录，参照美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站公布的虹鳟(GenBank登录号:AF062496.1)、比目鱼(GenBank登录号:AB065096.1)、金鱼(GenBank登录号:AF218355.1)和银鲑鱼(GenBank登录号:AF021040.1)的基因序列设计引物1和2(表 2)；使用天根公司提供的PCR(2×Taq PCR)试剂盒，克隆获得尼罗罗非鱼IR-1的序列片段，反应条件为：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×35个循环，72 ℃ 5 min，而后使用MBI公司生产的pTZ-57R/T载体连接试剂盒，将所得片段连入pTZ-57R/T载体，连接产物转化感受态大肠杆菌(E. coli)DH 5α，培养菌液，将鉴定好的菌液寄往北京天根生物工程公司测序。之后根据获得的片段序列设计引物3与锚定引物BRL-A2进行PCR扩增获得IR-1的3′端序列，同时根据获得的片段序列设计引物6与锚定引物SmartP1进行PCR扩增获得IR-1的5′端序列，反应条件均为：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×35个循环，72 ℃ 5 min，同样将所得片段连入pTZ-57R/T载体，培养菌液后测序。使用DNAMAN软件对获得的序列进行比对和分析，进化树由MEGA 5.0软件设计而成。
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表 2 cDNA克隆和PCR引物序列 Table 2 Sequences of primers used in cDNA cloning and PCR |
采取饲喂常规饲料的尼罗罗非鱼的肌肉、肝脏和心脏，参照Trizol Reagent(Invitrogen)说明书的步骤，分别从这3种组织中提取总RNA后进行反转录，而后使用天根公司提供的2×Taq PCR反应液进行半定量PCR检测，根据本试验克隆获得的IR-1(GenBank登录号：JN967750)序列设计引物7和8(表 2)用于IR-1表达的检测，PCR反应条件均为：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×36个循环，72 ℃ 5 min。同样，参照NCBI网站公布的罗非鱼β-肌动蛋白(β-actin)(GenBank登录号:EF026001.1)序列设计引物11和12(表 2)用于β-actin表达的检测，PCR反应条件为：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×32个循环，72 ℃ 5 min。最后，通过0.8% 琼脂糖凝胶电泳，使用Bio-Rad全自动凝胶成像系统进行照相，测定各组织中各基因的相对表达量。
1.3.4 实时荧光定量PCR检测IR-1的表达取1 μg总RNA，参照TaKaRa公司反转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase)的说明书合成cDNA第1链，然后置于-20 ℃保存。采用SYBR Green Ⅰ荧光染料在7500 Real Time PCR System (Bio-Rad)上进行PCR扩增，分别检测注射葡萄糖后1、3、6和12 h时IR-1在肌肉、心脏和肝脏中的mRNA相对表达量。
在8联管(Axygen)中分装以下反应体系：10 μL 2×SYBR® Premix Ex TaqTM，0.4 μL 50×ROX Reference Dye Ⅱ(TaKaRa)，6.8 μL dH2O，正、反向引物(10 μmol/mL)各0.4 μL，模板cDNA 2 μL。阴性对照则以等量RNase-free水代替，补充RNase-free水至20 μL。根据本试验克隆获得的IR-1(GenBank登录号：JN967750)序列设计引物9和10(表 2)用于IR-1 mRNA相对表达量的检测，PCR反应条件为：94 ℃ 30 s，(94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)×40个循环，最后在55~95 ℃制作熔解曲线。反应完成后，用ABI 7500 System分析软件分析结果。
1.4 数据统计与分析试验数据用平均值±标准差表示。目的基因的mRNA相对表达量以尼罗罗非鱼β-actin为内参，以对照组的基因mRNA表达量为基准，应用2△△Ct方法计算肌肉、肝脏和心脏中IR-1 mRNA的相对表达量。采用SPSS 13.0软件进行数据处理和分析，先对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若组间差异显著，再用Duncan氏法进行多重比较，以P<0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 注射葡萄糖后尼罗罗非鱼血浆葡萄糖和胰岛素含量的变化从图 1可以看出，与注射前(0 h)相比，试验组尼罗罗非鱼在注射葡萄糖1 h后血浆葡萄糖含量达到最高，并显著高于对照组(P<0.05)，而后开始下降，6 h后恢复到正常水平。从图 2可以看出，试验组血浆胰岛素含量在注射葡萄糖3 h后达到最高，并显著高于对照组(P<0.05)，而后开始下降，在12 h后降低至接近正常水平。
