2. 湖南农业大学动物科学技术学院, 长沙 410125;
3. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 亚热带农业生态过程重点实验室, 湖南省畜禽健康养殖工程技术中心, 农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站, 长沙 410125;
4. 湖南畜禽安全生产协同创新中心, 长沙 410128
2. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410125, China;
3. Scientific Observing and Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in South-Central of Ministry of Agriculture, Hunan Provincial Engineering Research Center of Healthy Livestock, Key Laboratory of Agri-Ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
4. Hunan Co-Innovation Center of Animal Production Safety, Changsha 410128, China
草地畜牧业一直是西藏的重要经济基础，几十年来一直占农业生产总值的60%左右[1]，而近年来，随着西藏人口增加和畜牧业的进一步发展，传统的单纯依赖天然草地为主的畜牧业生产模式已不能满足牲畜对饲草的要求[2-3]；同时，随着家畜数量的不断增加，草畜之间矛盾也日益突出，生态环境不断恶化，严重影响西藏地区畜牧生产系统的平衡、稳定与发展[4]。西藏地区每年产约70万t农作物秸秆，青稞秸秆是西藏主要的农作物秸秆资源之一。据统计，全区仅青稞秸秆年产量就达约40万t，其中约60%用作家畜饲料。因此，充分利用西藏农区丰富的农作物秸秆资源，对满足西藏地区畜牧业生产对饲草的需求，维持西藏地区生态平衡稳定，促进藏区经济发展等都具有重要意义。
近年来，学者们对西藏地区牧草以及作物秸秆的研究较多。曲广鹏[5]通过对西藏农区牧草和饲草作物引种试验表明，燕麦、多花黑麦草、饲用玉米、绿麦、红苋等5种牧草适合在西藏农区及河谷地区种植，但其并未对这5种牧草进行相关的营养价值评价。张中岳[6]对西藏地区28种牧草的营养价值及瘤胃降解特性进行了评价，为进一步研究西藏牧草提供了宝贵的基础数据。张吉等[7]研究了添加剂对西藏燕麦和箭筈豌豆混合青贮品质的影响，结果表明添加糖蜜能显著提高混合青贮的品质。孙肖慧等[8]、李君风等[9]通过向西藏地区燕麦和紫花苜蓿混合青贮中添加4.0%糖蜜或3.5%乙醇或0.4%乙酸获得优质青贮饲料。赵庆杰等[10]通过向西藏青稞秸秆和多年生黑麦草混合青贮中添加糖蜜和乳酸菌显著提高了混合青贮发酵品质。原现军[11]对西藏作物秸秆与牧草混合青贮进行了研究，混合青贮有效地提高了发酵品质。综上，目前对西藏地区牧草及作物秸秆的研究多数集中在西藏地区青贮料的研究领域，而对作物秸秆干草瘤胃降解特性的研究鲜有报道。
因此，本试验利用体外产气技术，通过对西藏地区常见作物秸秆的瘤胃体外发酵参数进行研究，并通过对试验数据分析，筛选出易被瘤胃微生物降解利用的作物秸秆，以期为西藏地区农牧业发展提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集及处理试验作物秸秆(豌豆秸秆、玉米秸秆、青稞秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆)采集于西藏自治区贡嘎县岗堆镇吉纳村草场，作物秸秆于65 ℃烘24 h，粉碎后经1 mm孔径筛后备用。
