近年来，在对肉产品安全高度关注、实现畜牧业可持续发展以及抗生素负面作用的影响下，开发“安全、高效、稳定、可控”的新型饲料添加剂成为国内外研究的热点。植物提取物以其安全、高效、无残留、不产生抗药性等优点，在畜牧生产中被广泛应用，成为一种新型绿色抗生素替代品[1-2]。植物提取物不仅具有抗菌[3]、抗氧化[4]的功效，还具有提高动物机体免疫力[5]、促进生长[6]、改善肠道微生物环境[7]、提高肉品质[8]等作用。八角和杜仲具有多种生物学功能，且在我国资源丰富。体外试验表明，八角和杜仲叶提取物在抗菌[9-10]、抗氧化[11-12]和提高免疫力[13-14]方面具有显著效果。但是，八角和杜仲叶提取物对不同品种断奶仔猪肝脏因子核因子E2相关因子2(Nrf2) 和肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 分布和表达的影响尚未见报道。因此，本试验旨在探讨八角和杜仲叶提取物对断奶仔猪生长性能、血清酶活性、肝脏TNF-α分布和表达的影响，为八角和杜仲叶提取物在畜牧生产中的应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料八角提取物：山东农业大学动物营养研究实验室提取，提取方法为乙醇提取法。主要成分：反式茴香脑≥55.50%，草稿脑≥6.17%，茴香醛≥4.56%。
杜仲叶提取物：山东龙昌动物保健品有限公司提供。主要成分：杜仲多糖≥20.00%，黄酮≥8.00%，绿原酸≥5.00%。
抗生素：金霉素，山东雨泽银丰动物药业有限公司提供。
1.2 试验设计采用单因子试验设计，选取28日龄“杜×长×大”断奶仔猪48头，随机分为4个组，每组3个重复，每个重复4头猪，组间体重差异不显著 (P>0.05)。基础饲粮参考我国《猪饲养标准》[15]配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中分别添加500 mg/kg八角提取物 (八角组)、250 mg/kg杜仲叶提取物 (杜仲组) 和50 mg/kg金霉素 (抗生素组)。试验预试期7 d，正试期42 d，仔猪自由采食和饮水。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
每天记录各组断奶仔猪采食量，每周称量各组断奶仔猪体重，计算平均日采食量 (ADFI)、平均日增重 (ADG) 和料重比 (F/G)。
1.3.2 血液的采集、处理与血清酶活性的测定于试验第43天晨饲前，每个重复随机选取断奶仔猪1头，使用真空促凝管采集血液15 mL。37 ℃水浴静置10 min，3 000 r/min下离心10 min，分离血清，-20 ℃保存待测，采用全自动生化分析仪 (COBAS MIRA Plus，瑞士罗士公司) 测定血清中谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST) 和碱性磷酸酶 (ALP) 活性。
1.3.3 仔猪屠宰与样品采集采血完毕后，仔猪电击致死，放血后打开胸腔和腹腔，无菌剥离肝脏，并迅速切取一份肝脏组织置于Bouin’s液中固定；另取一份肝脏组织置于冻存管中，-80 ℃液氮保存。
1.3.4 免疫组化[链霉亲合素-生物素复合物 (strept avidin-biotin complex，SABC) 法]取Bouin’s液中固定好的组织块，用乙醇逐级脱水，二甲苯透明，采用BMJ23型包埋机包埋。1) 切片机 (LEICA RM2135，德国徕卡公司) 进行切片 (5 μm)，常规脱蜡至水。2) 柠檬酸缓冲液 (0.01 mol/L，pH 6.0) 进行抗原热修复，磷酸盐缓冲液 (PBS)(0.01 mol/L，pH 7.2) 洗3次，5 min/次 (下同)。3)3%过氧化氢 (H2O2) 室温避光孵育30 min，用以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3次。4)10%胎牛血清37 ℃封闭孵育1 h。5) 分别加一抗兔抗TNF-α(1 : 50) 多克隆抗体 (bs-0078R，北京博奥森生物技术有限公司)，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次。6) 加生物素化羊抗兔免疫球蛋白G (1 : 50) 二抗 (bs-0295Gs，北京博奥森生物技术有限公司)，37 ℃恒温箱中孵育1 h，PBS洗3次。7) 加辣根过氧化物酶-链霉素亲和素 (1 : 100)，37 ℃孵育45 min，PBS洗3次。8) 二氨基联苯胺 (DAB) 显色，显微镜下观察显色程度，控制显色时间。9) 苏木素复染、脱水、透明、封片，在显微镜下观察免疫阳性细胞分布规律。
1.3.5 TNF-α mRNA相对表达量的测定取出-80 ℃保存的肝脏样品50~100 mg，按照Trizol试剂盒说明书 (Invitrogen公司，美国) 提取总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA的质量和浓度，结果显示吸光度 (OD) 值均在1.8~2.0之间。检测后的总RNA立即进行反转录。反转录按照PrimeScript@ RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒说明书进行操作。荧光定量PCR的反应体系为20 μL，其扩增条件均为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环，60 ℃检测荧光信号。每个样品做3个重复，荧光定量PCR检测结果用2-△△Ct进行数据处理，分析肝脏中的TNF-α mRNA相对表达量。
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表 2 引物序列 Table 2 Primers sequences |