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同一时间点数据点标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。 Data points with different small letters mean significant difference (P<0.05),while with the same small letters mean no significant difference (P>0.05). The same as below. 图 1 注射葡萄糖后尼罗罗非鱼血浆葡萄糖含量的变化 Figure 1 Changes of plasma glucose content of Nile tilapia after glucose injection |
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图 2 注射葡萄糖后尼罗罗非鱼血浆胰岛素含量的变化 Figure 2 Changes of plasma insulin content of Nile tilapia after glucose injection |
通过PCR扩增克隆获得了尼罗罗非鱼IR-1的部分cDNA序列(GenBank登录号：JN967750)，经琼脂糖凝胶电泳检测这一序列片段大小为1 979 bp，由548个氨基酸组成(图 3)，与所预测的片段大小基本一致。将鉴定好的菌液寄往北京天根生物工程公司测序，用DNAMAN软件将所得片段序列与来源于其他动物的同源序列进行序列比较，发现该片段为所要克隆的目的基因的序列片段。
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Flounder:比目鱼；Tilapia:罗非鱼；Trout:鳟鱼；Turbot:大菱鲆。 图中每个字母代表着一种氨基酸，氨基酸的缺口使用“-”代替，完全相同氨基酸的位置使用“*”进行标示，有2~3个氨基酸相同的位置使用“.”进行标示，预测获得的跨膜螺旋体相近的位置进行下划线标示，具有IR-1的高度保守残基的序列使用灰色进行强调。 The single-letter code is used for the amino acids. Gaps in the amino acid sequences are indicated with a dash (-). The positions where have the same amino acid are indicated with asterisks (*),and positions where have 2 to 3 the same amino acids are indicated with a dot (.). The underlined sequences indicate the approximate positions of the predicted membrane-spanning helices. Residues that are highly conserved in all IR-1s are highlighted in gray. 图 3 尼罗罗非鱼与其他鱼类IR-1氨基酸序列的比对结果 Figure 3 Alignment result of IR-1 amino acid sequences between Nile tilapia and other fish species |
通过与其他鱼类比对可以看出，尼罗罗非鱼的IR-1的氨基酸序列具有很高的保守性，具有胰岛素受体的特征性序列(图 3)，并具有丰富的酪氨酸激酶特征性序列。在系统发育学上，与其他脊椎动物的胰岛素受体相比较(图 4)，可以看出，尼罗罗非鱼的IR-1和其他的脊椎动物的胰岛素受体在同一簇上，这些脊椎动物包括比目鱼和大菱鲆，而与其他脊椎动物的非IR-1胰岛素受体类型不在同一簇上；此外，鱼类的胰岛素受体分布在一个簇上，哺乳动物的胰岛素受体分布在一个簇上。
在氨基酸水平上，尼罗罗非鱼的IR-1与比目鱼和大菱鲆的IR-1同源性非常高，分别达到89.9%和89.1%，与尼罗罗非鱼胰岛素受体-2(IR-2)的同源性为73.0%，与哺乳动物胰岛素受体的同源性在66.7%～68.8%(表 3)。通过比较鉴定可以得出，罗非鱼IR-1具有第1类别胰岛素受体的保守序列，同时具有胰岛素受体的特征性序列。