1.1.2 试验动物及饲粮本试验供体奶牛为健康状况良好、体重［(500±50) kg]相近的3头装有永久瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛，由湖南省长沙市望城区白若铺镇胜和奶牛养殖基地提供。试验期间，奶牛饲粮参照NRC(2001)标准配制。饲粮由水稻秸秆和精料补充料组成，饲粮精粗比为40:60。饲粮组成及营养水平与文献[12]相同，详见表 1。
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表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis)[12] |
经处理后的作物秸秆，利用杨胜[13]提供的饲料分析方法分别对其干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、粗纤维(CF)、粗灰分(ash)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)等营养成分的含量进行测定，结果见表 2。
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表 2 作物秸秆营养价值 Table 2 Nutritive value of crop straws |
按照Menke等[14]提供的方法配制厌氧缓冲液。于晨饲前采集3头瘘管牛瘤胃内容物，用8层纱布过滤，滤液等体积混合后装入事先充满CO2并预热到39.5 ℃的保温瓶中，迅速带回实验室，与事先在39.5 ℃恒温水浴锅中预热的厌氧缓冲液混合(V缓冲液:V瘤胃液=9:1),并持续通入CO2 。
1.2.3 体外培养称取(0.500 0±0.000 3) g粉碎的作物秸秆于145 mL发酵瓶中，置于39.5 ℃恒温培养箱中预热，向发酵瓶中加入发酵液前，向瓶中通入CO2 1 min，随后加入50 mL发酵液，立即加上瓶塞并持续通入CO2，使用针头放气，使内外压强保持一致，然后迅速放回恒温培养箱，39.5 ℃恒温静止培养48 h。每种发酵底物设置12、24、48 h 3个采样时间点，每个采样时间点设置3个样品重复，即在每个采样时间点取出3个发酵瓶进行采样。
1.2.4 体外发酵产气量测定体外发酵产气量按王祚等[12]提供的方法进行测定。
利用Wang等[15-16]提出的逻辑斯谛-指数(logistic-exponential，LE)模型对累积产气量数据进行拟合：
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式中：V表示t时间点底物的产气量(mL)；Vf表示理论最大产气量(mL)；k表示产气分率(h)；b和d是曲线的形状指标，b>0表示曲线为S形，b<0则表示曲线非S形；FRD0表示发酵初期产气速率(<12 h)(mL/h)；t0.5表示达到最大产气量1/2时所需的时间(h)。
1.2.5 体外发酵相关参数测定 1.2.5.1 甲烷(CH4)测定及计算方法分别于体外发酵的12、24、48 h取出发酵瓶，利用注射器抽取5 mL瓶内气体注入事先已抽真空的集气瓶中，然后再注入25 mL高纯度N2，按照Li等[17]提供的方法进行相关参数的测定。CH4产量计算公式为：
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式中：6表示稀释倍数；Vt表示在发酵时间t时发酵瓶中气体总体积(mL)；C表示在发酵时间t时所测CH4浓度(%)；VCH4表示在发酵时间t时所生产CH4体积(mL)。
1.2.5.2 pH测定方法分别于体外发酵的12、24、48 h取出发酵瓶，发酵液经400目尼龙布过滤，取5 mL滤液，利用pH计(REX PHS-3C,上海仪器设备厂)立即测定滤液pH。