试验数据使用SAS 9.3软件进行统计。处理和仔猪品种间差异采用双因素方差分析 (double factor variance analysis) 进行统计分析，各平均值之间用Duncan氏法进行多重比较。试验数据用平均值和SEM表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 八角和杜仲叶提取物对断奶仔猪生长性能的影响由表 3可见，与对照组相比，八角组、杜仲组和抗生素组断奶仔猪平均日采食量没有显著差异 (P>0.05)，八角组、杜仲组和抗生素组断奶仔猪平均日增重显著提高 (P < 0.05)。各组间断奶仔猪料重比差异不显著 (P＞0.05)，但八角组和抗生素组有降低的趋势。
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表 3 八角和杜仲叶提取物对断奶仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of Illicium verum and Eucommia leaf extracts on growth performance of weaned piglets |
由表 4可见，八角组和杜仲组血清谷丙转氨酶活性显著低于对照组和抗生素组 (P < 0.05)。各组间血清谷草转氨酶活性差异不显著 (P < 0.05)。与对照组相比，八角组、杜仲组和抗生素组血清碱性磷酸酶活性显著降低 (P < 0.05)。
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表 4 八角和杜仲叶提取物对断奶仔猪血清酶活性的影响 Table 4 Effects of Illicium verum and Eucommia leaf extracts on serum enzyme activities of weaned piglets |
免疫组化结果显示，断奶仔猪肝脏中TNF-α免疫阳性反应为黄色、棕黄色或棕色，阴性不着色，说明本试验采用的免疫组化SABC法具有免疫反应的特异性。
由图 1可见，TNF-α在肝小叶中阳性结果较强，分布较均匀。根据颜色深浅和阳性分布可以看出，抗生素组TNF-α免疫阳性反应最强，主要在肝细胞胞质中分布；其他组阳性强弱依次为对照组、八角组和杜仲组，主要在肝血窦内皮和肝细胞膜中分布。
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A、C、E、G为低倍图，B、D、F、H为高倍图。I为中央静脉，J为小叶间结缔组织，K小叶间动脉，L为小叶间胆管，M为小叶间静脉，N为肝细胞，O为肝血窦。红色箭头表示TNF-α阳性细胞，绿色箭头表示TNF-α阴性细胞。Control：对照组；Illicium：八角组；Eucommia：杜仲组；Antibiotics：抗生素组。 A, C, E and G were macroscopic pictures. B, D, F and H were microscopic pictures. I was central vein, J was interlobular connective tissue, K was interlobular artery, L was interlobular bile duct, M was interlobular vein, N was liver cells, O was hepatic sinusoid. Red arrows showed immune-active cells of TNF-α, and green arrows showed immune-negative cells of TNF-α. Control: control group; Illicium: Illicium verum group; Eucommia: Eucommia group; Antibiotics: antibiotics group. 图 1 八角和杜仲叶提取物对断奶仔猪肝脏TNF-α分布的影响 Figure 1 Effects of Illicium verum and Eucommia leaf extracts on liver TNF-α distribution of weaned piglets |
由图 2可见，与对照组相比，八角组和杜仲组断奶仔猪肝脏中TNF-α mRNA的相对表达量显著降低 (P < 0.05)，而抗生素组断奶仔猪肝脏中TNF-α mRNA的相对表达量则差异不用显著 (P＞0.05)。
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数据柱标不同小写字母者差异显著 (P<0.05)。Control：对照组；Illicium：八角组；Eucommia：杜仲组；Antibiotics：抗生素组。 Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). Control: control group; Illicium: Illicium verum group; Eucommia: Eucommia group; Antibiotics: antibiotics group. 图 2 八角和杜仲叶提取物对断奶仔猪肝脏中TNF-α mRNA相对表达量的影响 Figure 2 Effects of Illicium verum and Eucommia leaf extracts on liver TNF-α mRNA relative expression level of weaned piglets |
宋振帅[16]研究表明，八角粉 (10 g/kg) 对育肥猪平均日增重和平均日采食量没显著影响，但可提高其饲料转化率。李晓梅等[17]研究报道，在饲粮中添加一定量的杜仲 (250 mg/kg) 有利于提高平均日增重和饲料转化率。本试验中，饲粮中添加八角 (500 mg/kg) 和杜仲叶提取物 (250 mg/kg) 提高了断奶仔猪生长性能 (平均日增重提高)。八角和杜仲叶提取物具有抗菌消炎[18-20]的作用，通过抑制有害病菌与机体竞争营养物质，提高机体中营养物质的消化和吸收[21]，这可能是八角和杜仲叶提取物提高生长性能的原因之一。八角和杜仲叶提取物中含有增强抗胆碱酯酶 (AchE) 的成分，通过其抗AchE的作用，兴奋了胃肠道平滑肌，进一步促进胃肠蠕动及胃液分泌[22-23]，这可能是八角和杜仲叶提取物提高生长性能的另一个原因。但是，八角和杜仲叶提取物提高生长性能的分子机制尚需进一步证实。
