碳水化合物是鱼类饲料中重要的能源物质，且比蛋白质和脂肪廉价[1]，饲料中添加适量的碳水化合物不仅能促进鱼类生长，还能节省饲料成本、减轻氮排泄对养殖水体的污染[2]。但饲料中碳水化合物水平过高却会抑制鱼类的生长、降低饲料利用率、减弱鱼体抗病力、提高死亡率[3-4]。鱼类对碳水化合物的利用能力与葡萄糖耐受能力密切相关[1]。刘泓宇等[5]的研究表明，杂食性的吉富罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 葡萄糖耐受能力最强，肉食性的卵形鲳鲹次之，肉食性的军曹鱼葡萄糖耐受能力最低。这说明肉食性鱼类对葡萄糖的利用能力较杂食性鱼类低，且鱼类对葡萄糖的利用存在着种类差异性[6-9]。鱼类对碳水化合物的利用状况也会因碳水化合物复杂程度而存在差异，研究表明石斑鱼 (Epinephelus malabaricus)[10]、草鱼 (Ctenopharyngodon idella)[11]、金头鲷 (Sparus aurata)[12]等对小分子糖利用较好，胭脂鱼 (Myxocyprinus asiaticus) 幼鱼[13]、吉富罗非鱼[14]、大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[15]等对大分子糖利用较好，但这些研究均是在相同碳水化合物水平间的比较。研究表明，饲料碳水化合物水平可以调节鱼类肝脏糖酵解和糖异生关键酶的活性，从而调节鱼体血液中葡萄糖的含量[16]，目前在翘嘴红鲌 (Erythroculter ilishaeformis Bleeker)[4]、大菱鲆[17]、舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax)[18]、瓦氏黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco)[19]、金头鲷[12]和欧洲鳗鲡 (Anguilla anguilla)[20]等鱼类中均有研究，通过这些酶活性的变化来探究鱼类糖代谢机制，从而解释鱼类对碳水化合物利用能力出现较大差异的原因。
大黄鱼 (Pseudosciaena crocea Richardson) 是我国传统“海洋四大经济鱼类”之一[21]，为暖温性近海中下层集群洄游性鱼类，是肉食性鱼类中营养价值较高的养殖鱼类，因肉质鲜美而颇受消费者欢迎。目前对大黄鱼的蛋白质、脂肪及氨基酸需求量，替代蛋白质源，饲料原料消化率，营养成分及其风味均有研究[21-25]，而有关大黄鱼碳水化合物利用的研究[26-28]较少。鉴于此，本试验选取葡萄糖和小麦淀粉2种碳水化合物，设计0、15%、30% 3个碳水化合物水平，研究碳水化合物种类和水平对大黄鱼生长性能、肝脏糖代谢相关酶活性的影响，从而为大黄鱼资源节约型配合饲料的研制提供基础数据和理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验设计与饲料配制以秘鲁鱼粉、豆粕、小麦蛋白粉为蛋白质源，鱼油、豆油、卵磷脂为脂肪源，并分别以0、15%、30% 3个水平的小麦淀粉或葡萄糖为糖源，配制5种等氮等脂饲料，试验饲料组成及营养水平见表 1。将所有固态原料粉碎后过80目筛，按表 1比例混合均匀 (维生素和矿物质等微量组分采用逐级扩大法混合)，再加入鱼油、豆油和卵磷脂以及水混合均匀，用双螺杆挤条机[F (Ⅱ)-26，华南理工大学，广州]加工制成粒径分别为2和4 mm的硬颗粒饲料，在烘箱中90 ℃熟化30 min，自然风干，密封保存于-20 ℃冰箱。
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表 1 试验饲料组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
试验用大黄鱼鱼苗购自象山港湾水产苗种有限公司，养殖试验在浙江省象山县西沪港港湾鱼排上进行。正式试验前所有鱼苗先在鱼排上暂养2周，之后，挑选体质健壮、初始体重为 (8.53±0.07) g的大黄鱼750尾，随机分配于15个网箱 (1.5 m×1.5 m×2.0 m) 中，每个网箱放养50尾鱼。将15个网箱随机分为5组，每组3个网箱 (重复)。试验期间每天05:00和17:00各投喂1次，投饲率为体重的4%~6%。试验期间海水温度为26.5~31.5 ℃，盐度为19‰~25‰，溶解氧浓度不低于7.0 mg/L。养殖试验持续8周。