1.2.5.3 氨态氮(NH3-N)浓度测定分别于体外发酵的12、24、48 h取出发酵瓶，发酵液经400目尼龙布过滤，取4 mL滤液，分装到2个容积为2 mL的离心管中，放入-20 ℃冰箱保存，用于测定NH3-N浓度。利用冯宗慈等[18]提供的方法对NH3-N浓度进行测定。
1.2.5.4 主要挥发性脂肪酸(VFA)产量测定分别于体外发酵的12、24、48 h取出发酵瓶，每瓶取2 mL发酵液，经15 000 r/min离心15 min后，取1.5 mL上清液于2 mL的离心管中，并加入0.15 mL 25%偏磷酸，放入-20 ℃冰箱过夜保存，按照Wang等[19]提供的方法测定主要VFA产量。
1.2.5.5 体外干物质降解率(IVDMD)测定及计算方法分别于体外发酵的12、24、48 h取出发酵瓶，发酵液经400目尼龙布过滤，将过滤后的残渣全部转移至石英坩埚中并用热蒸馏水反复冲洗，然后置于105 ℃烘箱中烘8 h后测定剩余干物质质量，并计算IVDMD：
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式中：M1为发酵前发酵底物干物质质量(g)；M2为发酵后发酵底物干物质剩余量(g)。
1.2.5.6 体外中性洗涤纤维降解率(IVNDFD)测定及计算方法测定过体外干物质消失率后的剩余干物质量，按照Hall等[20]提供的方法进行NDF质量的测定，并计算IVNDFD：
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式中：m1为发酵前发酵底物中NDF质量(g)；m2为发酵后发酵底物NDF剩余量(g)。
1.3 数据分析试验数据采用SAS 8.2的Mixed过程进行统计，统计分析的差异显著性定义为P<0.05。
2 结果与分析 2.1 不同作物秸秆对体外发酵产气量的影响不同作物秸秆体外发酵产气量如图 1所示。5种作物秸秆在体外发酵初期(1~4 h)时，产气量均无明显差异；在体外发酵4 h后，产气速率逐渐增大；在体外发酵6~24 h时，5种作物秸秆体外产气曲线斜率最大，说明此时间段各作物秸秆体外产气速率也达到最大值。体外发酵24 h后，曲线斜率变小，说明5种作物秸秆体外产气速率也逐渐变小，产气量趋于稳定。玉米秸秆体外产气量以及产气速率在发酵开始4 h后一直高于其他4种作物秸秆，体外发酵24和48 h时，玉米秸秆体外产气量分别为75.33和97.84 mL，均高于其他4种作物秸秆；油菜秸秆体外发酵48 h时的产气量最低，为58.53 mL，低于其他作物秸秆。5种作物秸秆体外发酵48 h的产气量按玉米秸秆、青稞秸秆、豌豆秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆的顺序依次降低。
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图 1 不同作物秸秆对体外发酵产气量的影响 Figure 1 Effects of different crop straws on in vitro fermentation gas production |
不同作物秸秆对体外发酵产气参数及CH4产量的影响见表 3。不同作物秸秆体外发酵的理论最大产气量(Vf)以玉米秸秆最高(101.92 mL)，显著高于其他作物秸秆(P<0.05)；而油菜秸秆的Vf最低(59.09 mL)，显著低于其他4种作物秸秆(P<0.05)。对于体外发酵的初始产气速率(FRD0)，5种作物秸秆之间均无显著差异(P＞0.05)。对于体外发酵时达到最大产气量1/2时所需时间(t0.5)，以小麦秸秆最高(17.74 h)，与青稞秸秆没有显著差异(P＞0.05)，但显著高于豌豆秸秆、玉米秸秆和油菜秸秆(P<0.05)，且后三者之间没有显著差异(P＞0.05)。不同作物秸秆体外发酵CH4产量以豌豆秸秆和玉米秸秆相对较高，二者之间无显著差异(P＞0.05)，但均显著高于青稞秸秆、油菜秸秆和小麦秸秆(P<0.05)，且后三者之间没有显著差异(P＞0.05)。