3.2 八角和杜仲叶提取物对断奶仔猪血清酶活性的影响肝脏是动物体内重要的免疫器官，具有解毒和造血的功能。肝脏受到疾病损伤导致的炎症反应或药酶诱导剂的作用可以诱导肝细胞内酶分泌增加，因此，血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶活性高低可以作为肝功能状况和应激反应的一个标志[24-25]。血清中谷丙转氨酶参与谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，谷草转氨酶催化谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用[26]。谷丙转氨酶和谷草转氨酶可以通过脱氨基和转氨基过程合成多种氨基酸，促进机体的蛋白质合成能力，其活性高低反映了蛋白质合成和分解的代谢状况，与仔猪平均日增重呈正相关[27]。血清碱性磷酸酶在骨骼形成的过程中起着重要作用[28]，同时参与脂肪和蛋白质代谢。王定发等[29]研究表明，假蒟提取物 (50 mg/kg) 可降低血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性。刘合军等[30]研究表明，刺五加提取物 (1 000 mg/kg) 可降低血清碱性磷酸酶活性。本试验中，八角和杜仲组血清谷丙转氨酶和碱性磷酸酶活性均低于对照组，这与以上研究结果一致，说明八角和杜仲叶提取物具有保肝护胆、减轻炎症反应的作用。但是，八角和杜仲叶提取物调控血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶活性的细胞学机制尚需进一步证实。
3.3 八角和杜仲叶提取物对断奶仔猪肝脏中TNF-α分布和表达的影响肿瘤坏死因子是一类重要的炎症调控因子，它不仅能诱导自身释放超氧阴离子、一氧化氮 (NO)，也会诱导其他炎性细胞因子[如白细胞介素-6(IL-6) 和白细胞介素-8(IL-8)]的释放，进而参与疾病的发生、发展[31-32]。许腊梅等[33]对大鼠肝脏中TNF-α研究显示，TNF-α阳性结果主要分布于肝细胞质中，部分分布于单核细胞和少数汇管区。与本研究结果基本一致。在很多炎症反应过程中，TNF-α mRNA的相对表达量均显著性上升[34-35]。本试验研究表明，抗生素组TNF-α mRNA的相对表达量最高，说明抗生素对肝脏有一定的损伤。杜仲组TNF-α mRNA的相对表达量最低，说明杜仲叶提取物具有抗炎作用，其原因可能与杜仲叶提取物中绿原酸成分有关，绿原酸能够抑制核转录因子κB (NF-κB) 和Toll样受体4(TLR4)2个信号转导通路的激活，从而对TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β) 和IL-6炎性细胞因子的表达起到抑制作用[36]。本研究中TNF-α在肝脏中的分布与表达结果一致，但是，八角和杜仲叶提取物中哪种成分起主导作用，其影响TNF-α的分布与表达的分子机制尚需进一步研究。
4 结论①饲粮中添加八角和杜仲叶提取物提高了断奶仔猪平均日增重。
②饲粮中添加八角和杜仲叶提取物降低了血清谷丙转氨酶和碱性磷酸酶的活性。
③饲粮中添加八角和杜仲叶提取物降低了肝脏TNF-α mRNA的相对表达量。
| [1] | WINDISCH W, SCHEDLE K, PLITZNER C, et al. Use of phytogenic products as feed additives for swine and poultry[J]. Journal of Animal Science, 2008, 86(14S): E140–E148. |
| [2] | BRENES A, ROURA E. Essential oils in poultry nutrition:main effects and modes of action[J]. Animal Feed Science and Technology, 2010, 158(1/2): 1–14. |
| [3] | RAHIMI S, TEYMORI ZADEH Z, TORSHIZI M A K, et al. Effect of the three herbal extracts on growth performance, immune system, blood factors and intestinal selected bacterial population in broiler chickens[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2011, 13(4): 527–539. |
| [4] | MILOS M, MASTELIC J, JERKOVIC I. Chemical composition and antioxidant effect of glycosidically bound volatile compounds from oregano (Origanum vulgare L.ssp.hirtum)[J]. Food Chemistry, 2000, 71(1): 79–83. DOI: 10.1016/S0308-8146(00)00144-8 |
| [5] | WANG J L, SHAN A S, LIU T Y, et al. In vitro immunomodulatory effects of an oleanolic acid-enriched extract of Ligustrum lucidum fruit (Ligustrum lucidum supercritical CO2 extract) on piglet immunocytes[J]. International Immunopharmacology, 2012, 14(4): 758–763. DOI: 10.1016/j.intimp.2012.10.006 |