1.3 样品采集与指标测定养殖试验结束后将鱼捞出，并用丁香酚 (1 : 10 000) 麻醉，然后记录每个网箱的大黄鱼尾数并称量总重，用于计算增重率 (WGR)、特定生长率 (SGR)、成活率 (SR) 和饲料系数 (FCR)；每个网箱随机取3尾鱼，装于密封袋中，用于检测全鱼常规成分；每个网箱另随机取3尾鱼称重、量体长，取其肝脏、内脏并称重，用于计算肥满度 (CF)、肝体比 (HSI)、脏体比 (VSI)；每个网箱再随机取8尾鱼，从尾部静脉抽取血样 (血样不混合)，注入1.5 mL离心管中，4 ℃冰箱静置过夜后，3 000 r/min离心5 min，取上清液，每个网箱 (重复) 的血清进行混样后再分装至PCR管，置于-80 ℃冰箱备用；将上述取过血的大黄鱼解剖取肝脏，将肝脏放置于2 mL离心管中 (每个网箱的肝脏混样，取完立即放入液氮中)，用于检测肝脏葡萄糖激酶 (GK)、6-磷酸果糖激酶 (PFK)、丙酮酸激酶 (PK)、葡萄糖-6-磷酸酶 (G6Pase)、果糖-1, 6-二磷酸酶 (FBPase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PEPCK) 活性及肝糖原含量；将上述取过肝脏的大黄鱼的背部肌肉剥离，取30 g左右，装于密封袋中，用于测定肌肉常规成分。
参照AOAC (1995)[30]的方法测定饲料及大黄鱼全鱼和肌肉水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量。水分含量采用105 ℃恒温干燥法测定，粗蛋白质含量采用Leco FP-528全自动蛋白质分析仪测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，粗灰分含量采用550 ℃马弗炉灼烧法测定。部分血清生化指标使用日立7600-110型全自动生化分析仪测定；肝脏代谢酶活性及血清胰岛素和胰高血糖素含量均采用上海乔杜生物科技公司生产的酶联免疫吸附试验 (ELISA) 试剂盒进行测定。肝糖原含量采用南京建成生物工程研究所生产的肝糖原试剂盒检测。
1.4 计算公式
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试验数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，先进行双因素方差分析 (two-way ANOVA)，以检验碳水化合物种类和水平及其交互作用对各指标平均值影响的显著性。若碳水化合物水平对指标平均值有显著影响，则进行Tukey’s多重比较；若碳水化合物种类对指标平均值有显著影响，则进行独立样本t检验。各指标数据采用平均值±标准差 (mean±SD) 表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 碳水化合物种类和水平对大黄鱼生长性能和形态学指标的影响由表 2可知，饲料碳水化合物种类和水平及其交互作用对大黄鱼的终末体重、增重率、特定生长率、饲料系数有显著影响 (P < 0.05)，但对成活率、肥满度、肝体比、脏体比无显著影响 (P>0.05)。大黄鱼的终末体重、增重率和特定生长率随饲料葡萄糖水平的升高显著降低 (P < 0.05)；而当饲料中小麦淀粉水平由0增加到15%时，大黄鱼的终末体重、增重率和特定生长率显著升高 (P < 0.05)，而随饲料小麦淀粉水平由15%的进一步增加到30%，大黄鱼的终末体重、增重率和特定生长率显著降低 (P < 0.05)。饲料系数随饲料葡萄糖水平的升高显著升高 (P < 0.05)；而饲料系数随饲料小麦淀粉水平的升高先升高后降低，且15%小麦淀粉组的饲料系数显著低于0和30%小麦淀粉组 (P < 0.05)。在15%或30%水平下，小麦淀粉组大黄鱼的终末体重、增重率和特定生长率均显著高于葡萄糖组 (P < 0.05)，饲料系数则显著低于葡萄糖组 (P < 0.05)。
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表 2 碳水化合物种类和水平对大黄鱼生长性能和形态学指标的影响 Table 2 Effects of carbohydrate type and level on growth performance and morphological indices of large yellow croaker (n=3) |