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表 3 不同作物秸秆对体外发酵产气参数及CH4产量的影响 Table 3 Effects of different crop straws on in vitro fermentation gas production parameters and CH4 production |
不同作物秸秆对IVDMD和IVNDFD的影响见表 4。5种作物秸秆之间IVDMD和IVNDFD均存在显著差异(P<0.05)，其中IVDMD以玉米秸秆最高(57.35%)，且按玉米秸秆、豌豆秸秆、青稞秸秆、油菜秸秆、小麦秸秆的顺序依次显著降低(P<0.05)；对于IVNDFD，仍以玉米秸秆最高(53.73%)，且按玉米秸秆、青稞秸秆豌、豆秸秆、油菜秸秆、小麦秸秆的顺序依次显著降低(P<0.05)。
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表 4 不同作物秸秆对IVDMD和IVNDFD的影响 Table 4 Effects of different crop straws on IVDMD and IVNDFD |
不同作物秸秆对体外发酵pH和NH3-N浓度的影响见表 5。玉米秸秆体外发酵液的pH最低(6.42)，显著低于其他4种作物秸秆(P<0.05)，且其他4种作物秸秆体外发酵液的pH没有显著差异(P＞0.05)。豌豆秸秆体外发酵液中NH3-N浓度显著高于其他4种作物秸秆(P<0.05)，玉米秸秆、青稞秸秆和小麦秸秆体外发酵液中NH3-N浓度相对较低，且显著低于豌豆秸秆和油菜秸秆(P<0.05)。
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表 5 不同作物秸秆对体外发酵pH和NH3-N浓度的影响 Table 5 Effects of different crop straws on in vitro fermentation pH and NH3-N concentration |
不同作物秸秆对体外发酵主要VFA产量的影响见表 6。5种作物秸秆体外发酵48 h后乙酸、丙酸、丁酸和总VFA产量均以玉米秸秆最高，其中玉米秸秆乙酸产量显著高于豌豆秸秆、青稞秸秆和小麦秸秆(P<0.05)，丙酸和总VFA产量显著高于其他4种作物秸秆(P<0.05)，丁酸产量显著高于豌豆秸秆、油菜秸秆和小麦秸秆(P<0.05)；乙丙比以玉米秸秆和青稞秸秆较低，且两者之间没有显著差异(P＞0.05)，但均显著低于其他3种作物秸秆(P<0.05)。
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表 6 不同作物秸秆对体外发酵主要VFA产量的影响 Table 6 Effects of different crop straws on in vitro fermentation main VFA yields |
研究表明，5种作物秸秆之间体外发酵产气量均存在差异，以玉米秸秆最高，这可能是由于不同作物秸秆所含碳水化合物的量和组成不同所造成的。作物秸秆体外发酵产气来源主要是碳水化合物，它们所含蛋白质在体外发酵时也会产生一部分气体，但整个体外发酵过程中，蛋白质对产气量的贡献量远低于碳水化合物[21]。Cone等[22]对酪蛋白和淀粉的体外发酵研究发现，发酵72 h后蛋白质发酵的产气量仅为碳水化合物的30%。此外，本试验所用5种作物秸秆中，豌豆为豆科作物，油菜为十字花科作物，其他3种作物秸秆均为禾本科作物，种属不同可能也是粗饲料体外发酵产气量存在差异的原因之一。有研究报道指出不同类型粗饲料体外发酵产气特性有较大差异，通常情况下，种内差异较小，种间差异较大[21]。海存秀[23]利用阉割牦牛对青海高原天然牧草营养价值进行评价时得出天然牧草在体外发酵12~48 h时产气量的平均值急剧上升，48 h以后产气量的平均值的增加逐渐平缓。由图 1可知，本试验中5种作物秸秆体外发酵产气量在6~24 h时均急剧上升，在36 h以后趋于平缓，此结果与海存秀[23]报道结果有差异，两者之间的差异可能是由于发酵底物不同和发酵液成分不同造成的。
