2. 吉林农业大学, 长春 130118;
3. 潍坊学院, 潍坊 261061
2. Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;
3. Weifang University, Weifang 261061, China
玉米蛋白粉是利用湿法处理玉米籽粒加工玉米淀粉时产生的蛋白质经过浓缩、脱水分离、干燥等处理所得[1]。玉米蛋白粉的主要成分为蛋白质，一般在60%左右，其余的营养成分包括纤维素、淀粉、无机盐以及具有特殊生理功能的黄色素 (玉米黄质、β-胡萝卜素、叶黄素等) 等，其蛋白质主要由玉米醇溶蛋白 (zein，68%)、谷蛋白 (glutelin、22%)、球蛋白 (globulin、1.2%) 以及少量的白蛋白 (albumin) 构成[2]。由于醇溶蛋白含有大量疏水性氨基酸，能够在多肽主链上形成稳定的α-螺旋体结构，导致醇溶蛋白在单胃动物体内不易于被消化吸收，且较容易和其他大分子有机物或微量元素结合，阻碍了动物肠道对这部分营养元素的吸收与利用[3]，因此畜禽直接饲喂玉米蛋白粉的效果并不理想，这也是制约玉米蛋白粉应用的一个主要原因。复合微生物发酵采用多菌种协作，产生的蛋白酶将大分子蛋白质降解成具有多种生理活性的多肽，发酵所用的微生物及部分次级代谢产物随饲粮进入机体后，可以改善动物的肠道微生物环境，在提高有益菌数量的同时，抑制有害菌的生长，复合微生物相互之间的次级代谢产物会产生正向的协同效应，往往比单独菌种发酵的程度及发酵的产物质量要好。但是，目前关于复合微生物发酵玉米蛋白粉在肉仔鸡生产中应用的研究报道还很少。因此，本研究以黑曲霉、乳酸杆菌和酵母菌为发酵菌种，采用固态发酵的形式，研究复合微生物发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡生长性能、肠道微生物数量和抗氧化能力的影响。
1 材料与方法 1.1 试验材料玉米蛋白粉采用乳酸杆菌、酵母菌和黑曲霉为发酵菌种，以固态发酵方式，按照乳酸杆菌4%、酵母菌6%和黑曲霉6%接种量，在发酵温度33 ℃、含水量为40%、初始pH为7.0的条件下发酵84 h后，55 ℃烘干，得到发酵玉米蛋白粉。
1.2 试验设计选取7日龄黄羽肉仔鸡150只，随机分为3组，每组10个重复，每个重复5只鸡，每组中公母各占1/2，各重复之间体重差异不显著 (P＞0.05)。对照组饲喂不添加发酵玉米蛋白粉的基础饲粮，试验1组和2组分别饲喂添加5%和10%的发酵玉米蛋白粉的试验饲粮。饲粮参照中国《鸡营养标准》(NY/T 33-2004) 配制，其组成及营养水平见表 1。试验过程中，严格按照饲养管理规程操作，常规操作程序免疫接种，保持试验场地和鸡舍清洁卫生，正常消毒，试验鸡雏健康无病，自由采食和饮水。试验期49 d。
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表 1 饲粮组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) |
分别于28和56日龄称重结束后，每个重复选取接近平均体重的试鸡1只，颈部采血后，迅速4 000 r/min离心10 min，取适量血清，于-20 ℃条件下密封保存，备测。同时，进行屠宰试验，记录活体重与胴体重后，立即无菌解剖并摘取肝脏、胸腺、肾脏、法氏囊，除去血液，滤纸吸干，称重，计算器官指数。
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取1 g肝脏组织，加9倍冰生理盐水，剪碎，置玻璃匀浆器中破碎，制成10%的组织匀浆液，2 000 r/min离心15 min，取上清液于-20 ℃条件下保存，备测肝脏抗氧化指标。
1.4 指标测定 1.4.1 生长性能每周以重复为单位，空腹称重鸡只，计算平均体重、平均日增重 (ADG)；试验期间以重复为单位，记录平均日采食量 (ADFI)，计算料重比 (F/G)。
1.4.2 肠道微生物数量28和56日龄时，分别从每个重复选取接近平均体重的试鸡1只，颈部放血处死后，迅速解剖，截取盲肠末端2~3 cm肠段，在无菌条件下取内容物0.5 g于无菌试管内，用无菌生理盐水进行10-2~10-7倍稀释，小型振荡器混匀。用微量移液器吸取100 μL经稀释的样品，滴入对应梯度培养基，肠道微生物的培养基及培养条件见表 2。每个稀释度重复3次。采用恒温培养箱进行培养，对菌落进行计数，最终结果以每克内容物所含菌落总数的常用对数值[lg (CFU/g)]表示。
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表 2 肠道微生物的培养基及培养条件 Table 2 Culture mediums and culture conditions of intestinal microflora |