由表 3可知，饲料碳水化合物种类和水平的交互作用对大黄鱼全鱼和肌肉的水分、粗脂肪含量有显著影响 (P < 0.05)，但对全鱼和肌肉的粗蛋白质、粗灰分含量无显著影响 (P>0.05)。全鱼和肌肉的粗脂肪含量随饲料小麦淀粉水平的升高而升高，30%小麦淀粉组显著高于0和15%小麦淀粉组 (P < 0.05)；肌肉粗脂肪含量随饲料葡萄糖的水平的升高先升高后降低，15%葡萄糖组显著高于0和30%葡萄糖组 (P < 0.05)。在15%水平下，葡萄糖组肌肉粗脂肪含量显著高于小麦淀粉组 (P < 0.05)；在30%水平下，葡萄糖组肌肉粗脂肪含量显著低于小麦淀粉组 (P < 0.05)。
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表 3 碳水化合物不同种类和水平对大黄鱼全鱼和肌肉常规成分的影响 Table 3 Effects of different carbohydrate and levels on whole body and muscle conventional components of large yellow croaker (n=3) |
由表 4可知，饲料碳水化合物种类和水平的交互作用对大黄鱼血清总蛋白、总胆固醇、甘油三酯、葡萄糖含量有显著影响 (P < 0.05)，但对胰岛素、胰高血糖素含量无显著影响 (P>0.05)。血清总胆固醇含量随饲料葡萄糖水平的升高先升高后降低，30%葡萄糖组显著低于0和15%葡萄糖组 (P < 0.05)，且15%葡萄糖组显著高于15%小麦淀粉组 (P < 0.05)，30%葡萄糖组显著低于30%小麦淀粉组 (P < 0.05)。血清甘油三酯含量随饲料葡萄糖水平的升高先升高后降低，30%葡萄糖组显著低于15%葡萄糖组 (P < 0.05)；血清甘油三酯含量随饲料小麦淀粉水平的升高先降低后升高，30%小麦淀粉组显著高于0、15%小麦淀粉组 (P < 0.05)。血清葡萄糖含量随饲料葡萄糖的水平升高先降低后升高，各组间差异显著 (P < 0.05)；血清葡萄糖含量随饲料小麦淀粉水平的升高逐渐降低，且30%小麦淀粉组显著低于0小麦淀粉组 (P < 0.05)。
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表 4 碳水化合物种类和水平对大黄鱼血清生化指标的影响 Table 4 Effects of carbohydrate type and level on serum biochemical indices of large yellow croaker (n=3) |
由表 5可知，饲料碳水化合物种类和水平的交互作用对大黄鱼肝脏葡萄糖激酶、6-磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶活性及肝糖原含量有显著影响 (P < 0.05)，但对丙酮酸激酶、果糖-1, 6-二磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性无显著影响 (P>0.05)。肝脏葡萄糖激酶活性随饲料葡萄糖水平的升高而升高，随小麦淀粉水平的升高先升高后降低，且15%葡萄糖组显著低于15%小麦淀粉组 (P < 0.05)。肝脏6-磷酸果糖激酶活性随饲料葡萄糖水平的升高先升高后降低，随小麦淀粉水平的升高而升高，且30%葡萄糖组显著低于30%小麦淀粉组 (P < 0.05)。肝脏丙酮酸激酶活性随饲料小麦淀粉水平的升高先降低后升高，且15%小麦淀粉显著低于0和30%小麦淀粉组 (P < 0.05)。肝脏葡萄糖-6-磷酸酶活性随饲料葡萄糖水平的升高先稍有降低而后显著升高 (P < 0.05)，随小麦淀粉水平的升高先显著升高 (P < 0.05) 后保持平稳。肝糖原含量随饲料葡萄糖水平的升高显著升高 (P < 0.05)，而当饲料小麦淀粉水平由0增加到15%时，大黄鱼肝糖原含量显著升高 (P < 0.05)，当饲料小麦淀粉水平由15%增加到30%时，大黄鱼肝糖原含量显著降低 (P < 0.05)，且15%、30%葡萄糖组分别显著高于15%、30%小麦淀粉组 (P < 0.05)。