| [6] | LI S Y, RU Y J, LIU M, et al. The effect of essential oils on performance, immunity and gut microbial population in weaner pigs[J]. Livestock Science, 2012, 145(1/2/3): 119–123. |
| [7] | AHMED S T, HOSSAIN M E, KIM G M, et al. Effects of resveratrol and essential oils on growth performance, immunity, digestibility and fecal microbial shedding in challenged piglets[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2013, 26(5): 683–690. DOI: 10.5713/ajas.2012.12683 |
| [8] | HONG J C, STEINER T, AUFY A, et al. Effects of supplemental essential oil on growth performance, lipid metabolites and immunity, intestinal characteristics, microbiota and carcass traits in broilers[J]. Livestock Science, 2012, 144(3): 253–262. DOI: 10.1016/j.livsci.2011.12.008 |
| [9] | 吴周和, 徐燕, 吴传茂. 八角中天然防腐剂的提取方法及其抑菌作用研究[J]. 中国调味品, 2003(9) :18–20. |
| [10] | JI Z P, SU Y Q. Study on antimicrobial activities of extracts from Eucommia ulmoides Oliv. leaves[J]. Chemistry and Industry of Forest Products, 2008, 28(1): 63–66. |
| [11] | PADMASHREE A, ROOPA N, SEMWAL A D, et al. Star-anise (Illicium verum) and black caraway (Carum nigrum) as natural antioxidants[J]. Food Chemistry, 2007, 104(1): 59–66. DOI: 10.1016/j.foodchem.2006.10.074 |
| [12] | 向灿辉, 邓镇涛, 王文君, 等. 杜仲叶提取物抗氧化作用与总黄酮含量的相关性研究[J]. 食品工业, 2012(8) :1–5. |
| [13] | 杨栋林.八角茴香提取液对运动小鼠免疫功能的影响[D].硕士学位论文.桂林:广西师范大学, 2007. |
| [14] | YANG G, KYOUNG SEO E, LEE J H, et al. Suppression of splenic lymphocyte proliferation by Eucommia ulmoides and genipin[J]. Chemistry & Biodiversity, 2015, 12(4): 538–546. |
| [15] | 中华人民共和国农业部.NY/T 65-2004猪饲养标准[S].北京:中国农业出版社, 2004. |
| [16] | 宋振帅.八角、丹参和生姜对生长育肥猪及其饲料作用效果研究[D].硕士学位论文.泰安:山东农业大学, 2014. |
| [17] | 李晓梅, 曹爱智. 杜仲叶提取物 (幸福100) 对仔猪生长性能、免疫功能和抗氧化功能的影响[J]. 中国饲料添加剂, 2013(7) :22–25. |
| [18] | YANG J F, YANG C H, CHANG H W, et al. Chemical composition and antibacterial activities of Illicium verum against antibiotic-resistant pathogens[J]. Journal of Medicinal Food, 2010, 13(5): 1254–1262. DOI: 10.1089/jmf.2010.1086 |
| [19] | ALY S E, SABRY B A, SHNHEEN M S, et al. Assessment of antimycotoxigenic and antioxidant activity of star anise (Illicium verum) in vitro[J]. Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences, 2016, 15(1): 20–27. DOI: 10.1016/j.jssas.2014.05.003 |
| [20] | SU Y Q, ZHU H W, MA X H, et al. Screening of antibacterial activities of endophytic fungi isolated from Eucommia ulmoides[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2005, 25(6): 1153–1157. |