血清和肝脏总超氧化物歧化酶 (T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性及丙二醛 (MDA) 含量均用Specord S600紫外可见光光度计进行测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
血清抑制羟自由基和抗超氧阴离子自由基能力测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测定方法严格按照试剂盒说明书要求操作。
1.5 统计分析试验结果以平均值±标准差表示，数据处理与分析采用SPSS 19.0软件one-way ANOVA程序进行方差分析，以P < 0.05和P < 0.01分别作为差异显著性和极显著性判断标准，差异显著时，以LSD法进行多重比较。
2 结果 2.1 复合微生物发酵对玉米蛋白粉营养成分的影响由表 3可知，复合微生物发酵对玉米蛋白粉的营养成分影响较大，发酵后粗蛋白质、还原糖含量以及多肽得率均有不同程度的增加，分别增加了12.75%、8.36倍和2.07倍；但是总糖含量发酵后降低了35.86%。
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表 3 复合微生物发酵对玉米蛋白粉营养成分的影响 Table 3 Effects of compound microorganism fermentation on nutrient composition of corn gluten meal |
由表 4可知，复合微生物发酵对玉米蛋白粉氨基酸组成影响也较大，发酵后总必需氨基酸和总氨基酸含量分别增加了12.58%和12.37%，各必需氨基酸含量均有不同程度增加，其中苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸含量增加较大，分别比未发酵时提高了12.5%、8.5%、13.6%、11.9%和25.4%；非必需氨基酸中脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸含量发酵后分别增加了10.9%、12.8%、16.1%、13.3%、11.3%、12.0%、12.1%和10.1%。
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表 4 复合微生物发酵对玉米蛋白粉氨基酸组成的影响 Table 4 Effects of compound microorganism fermentation on amino acid constitute of corn gluten meal |
由表 5可知，与对照组相比，试验1组和2组能够显著提高肉仔鸡的平均日采食量和平均日增重 (P < 0.05)，并且试验2组能够显著降低肉仔鸡的料重比 (P < 0.05)。
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表 5 发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡生长性能的影响 Table 5 Effects of fermented corn gluten meal on growth performance of broilers |
由表 6可知，28日龄时，试验2组的肝脏指数显著高于对照组 (P < 0.05)，肾脏指数极显著高于对照组 (P < 0.01)；试验1组的肝脏指数和肾脏指数与对照组差异不显著 (P>0.05)；各组间胸腺指数和法氏囊指数差异均不显著 (P>0.05)。56日龄时，试验2组的肾脏指数极显著高于对照组和试验1组 (P < 0.01)，胸腺指数极显著高于对照组 (P < 0.01)，但是试验1组和2组之间胸腺指数差异不显著 (P>0.05)；各组间肝脏指数和法氏囊指数差异均不显著 (P>0.05)。
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表 6 复合微生物发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡器官指数的影响 Table 6 Effects of fermented corn gluten meal on organ indexes of broilers |
由表 7可知，28日龄时，试验2组盲肠大肠杆菌数量极显著低于对照组 (P < 0.01)，但是与试验1组间差异不显著 (P>0.05)，试验1组与对照组间差异也不显著 (P>0.05)；试验1组和2组的盲肠乳酸杆菌数量极显著高于对照组 (P < 0.01)，且试验1组和2组间差异不显著 (P>0.05)。56日龄时，除试验1组和2组盲肠乳酸杆菌数量极显著高于对照组 (P < 0.01) 外，其余各组间肠道微生物数量差异均不显著 (P>0.05)。