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表 5 碳水化合物种类和水平对大黄鱼肝脏糖代谢相关酶活性及肝糖原含量的影响 Table 5 Effects of different carbohydrate type and level on hepatic glycometabolism-related enzyme activities and hepatic glycogen content of large yellow croaker (n=3) |
碳水化合物对于鱼类的成活和生长并非必需的，鱼类摄食不含碳水化合物的饲料也能正常生长[31]。在本试验中，含15%小麦淀粉饲料更有利于大黄鱼生长，表明适宜的饲料碳水化合物水平能促进鱼类生长[2]。本研究结果表明大黄鱼对小麦淀粉的利用能力要高于葡萄糖，这一结果与李弋等[28]的研究结果相同。然而，一些研究结果表明鱼类对葡萄糖的利用能力好于淀粉等多糖[11-12, 32]。在青鱼的研究中发现分别用20%和40%的葡萄糖和小麦淀粉进行16周的投喂后增重率各组之间无显著差异[33]；在石斑鱼的研究中也发现同样的结果，即石斑鱼对小麦淀粉和葡萄糖的利用效果无显著差异[10]。本试验结果与以上研究者的研究结果不相同，这可能是由于不同鱼类对碳水化合物的利用能力不同所致[34]。肝脏是机体的重要代谢器官，鱼类吸收的碳水化合物很大一部分转化为脂肪积累在肝脏中[35]，因此鱼类摄食含高水平碳水化合物的饲料后肝体比会上升[33, 36]，但本试验中发现碳水化合物水平对肝体比无显著影响，这与王猛强等[26-27]的研究结果一致。究其原因，可能是大黄鱼利用碳水化合物合成脂肪并在肝脏中沉积的能力较低。本试验中，同一水平下，葡萄糖组大黄鱼的饲料系数显著高于小麦淀粉组，表明小麦淀粉组大黄鱼的饲料转化率较高，即大黄鱼对小麦淀粉的利用效果更好。
3.2 碳水化合物种类和水平对大黄鱼全鱼和肌肉常规成分的影响有研究表明，饲料碳水化合物水平对鱼类粗脂肪含量的影响显著，而对鱼类水分、粗蛋白质、粗灰分含量的影响均不显著[37-38]，本试验结果与之相似。本试验结果发现，大黄鱼全鱼和肌肉粗脂肪含量与小麦淀粉水平呈正相关，这与在鲤鱼[39]、尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus L.)[40]、南方鲇[41]、军曹鱼 (Rachycentron canadum L.)[42]、翘嘴红鲌[43]中的研究结果相似，说明饲料碳水化合物水平的升高加快碳水化合物转化为脂肪，从而使得鱼体粗脂肪含量升高。另一些研究发现，随饲料碳水化合物水平的升高，非洲鲇 (Clarias gariepinus)[37]、星斑川碟 (Platichthys stellatus)[38]、黄鳍鲷 (Sparus latus)[44]鱼体粗脂肪含量降低，与本试验结果不一致，这可能是由于鱼体脂肪摄入量减少且不同鱼类将碳水化合物转化为脂肪的能力不同所致。脂肪是动物储存的主要能量物质，有研究表明，淀粉类多糖比单糖更易于鱼类吸收储存[32]，本试验也发现，较于葡萄糖，大黄鱼更善于将饲料中的小麦淀粉转化为脂肪储存在体内，从而促进其生长。
3.3 碳水化合物种类和水平对大黄鱼血清生化指标的影响在正常生理状态下动物一般能使自身各项生理指标保持动态稳定，因此血液组分的变化在一定程度上能够反映动物的健康情况[45]。血清胆固醇和甘油三酯含量变化在一定程度上能够反映肝脏代谢功能[46]。在哺乳动物中发现，当肝细胞受损时，血清胆固醇含量降低[47]，且研究表明鱼类胆固醇代谢几乎与哺乳动物一样[43]。本试验发现，30%葡萄糖组血清总胆固醇含量显著低于15%葡萄糖组、30%小麦淀粉组，这与在翘嘴红鲌[43]中的研究结果一致，表明高葡萄糖水平导致大黄鱼肝脏生理机能发生了变化；30%葡萄糖组血清葡萄糖含量显著高于0、15%葡萄糖组，表明大黄鱼对葡萄糖的利用能力有限，高水平的葡萄糖会导致大黄鱼持续高血糖浓度，对生长不利；而小麦淀粉水平对血清总胆固醇含量无显著影响，且血清葡萄糖含量随小麦淀粉水平的升高而降低，在翘嘴红鲌[43]的研究中也发现血清葡萄糖含量并没有随着α-淀粉水平的升高而上升，反而在高α-淀粉水平有下降的趋势，与本研究结果相似。