3.2 不同作物秸秆对体外发酵产气参数及CH4产量的影响在体外发酵过程中，发酵底物为瘤胃微生物所利用的程度可以通过体外发酵累积产气量来反映[24]。本试验中，各作物秸秆之间Vf存在明显差异，这可能是由于不同作物秸秆可溶性非结构性碳水化合物与CP的比例不同所造成的。汤少勋等[21]研究报道，当可溶性非结构性碳水化合物与CP之间的比例越大时，Vf越高，比例越小时，Vf越低，亦即随着牧草中非结构性碳水化合物含量的增加，体外发酵增强。高巍等[25]研究表明，青贮玉米秸秆中性洗涤可溶物(NDS)的产气量占饲草累积产气量的绝大部分。
FRD0表示体外发酵12 h之前的产气速率，t0.5表示体外产气量达到最大值1/2时所需时间，通常情况下，FRD0越大，t0.5越小[26]。在本试验中，5种作物秸秆之间FRD0差异并不显著，只有青稞秸秆FRD0相对较大，这可能是由于作物秸秆中NDF/CP的差异引起的，NDF为难降解物质，CP为易降解物质，二者比例越高，越不容易降解；相反，则越容易降解，发酵速率就越快。Muck等[27]研究报道，体外发酵过程中65%～70%产气量在发酵初期的9~10 h内产生，而本试验中，5种作物秸秆体外发酵t0.5均在10~19 h之间，明显高于Muck等[27]所报道的结论，这种差异可能是由于两者体外发酵方式以及发酵底物的不同而导致的。
反刍动物瘤胃中的CH4是由瘤胃中碳水化合物经瘤胃微生物厌氧发酵所生成的[28]。在瘤胃代谢过程中，瘤胃中CH4的生成是瘤胃发酵能量损失的主要原因之一，据报道，6%～15%的饲粮能量以CH4的形式散失[29]。瘤胃中CH4的生成与饲粮中CP、ADF、NDF、NFE含量以及IVDMD相关[30]。在本研究中，不同作物秸秆之间体外发酵CH4产量存在一定差异，其中玉米秸秆最高，与刘树军等[31]已报道结果一致，这种差异这可能是由于不同作物秸秆中可发酵的碳水化合物类型以及与CH4生成相关的成分含量的不同所致[32]。有报道指出作物秸秆纤维物质含量是影响CH4产量的一个重要因素[33]，这可能是由于富含纤维物质的饲料能促进一些纤维分解菌和甲烷合成菌的共生引起的，这类微生物可以偶联碳水化合物的降解产物，利用氢气还原二氧化碳以合成CH4[34]。
3.3 不同作物秸秆对IVDMD和IVNDFD的影响干物质降解率(DMD)和中性洗涤纤维降解率(NDFD)是体现瘤胃发酵过程中粗饲料利用率的重要指标[12]。粗饲料在瘤胃中的降解实际上是微生物以及微生物分泌的酶相互作用的结果，而降解率的高低与营养物质的结构、微生物对底物的附着能力以及微生物分泌酶的催化能力有关[6]。在本试验中，不同作物秸秆IVDMD存在差异，其中以玉米秸秆最高。这种差异可能是由于不同作物秸秆中非结构性碳水化合物以及可消化有机物的含量不同造成的，玉米秸秆非结构性碳水化合物和可消化有机物含量高于其他作物秸秆，此种结果也暗示玉米秸秆很容易被瘤胃微生物降解利用。
由于NDF的降解性影响动物的生长性能，并且作物秸秆在反刍动物瘤胃中的降解率差异比较大，因此，作物秸秆的NDFD是评定牧草品质的一个重要指标。本研究中，5种作物秸秆中以玉米秸秆IVNDFD最高，而其他作物秸秆的IVNDFD也存在差异，造成这种差异的原因可能与微生物与底物的吸附能力以及底物的结构有关，相对于其他作物秸秆，玉米秸秆可能更容易吸附纤维降解菌。Fernando等[35]报道细菌与底物的吸附能力是影响底物消化率的重要因子，徐俊等[36]报道苜蓿茎被瘤胃微生物降解的速率及程度受其组织结构及组分影响，同时其指出微生物对植物组织的吸附方式的不一致性也可能是造成不同底物纤维降解率不同的原因之一。