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表 7 发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡肠道微生物数量的影响 Table 7 Effects of fermented corn gluten meal on intestinal microflora number of broilers |
由表 9可知，28日龄时，试验1组和2组血清MDA含量极显著低于对照组 (P < 0.01)；各组间血清T-SOD和GSH-Px活性差异不显著 (P>0.05)；试验2组血清抗超氧阴离子自由基和抑制羟自由基能力均极显著高于试验1组和对照组 (P < 0.01)，且试验1组极显著高于对照组 (P < 0.01)。56日龄时，试验1组和2组血清GSH-Px活性极显著高于对照组 (P < 0.01)；试验2组血清抗超氧阴离子自由基和抑制羟自由基能力均极显著高于试验1组和对照组 (P < 0.01)，且试验1组极显著高于对照组 (P < 0.01)；各组间血清T-SOD活性和MDA含量差异均不显著 (P>0.05)。
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表 8 发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡血清抗氧化能力的影响 Table 8 Effects of fermented corn gluten meal on serum antioxidant capacity of broilers |
由表 9可知，28日龄时，试验2组肝脏T-SOD活性极显著高于对照组和试验1组 (P < 0.01)，且对照组与试验1组间差异不显著 (P>0.05)；试验1组和2组肝脏MDA含量极显著低于对照组 (P < 0.01)；各组间肝脏GSH-Px活性差异均不显著 (P>0.05)。56日龄时，各组间肝脏T-SOD、GSH-Px活性以及MDA含量差异均不显著 (P>0.05)。
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表 9 发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡肝脏抗氧化能力的影响 Table 9 Effects of fermented corn gluten meal on liver antioxidant capacity of broilers |
玉米蛋白粉是生产玉米淀粉过程中得到的副产物，一般情况下，玉米蛋白粉的粗蛋白质含量可达60%以上，并且主要是来自玉米胚乳中的醇溶蛋白，微生物发酵可显著提高和改善其营养价值，促进动物新陈代谢。本研究中，以乳酸杆菌、酵母菌和黑曲霉为发酵菌种，采用固态发酵方式对玉米蛋白粉发酵84 h，发酵后粗蛋白质和还原糖含量均有不同程度的增加，分别增加了12.75%和8.36倍，但是总糖含量降低了35.86%；同样，发酵后总必需氨基酸和总氨基酸含量分别增加12.58%和12.37%，说明发酵过程中微生物的大量增殖能够使部分玉米蛋白转化成菌体蛋白，不但改变了玉米蛋白粉的营养品质，而且还提高了发酵基料的蛋白质水平，同时，菌体分泌的蛋白酶可将植物大分子蛋白质降解为氨基酸、多肽及氨等小分子物质。魏炳栋等[4]采用乳酸杆菌和酸性蛋白酶复合固态发酵酶解的方式对豆粕、棉籽粕和菜籽粕进行处理，结果表明，乳酸杆菌和酸性蛋白酶复合固态发酵能够提高豆粕、棉籽粕和菜籽粕粗蛋白质的含量；与未发酵豆粕相比，发酵豆粕蛋白质体外消化率提高了6%，游离必需氨基酸含量提高了24倍，游离总氨基酸含量提高了45倍[5]；发酵72 h时，豆粕、菜籽粕和棉籽粕总糖含量分别下降了17.40%、33.26%和27.35%，还原糖含量分别增加了6.47倍、10.15倍和1.53倍[6]，这些结果均与本试验结果相一致。
3.2 发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡生长性能的影响目前，发酵玉米蛋白粉的研究主要集中在玉米肽发酵生产工艺优化[7]、菌种筛选[8-9]以及抗氧化活性[10-11]等方面，在动物应用方面的研究报道较少。张宏宇等[12]利用商品发酵蛋白粉普乐金 (CJ-Prosin，粗蛋白质含量70%) 和普乐肽 (CJ-Protide，粗蛋白质含量58%) 替代断奶仔猪饲粮中50%鱼粉时，对断奶仔猪生长性能没有显著影响；夏素银等[13]利用发酵蛋白饲料 (粗蛋白质含量44.26%，粗脂肪含量2.88%，粗纤维含量10.48%) 替代30%豆粕时，对肉仔鸡的平均日增重和料重比没有显著影响；金秒仁等[14]在爱拔益加 (AA) 肉仔鸡饲粮中分别添加5%和10%的微生态发酵蛋白粉 (粗蛋白质含量48.14%，干物质含量92.72%) 能够显著提高肉仔鸡的生长性能。本研究中，肉仔鸡饲粮中添加发酵玉米蛋白粉 (粗蛋白质含量67.57%) 能够显著提高试验动物的平均日采食量和平均日增重，并且饲粮中添加10%的发酵玉米蛋白粉能够显著降低料重比。