这一方面可能是因为经过8周的饲养，大黄鱼对小麦淀粉出现了代谢适应，能够有效利用小麦淀粉，从而在摄食高水平小麦淀粉饲料时表现良好的生长状况；另一方面可能是因为对于淀粉等大分子糖类，大黄鱼消化吸收速率较慢，鱼体内的糖代谢相关酶的活化与葡萄糖的吸收速率达到同步，从而缓解了高水平葡萄糖对鱼体造成的不利影响；此外，这也可能是由于当鱼体摄入含中等水平的小麦淀粉饲料时，鱼体仅表现为血清葡萄糖和肝糖原含量的增高，但是当摄入高水平的小麦淀粉饲料时，鱼体相对增高了血清葡萄糖和肝糖原含量，同时也增高了体内脂肪的合成和累积率，从而使鱼体的血清葡萄糖和肝糖原含量保持在一定的阈值内[41]，因此出现本试验的结果，但具体原因仍需进一步探究。胰岛素是唯一能降低血液葡萄糖含量的激素。本试验发现，碳水化合物种类和水平对大黄鱼血清胰岛素含量无显著影响，表明鱼类胰岛素的分泌与饲料碳水化合物种类和水平无关[7]，对血液葡萄糖含量的调节主要依赖肝脏糖代谢相关酶活性及肝糖原含量。
3.4 碳水化合物种类和水平对大黄鱼肝脏糖代谢相关酶活性及肝糖原含量的影响葡萄糖激酶、6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、果糖-1, 6-二磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶是糖酵解和糖异生途径中的关键酶。本试验结果表明，升高饲料碳水化合物水平能够诱导肝脏葡萄糖激酶、6-磷酸果糖激酶活性的提高。在舌齿鲈[18]的研究中发现升高饲料淀粉水平使肝脏6-磷酸果糖激酶活性降低，但在瓦氏黄颡鱼[19]、大菱鲆[17]的研究中发现碳水化合物水平对肝脏6-磷酸果糖激酶活性无显著影响，表明不同鱼类对碳水化合物的代谢能力不同。研究发现，杂交罗非鱼 (Oreochromis niloticus×O.aureus) 幼鱼的肝脏6-磷酸果糖激酶活性在淀粉组较葡萄糖组高[48-49]，与本试验结果一致，表明肝脏6-磷酸果糖激酶活性随饲料碳水化合物结构复杂程度增加而升高。有关碳水化合物种类和水平对鱼类肝脏丙酮酸激酶活性的影响研究结果不一致，Enes等[50]对欧洲舌齿鲈的研究表明葡萄糖能提高肝脏丙酮酸激酶活性，而Tan等[51]对鲤鱼和斑点叉尾的研究表明随碳水化合物水平的升高肝脏丙酮酸激酶活性降低，而本试验发现大黄鱼肝脏丙酮酸激酶活性随饲料小麦淀粉水平的升高先降低后升高，与上述结果均不同。肝脏丙酮酸激酶活性也受碳水化合物的种类的影响，如：对于欧洲舌齿鲈，葡萄糖比淀粉可诱导更高的肝脏丙酮酸激酶活性[50]，对于欧鲫和中国鲶鱼，蔗糖组比葡萄糖、糊精、淀粉组肝脏丙酮酸激酶活性明显升高[51]，但在本试验中小麦淀粉组与葡萄糖组肝脏丙酮酸激酶活性无显著差异，这与在瓦氏黄颡鱼[19]、吉富罗非鱼[14]上所得结果相似，因此饲料碳水化合物对鱼类肝脏丙酮酸激酶活性的影响有待进一步探究。本试验发现，随着饲料小麦淀粉水平的升高，肝脏葡萄糖-6-磷酸酶活性显著升高，但在舌齿鲈[18]和虹鳟[52]的研究中发现碳水化合物对其活性无显著影响，其原因可能与碳水化合物和鱼的种类有关。本研究发现，饲料碳水化合物种类和水平对大黄鱼肝脏果糖-1, 6-二磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性无显著影响，这与对大菱鲆[17]的研究结果不同，其原因可能是不同生活习性的鱼对碳水化合物的利用能力有差异。血糖是体内糖的运输形式，糖原是体内糖的储存形式[53]。机体通过肝糖原的合成与分解来维持血糖浓度的相对恒定，研究发现鱼类摄食碳水化合物后会导致肝糖原含量增加[54]，而持续的高血糖浓度和高肝糖原含量不利于鱼类的正常代谢。在本试验中肝糖原含量并没有因小麦淀粉水平的升高而持续升高，该结果与李弋等[28]的研究结果一致，表明高小麦淀粉并没有引起大黄鱼肝糖原的过多积累，不仅能维持血糖浓度的相对恒定，而且不会损害鱼类肝脏的正常功能。
4 结论饲料添加15%小麦淀粉时，大黄鱼能够通过调节糖代谢相关酶活性及肝糖原含量来维持血糖浓度的平衡，并能促进大黄鱼生长；饲料添加30%小麦淀粉时，大黄鱼能够通过调节糖代谢相关酶活性及肝糖原含量来维持血糖的平衡，但对生长有一定的抑制作用。而随饲料葡萄糖水平的升高，大黄鱼通过调节肝脏葡萄糖激酶、6-磷酸果糖激酶活性及肝糖原含量仍不能维持血糖浓度的相对恒定，且大黄鱼生长严重受抑。
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