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尼罗罗非鱼IR-1与其他脊椎动物胰岛素受体蛋白质序列的系统发育树。A phylogenetic tree of the protein sequences of Nile tilapia IR-1 with IRs from other vertebrates. 从GenBank获得的序列登录号如下Sequence accession numbers were obtained from GenBank as follows：Salmon 1 鲑鱼 IR-1，AAB94065；Salmon 2 鲑鱼IR-2，AAB94066；Salmon 3 鲑鱼IR-3，AAB94067；Salmon 4 鲑鱼IR-4 AAB94068；Trout 1 鳟鱼IR-1，AAC16490；Trout 2 鳟鱼IR-2，ACN85415；Trout 3 鳟鱼IR-3，AAC16492；Trout 4鳟鱼IR-4 AAC16491；Goldfish 1 金鱼IR-1，AAF32316；Goldfish 2 金鱼IR-2，AAG48323；Flounder 1 比目鱼IR-1，BAB83667；Flounder 2 比目鱼IR-2，BAB83668；Zebrafish 1 斑马鱼IR-1，NP_001136144；Zebrafish 2 斑马鱼IR-2，NP_001116701；Tilapia 2 罗非鱼IR-2，XP_003448585；Human 1 人IR-1，NP_000199；Human 2 人IR-2，NP_001073285； Cattle 牛IR，XP_002688878；Rat 鼠IR，NP_058767；Pig 猪IR，XP_003123202；Chicken 鸡IR，AAD26153；Frog 青蛙IR，NP_001081702。 图 4 不同来源IR-1的聚类分析 Figure 4 Cluster analysis of IR-1 from different sources |
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表 3 在核苷酸和氨基酸水平上IR-1与其他物种的同源性比较 Table 3 Homologous comparison of IR-1 between Nile tilapia and other animal species on nucleotide and amino acid levels |
从在23～25 ℃的水温中饲养、饲喂常规饲料的尼罗罗非鱼中采取肌肉、肝脏和心脏，而后分别提取总RNA，反转录后通过半定量PCR检测和比较IR-1在这3种组织的表达量，结果(图 5)显示，IR-1在尼罗罗非鱼的肌肉、心脏和肝脏中均有很高的表达量，由此可以得出尼罗罗非鱼的肌肉、心脏和肝脏中都有胰岛素受体的存在，并且对尼罗罗非鱼注射葡萄糖6 h后3个组织中IR-1都达到最高表达量，通过后续实时荧光定量PCR的结果来看，IR-1在肝脏和肌肉中的表达量基本一致，而在心脏中的表达量相对较低(图 6)。
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IR-1：胰岛素受体-1 insulin receptor 1；β-actin：β-肌动蛋白；M:肌肉muscle；H:心脏heart；L:肝脏liver。 图 5 尼罗罗非鱼IR-1在不同组织中的表达 Figure 5 Expression of IR-1 from different tissues of Nile tilapia |
通过实时荧光定量PCR检测尼罗罗非鱼注射葡萄糖后12 h内不同组织IR-1 mRNA的相对表达量的变化。试验结果(图 6)显示，试验组肌肉中IR-1 mRNA的相对表达量在注射葡萄糖后3 h时有所升高，在6 h时达到最高水平，与对照组差异显著(P<0.05)；与对照组相比，试验组心脏中IR-1 mRNA的相对表达量在注射葡萄糖后的12 h内没有表现出显著性的变化(P>0.05)，但是随时间的延长呈现出了先上升后下降的趋势，在6 h时达到最高水平；试验组肝脏中IR-1 mRNA的相对表达量变化与肌肉中十分相似，即在注射葡萄糖后3 h时有所升高，在6 h时达到最高水平，与对照组差异显著(P<0.05)。
3 讨 论 3.1 尼罗罗非鱼IR-1的基因序列分析从序列、系统发生学和组织分布来分析，本试验所克隆获得的基因片段属于胰岛素受体家族中的IR-1。尼罗罗非鱼的IR-1在序列和结构上与其他鱼类的IR-1十分相似，其与哺乳动物胰岛素受体的同源性在66.7%～68.8%，与其他鱼类胰岛素受体的同源性在45.3%~89.9%。通过对蛋白质序列分析的结果可以看出，与其他鱼类相比，尼罗罗非鱼的IR-1的氨基酸序列具有很高的保守性，并且胰岛素受体的酪氨酸激酶位点十分丰富。从氨基酸序列的比对结果来看，除了一少部分的氨基酸替代外，本试验从尼罗罗非鱼肌肉中克隆获得的序列具备了IR-1的普遍特征。鱼类胰岛素受体在进化上的这种主要结构的保守性表明，这种高选择压力下的高保守性可能源于需要保持胰岛素受体的一般特征和其信号的传导功能。