3.3 发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡器官指数的影响器官指数是试验动物的重要生物学指标之一，其大小在一定程度上能够反映动物器官的功能强弱及受损情况[15]。肝脏和肾脏是体内重要的代谢器官，胸腺和法氏囊是重要的免疫器官。一般认为，免疫器官的增加是由其自身的细胞生长发育和分裂增殖所致，重量增加表明机体免疫机能提高，重量减少表明机体免疫状况变差[16]。本试验中，肉仔鸡饲粮中添加10%的发酵玉米蛋白粉能够显著提高肉仔鸡28日龄的肝脏指数、肾脏指数以及56日龄的肾脏指数、胸腺指数，说明发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡的生长发育、代谢以及免疫功能均有一定程度的促进作用。但是，目前关于生物发酵饲料对试验动物器官指数影响的研究结果并不一致。沈沾红等[17]研究结果表明，赖氨酸发酵蛋白粉替代20%或40%豆粕蛋白时，肉鸡的消化器官 (胰腺、肌胃、十二指肠、空肠和回肠) 指数显著高于对照组；杜丽华等[18]研究结果表明，在1~4周龄黄羽肉鸡饲粮中用9%发酵豆粕替代普通豆粕，可显著提高脾脏指数和法氏囊指数，并认为主要原因有：1) 发酵饲料中抗营养因子降解，减少饲粮抗原对机体免疫系统的攻击；2) 发酵饲料中含有一定数量的活菌及益生素和一定数量的小肽，益生素和小肽均能参与机体免疫调节，促进免疫器官发育，提高机体免疫功能。但是，王宝维等[19]研究结果表明，5~12周龄五龙鹅饲粮中添加6%~8%的发酵葡萄籽粕对免疫器官指数没有显著影响；同样，邱良伟[20]研究结果表明，用50%、75%和100%发酵棉籽粕蛋白替代豆粕，对肉仔鸡免疫器官有一定的促进作用，但是未达到显著水平。
3.4 发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡肠道微生物数量的影响肠道微生态系统是动物体内最大和最复杂的微生态系统，动物从出生开始，这些细菌就进入到消化道中，随着年龄增长、营养变化等因素的影响，肠道菌群发生着不同的变化，并且在不同部位细菌的数量和种类有所不同，并保持一种动态的平衡，肠道菌群的平衡和稳定对机体的生理功能具有十分重要的作用，对其宿主的健康具有深远的影响。本研究中，肉仔鸡饲粮中添加5%或10%的发酵玉米蛋白粉能够极显著地提高盲肠中乳酸杆菌的数量，显著降低盲肠中大肠杆菌的数量，这主要是因为发酵玉米蛋白粉中的活性有益菌进入消化道后迅速定植，并逐渐形成优势菌群，产生的各种次级代谢产物能够降低肠道pH，抑制致病菌的生长。尹鹏鹏[21]研究指出，生物发酵饲料能够显著降低肉鸭回肠内大肠杆菌和肠球菌的数量，增加乳酸杆菌和芽孢杆菌的数量，李永明等[22]、俞晓辉[23]的研究报道均与本试验结果一致。
3.5 发酵玉米蛋白粉对肉仔鸡抗氧化能力的影响玉米蛋白经微生物发酵可产生具有多种生理活性功能的玉米肽，主要表现在易消化吸收、抗氧化、抗疲劳、降血压、抗过敏等，其中抗氧化肽能够抑制生物大分子过氧化，清除体内自由基的产生。蔡佳[24]利用黑曲霉固态发酵的形式发酵玉米蛋白粉制备的玉米肽具有较强的抗氧化活性；同样，牟金秀[25]利用枯草芽孢杆菌发酵玉米蛋白粉制备的玉米肽也具有较强的抗氧化活性。本试验中，以乳酸杆菌、酵母菌和黑曲霉为发酵菌种，采用固态发酵方式，在肉仔鸡饲粮中分别添加5%或10%的发酵蛋白粉能够极显著提高机体抗氧化酶活性和血清中抑制自由基的能力，并且极显著地降低28日龄肉仔鸡血清中MDA的含量，说明本试验制备的发酵玉米蛋白粉具有较强的抗氧化能力。王宝维等[19]、邱良伟[20]、黄静等[26]报道，利用发酵葡萄籽粕、发酵棉籽粕和发酵桑叶粉对五龙鹅、肉仔鸡和胡须鸡的抗氧化能力均有不同程度地提高，本试验结果与上述研究结果相一致。
4 结论①饲粮中添加发酵玉米蛋白粉能够提高肉仔鸡的平均日采食量和平均日增重，并且添加10%的发酵玉米蛋白粉能够显著降低料重比。
②饲粮中添加发酵玉米蛋白粉能够提高肉仔鸡的肝脏指数、肾脏指数和胸腺指数，具有促进发育、代谢和生长的作用。
③饲粮中添加发酵玉米蛋白粉能够降低肉仔鸡大肠杆菌数量，提高乳酸杆菌的数量，改善肠道环境。
④饲粮中添加发酵玉米蛋白粉能够提高肉仔鸡血清中抗氧化酶活性和抑制自由基能力，并且降低血清中MDA的含量。
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