3.4 不同作物秸秆对体外发酵pH和NH3-N浓度的影响瘤胃液pH是评价瘤胃内环境的重要指标之一，维持瘤胃正常pH是保证瘤胃正常发酵的前提，而正常奶牛瘤胃液pH的正常范围为5.5～7.5[37]，在本试验中，5种作物秸秆体外发酵液的pH范围为6.32～6.59，均在正常范围内。已有报道指出，当pH大于5.7时，瘤胃微生物具有最大生长速度[38]，由此可知，本试验中的5种作物秸秆体外发酵均有利于微生物的生长。瘤胃液pH的大小受反刍动物唾液分泌以及有机酸的生成、吸收和排出等多种因素影响，但其波动的根本原因在于饲粮结构[39]，本试验的5种作物秸秆中以玉米秸秆的体外发酵液的pH最低(表 5)，可能是由于体外发酵产生较多的VFA所造成的。体外发酵液pH大小与各作物秸秆对应的体外发酵总VFA产量基本保持一致。
瘤胃中的NH3-N是瘤胃微生物合成微生物蛋白和机体蛋白质的主要原料，也是微生物生长的重要氮源，其浓度在一定程度上可以反映出瘤胃中蛋白质降解与合成之间的平衡状态[40]。Wanapat等[41]研究指出瘤胃液中NH3-N的最佳浓度范围为6.2～27.5 mg/dL，而在本试验中，5种发酵底物体外发酵液中NH3-N浓度范围为6.26~19.74 mg/dL，均在所报道的最佳浓度范围内。同时，5种作物秸秆之间体外发酵液中NH3-N浓度均存在显著差异，这种差异可能是由于不同作物秸秆蛋白质含量不同所造成的。5种作物秸秆中以豌豆秸秆的体外发酵液中NH3-N浓度最高，且显著高于其他作物秸秆，这可能是由于豌豆为豆科植物，而除油菜秸秆外，其他作物秸秆均为禾本科植物。已有报道指出豆科植物的蛋白质含量大于禾本科植物[6]，由此可知，豆科的豌豆秸秆的蛋白质含量高于禾本科的玉米秸秆、青稞秸秆和小麦秸秆，因此体外发酵液中NH3-N浓度较高。
3.5 不同作物秸秆对体外发酵VFA产量的影响VFA主要是由瘤胃微生物对饲粮中的营养物质进行厌氧发酵而得到的终产物[42]，是反刍动物赖以生存、保持正常生长、泌乳和繁殖的主要能源，可提供反刍动物总能量需要的70%~80%，因而在反刍动物碳水化合物营养中占有重要地位[43]。VFA的种类主要有乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸等，而对动物代谢最为重要的是乙酸、丙酸、丁酸，三者约占瘤胃总VFA产量的95%，其中又以乙酸是产量最大的VFA，喂粗饲料时乙酸产量占总VFA产量的70%~75%[44]。在本试验中，不同作物秸秆体外发酵VFA产量及其组成均存在一定差异，玉米秸秆体外发酵乙酸、丙酸、丁酸以及总VFA的产量均显著高于其他作物秸秆，但乙丙比却相对较低；小麦秸秆体外发酵总VFA产量相对较低，但其乙丙比相对较高，这种差异可能是由不同作物秸秆所含可发酵有机物以及NDF含量不同所引起的。郭冬生[44]研究报道VFA的生成量主要取决于可发酵有机物，李旺[45]报道饲粮中矿物元素也会影响到VFA的产量，同时指出VFA的组成受饲粮中NDF和非NDF的影响较大。此外，不同来源植物细胞壁体外发酵VFA产量也存在显著差异。张元庆等[46]报道，6种不同来源植物细胞壁发酵产生总VFA及除丁酸外的其他VFA组分含量均存在显著性差异。
4 结 论① 体外发酵48 h后，玉米秸秆的48 h产气量、Vf、CH4产量、IVDMD、IVNDFD均高于其他4种作物秸秆。
② 体外发酵48 h后，玉米秸秆发酵液的pH以及NH3-N浓度均低于其他4种作物秸秆。
③ 体外发酵48 h后，玉米秸秆的乙酸、丙酸、丁酸以及总VFA产量均高于其他4种作物秸秆。
④ 综合不同作物秸秆体外产气参数、体外发酵指标和降解率发现，玉米秸秆体外发酵效果最佳，与其他试验作物秸秆相比，更容易被瘤胃微生物降解利用；然而，玉米秸秆在发酵时也产生了较多的CH4气体，在实际畜牧生产中易造成能量的浪费。因此，在实际畜牧生产中，应综合考量各种因素，使得秸秆利用率最大化。
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