| [21] | RANUCCI D, BEGHELLI D, TRABALZA-MARINUCCI M, et al. Dietary effects of a mix derived from oregano (Origanum vulgare L.) essential oil and sweet chestnut (Castanea sativa Mill.) wood extract on pig performance, oxidative status and pork quality traits[J]. Meat Science, 2015, 100: 319–326. DOI: 10.1016/j.meatsci.2014.09.149 |
| [22] | BHADRA S, MUKHERJEE P K, KUMAR N S, et al. Anticholinesterase activity of standardized extract of Illicium verum Hook. f. fruits[J]. Fitoterapia, 2011, 82(3): 342–346. DOI: 10.1016/j.fitote.2010.11.003 |
| [23] | KWON S H, LEE H K, KIM J A, et al. NeuroProtective effects of Eucommia ulmoides Oliv. bark on amyloid beta25-35-induced learning and memory impairments in mice[J]. Neuroscience Letters, 2011, 487(1): 123–127. DOI: 10.1016/j.neulet.2010.10.042 |
| [24] | MANEN C A, COSTA M, SIPES I G, et al. Further evidence of cyclic amp-mediated hypertrophy as a prerequisite of drug-specific enzyme induction[J]. Biochemical Pharmacology, 1978, 27(2): 219–224. DOI: 10.1016/0006-2952(78)90304-0 |
| [25] | CHENG W H, VALENTINE B A, LEI X G. High levels of dietary vitamin E do not replace cellular glutathione peroxidase in protecting mice from acute oxidative stress[J]. The Journal of Nutrition, 1999, 129(11): 1951–1957. |
| [26] | 高海霞.中草药添加剂对香猪生长性能、肉品质及血液生化指标的影响[D].硕士学位论文.兰州:甘肃农业大学, 2010. |
| [27] | BOZA J J, TURINI M, MOËNNOE D, et al. Effect of glutamine supplementation of the diet on tissue protein synthesis rate of glucocorticoid-treated rats[J]. Nutrition, 2001, 17(1): 35–40. DOI: 10.1016/S0899-9007(00)00505-0 |
| [28] | 王石.谷朊粉酶解物对断奶仔猪生长性能、免疫功能和小肠发育的影响[D].硕士学位论文.郑州:河南工业大学, 2011. |
| [29] | 王定发, 周璐丽, 周雄, 等. 假蒟提取物对断奶仔猪生长性能、血液指标的影响[J]. 动物营养学报, 2015, 27(10) :3233–3240. |
| [30] | 刘合军, 孔祥峰, 尹富贵, 等. 刺五加提取物对早期断奶仔猪生长性能和血清生化参数的影响[J]. 天然产物研究与开发, 2006, 18(6) :993–998. |
| [31] | WILLIMAS L M, LALI F, WILLETTS K, et al. Rac mediates TNF-induced cytokine production via modulation of NF-κB[J]. Molecular Immunology, 2008, 45(9): 2446–2454. DOI: 10.1016/j.molimm.2007.12.011 |
| [32] | LIN W W, KARIN M. A cytokine-mediated link between innate immunity, inflammation, and cancer[J]. Journal of Clinical Investigation, 2007, 117(5): 1175–1183. DOI: 10.1172/JCI31537 |
| [33] | 许腊梅, 孙丹莉, 张予蜀, 等. 紧密连接蛋白Occludin在非酒精性脂肪肝大鼠肠上皮细胞中的表达及其与TNF-α的关系[J]. 世界华人消化杂志, 2010, 18(10) :981–986. |
| [34] | CHU X, SONG K J, XU K, et al. Ceftiofur attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury[J]. International Immunopharmacology, 2010, 10(5): 600–604. DOI: 10.1016/j.intimp.2010.02.010 |
| [35] | DING X M, DUAN Y Y, PENG C S, et al. Dexamethasone treatment attenuates early seawater instillation-induced acute lung injury in rabbits[J]. Pharmacological Research, 2006, 53(4): 372–379. DOI: 10.1016/j.phrs.2006.01.006 |
| [36] | 高瑞峰.绿原酸抗乳腺炎作用及机制研究[D].博士学位论文.长春:吉林大学, 2014. |