本研究利用Chan等[27]克隆大马哈鱼胰岛素受体的引物，获得了2条胰岛素受体的片段，通过序列比对和分析，其中一条与本研究克隆的序列完全相符，而另外一条与Cheng等[28]对莫桑比克罗非鱼克隆的一段胰岛素受体片段(GenBank登录号：AF493794)完全相符。数据显示本试验克隆出的尼罗罗非鱼IR-1与IR-2只有73.0%的同源性，如此低的同源性表明尼罗罗非鱼的胰岛素受体由2个基因来表达，对此本试验可以确定尼罗罗非鱼的胰岛素受体存在着2种亚型。通过氨基酸序列对比发现，IR-1和IR-2与人类胰岛素受体的同源性分别为68.8%和66.1%，表明在进化的过程中胰岛素受体具有很高的保守性。鱼类胰岛素受体在结构和功能上与人类的胰岛素受体十分相似，因此，其研究结果可直接运用到哺乳动物中[29]。
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图 6 注射葡萄糖后尼罗罗非鱼不同组织中IR-1 mRNA的相对表达量变化 Figure 6 Changes of IR-1 mRNA relative expression level in different tissues of Nile tilapia after glucose injection |
胰岛素受体是一种跨膜糖蛋白，具有典型的变构酶性质，广泛分布于全身各组织细胞膜[30]。在哺乳动物上，用于胰岛素调节血糖的外周靶细胞的胰岛素受体主要存在于肌肉和脂肪组织内，然而很少有证据证明在鱼体内也同样如此，但是鱼类(包括尼罗罗非鱼)的肌肉和心脏具有功能性的胰岛素受体，这确是一个不争的事实[31]。Mounier等[32]研究发现，胰岛素受体在哺乳动物的肝脏和脂肪组织中具有很高的表达量，这些组织中的胰岛素受体和胰岛素相互作用，使得葡萄糖维持在一个相对平衡的水平。胰岛素受体在鱼类的各种组织中也都有表达[16]，其中包括肌肉、肝脏、鳃和大脑等组织[33]。本研究结果显示，IR-1在尼罗罗非鱼的肌肉、心脏和肝脏中均有较高的表达量，其中肌肉和肝脏中IR-1的表达量基本一致，而心脏中的表达量相对较低。
3.3 注射葡萄糖对尼罗罗非鱼IR-1表达的影响胰岛素作为体内唯一的降糖激素，它的分泌受血糖水平的调节控制，血糖水平升高即引起胰岛β细胞释放胰岛素入血，到达其主要的靶器官——肝脏、肌肉和脂肪，而胰岛素特异性受体在许多鱼类的肝脏和肌肉中被发现，虽然它们的数量在不同的鱼类中有所差异[34]。Baos等[35]用含有易消化的膨化小麦饲喂虹鳟，结果发现饲喂高糖饲料(37%的膨化小麦)与低糖饲粮(21%的膨化小麦)的虹鳟均表现出较高的生长率，血浆中的葡萄糖和胰岛素含量升高，同时肌肉中胰岛素受体的数量增加。研究表明，长期摄食不同糖水平饲料的鱼类对外源胰岛素敏感性也不同，这可能是因为长期摄食不同糖水平饲料的鱼类被激活的胰岛素受体数量不同的缘故。同时，影响胰岛素受体数量的因素也可以影响胰岛素受体的亲和力，而无论胰岛素受体数量的降低还是亲和力的降低，均可以降低胰岛素与其受体的结合而引起机体葡萄糖含量的升高[36]。蔡春芳等[37]对异育银鲫进行了外源胰岛素敏感性试验，结果表明外源胰岛素具有显著的降血糖作用，异育银鲫对外源胰岛素敏感性强，而且饲料糖水平也影响其敏感性，造成敏感性差异的原因可能与胰岛素受体数量不同有关。不同鱼类胰岛素与其受体的结合力不同，Baos等[35]研究表明，鲤鱼红肌中胰岛素与其受体的结合力大于虹鳟，同时鱼类不同组织中胰岛素与其受体的结合力也不同，心肌胰岛素与其受体的结合力较其他组织高[38]。本研究结果显示，尼罗罗非鱼在注射葡萄糖后的12 h内，心脏中IR-1 mRNA的相对表达量没有发生显著变化，而肌肉和肝脏中IR-1mRNA的相对表达量在注射葡萄糖后6 h时达到最高，12 h时恢复到正常水平。综合以上试验结果，血浆葡萄糖含量在注射葡萄糖后1 h时达到最高，而在高血浆葡萄糖含量的刺激下血浆胰岛素含量却在注射葡萄糖后3 h时达到最高，同时基于胰岛素的压力，肌肉和肝脏中的IR-1表达量增多，但是其表达量在注射葡萄糖后6 h时才达到最高，胰岛素含量及其受体(IR-1)表达量相对于血浆葡萄糖含量的滞后性表明，IR-1在调节尼罗罗非鱼血浆葡萄糖含量上并没有发挥作用，至于胰岛素受体的另一个亚型(IR-2)的作用如何，有待于下一步深入研究。
4 结 论① 克隆获得的尼罗罗非鱼IR-1基因序列具有很高的保守性，并具有丰富的酪氨酸激酶特征性序列。
② IR-1在尼罗罗非鱼肌肉、心脏和肝脏中均有较高的表达量，在肝脏和肌肉中的表达量基本一致，而在心脏中的表达量相对较低。
③ 注射葡萄糖后尼罗罗非鱼肌肉和肝脏中的IR-1 mRNA的相对表达量在注射葡萄糖后6 h时达到最高，12 h时恢复到正常水平。相对于血浆葡萄糖含量，血浆胰岛素含量的升高相对延迟，而肌肉和肝脏中IR-1 mRNA的相对表达量的升高又延迟于胰岛素含量的升高，从而加重了罗非鱼对葡萄糖的代谢负担。
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