拟穴青蟹 (Scylla paramamosain) 属于肉食性甲壳动物，以小型鱼虾贝类为主食，是一种广盐性、广温性的海水蟹类。它具有生长迅速、养殖周期短、经济价值高等优点，并且味道鲜美、可食率高，含有人体所需的全部8种必需氨基酸，二十二碳六烯酸 (DHA)、二十碳五烯酸 (EPA) 等不饱和脂肪酸含量也相当丰富，在北部湾地区深受广大养殖户与消费者的喜爱[1]。随着市场需求量的增大，北部湾地区的拟穴青蟹的养殖面积也逐步增加[2]。目前，拟穴青蟹养殖主要以池塘粗放型养殖模式居多，投喂饵料以低值贝类、小杂鱼虾为主，这种养殖模式投入较高，对环境污染较大，不利于大规模推广[3]。因此，研究拟穴青蟹的营养需求，并开发出一种拟穴青蟹经济、环保、高效的人工配合饲料，是促使拟穴青蟹养殖产业逐渐走向集约化养殖的关键。
水产饲料中，脂肪主要作为能源物质为养殖动物所利用，提供生长发育的必需脂肪酸，并作为溶剂促进部分脂溶性维生素 (如维生素A等) 的吸收和运输，同时它还是一些激素和维生素的合成原料[4]。在鱼类饲料中，脂肪的添加是影响饲料质量和鱼类生长的主要因素之一。研究表明，鱼类饲料中通过添加脂肪、淀粉等提供能源的消耗，能有效提高可消化蛋白质的利用率，从而达到节约饲料蛋白质的作用[5]。同时，饲料中适量添加脂肪还能改善饲料适口性，降低饲料系数，从而节约养殖成本[6]。因此，研究饲料脂肪最适水平意义重大。
饲料营养学领域的研究学者对蟹类及其他甲壳类动物的饲料最适脂肪水平做了很多研究，如：中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 仔蟹饲料中最适脂肪水平为6.61%~9.96%[7]；三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatu) 饲料中最适脂肪水平为9%[8]；脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 饲料中最适脂肪水平为5%~7%[9]；罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii) 在9%的饲料脂肪水平下生长较好[10]。
本文以鱼油和豆油为脂肪源，开展了饲料脂肪水平对拟穴青蟹仔蟹生长性能、体组成和消化酶活性影响的研究，以期为规模化养殖拟穴青蟹的人工配合饲料的研制提供重要的理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验饲料制作饲料之前，分别对各原料进行粗蛋白质、粗脂肪含量以及能值的测定，作为制订和调整饲料配方的依据。本试验以鱼粉、酪蛋白和明胶为蛋白质源，进口鱼油和金龙鱼大豆油 (1 : 1) 为脂肪源，糊精及微晶纤维素为配平等能水平的补充能源，配成脂肪水平分别为0、2%、4%、6%、8%、10%和12%的7种等氮等能试验饲料 (表 1)。制成后实际测得7种试验饲料的脂肪水平分别为1.93%、3.95%、6.36%、8.14%、10.54%、12.30%和14.22%。本试验所有原料粉碎后过100目筛网，按照饲料配方中添加量的多少从低至高逐级称重并混合均匀，再与鱼油、大豆油和水充分混匀，微黏合饲料加工参照Blair等[11]介绍的方法，将饲料制成过直径为2 mm的颗粒饲料，标号装袋于4 ℃冰箱内保存备用。
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表 1 试验饲料组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
于2015年8月1日至2015年8月21日，在广西壮族自治区海洋研究所海水增养殖试验基地进行拟穴青蟹仔蟹饲养试验。试验用拟穴青蟹仔蟹均为同一批受精卵孵化的人工苗种，蟹苗为通体黑褐色、无损伤、活力好、体质强的Ⅰ期仔蟹，规格为 (0.042±0.002) g/只，头胸甲宽为 (0.41±0.07) cm，头胸甲长为 (0.33±0.04) cm。由于拟穴青蟹较凶猛，互相打架残食严重，因此本试验中仔蟹为单独养殖，每100只为1个重复，每3个重复饲喂1种试验饲料。养殖容器为直径20 cm、高25 cm的塑料水桶，水桶底部铺一薄层 (1~2 cm) 的细沙，并在桶底部边缘放置一个面积约为5 cm2的瓦片，以供试验仔蟹栖息。每天投喂2次，时间分别为07:00和18:00，以略有剩饵为准，投喂前先吸出剩饵。每2 d换1次水，每周彻底清理试验水桶1次。饲养采用自然光照周期，无充氧，水温维持在26~30 ℃，盐度维持在18‰~22‰。
1.3 样品采集与指标测定 1.3.1 生长性能养殖试验结束后对每个重复的受试拟穴青蟹仔蟹进行计数、称重，然后计算各组的成活率 (survival rate, SR)、增重率 (weight gain rate, WGR) 及特定生长率 (specific gain rate, SGR)，计算公式如下：
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式中：W0为拟穴青蟹仔蟹初始体重；Wt为拟穴青蟹仔蟹终末体重；t为试验天数；N0为初始拟穴青蟹仔蟹的只数；Nt为终末拟穴青蟹仔蟹的只数。
1.3.2 营养成分含量采用AOAC (1995)[12]的方法分析测定饲料和全蟹的营养成分含量，具体为：采用105 ℃烘箱中烘干至恒重法测定水分含量，烘干后样品用高速粉碎机粉碎，用于粗蛋白质 (凯氏定氮法)、粗脂肪 (索氏抽提法) 和粗灰分 (550 ℃高温灼烧法) 含量测定。
1.3.3 消化酶活性所有待测全蟹样品均置于4 ℃冰箱解冻，分次加入2倍于样品重量的pH=7的磷酸缓冲溶液，然后在玻璃匀浆器 (置于冰水混合物中) 匀浆，匀浆液于4 ℃、4 000 r/min离心20 min，取上清液进行消化酶活性的测定。蛋白酶活性采用福林-酚法测定；脂肪酶和淀粉酶活性均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定；酶液中蛋白质含量以牛血清蛋白作标准，用考马斯亮蓝法测定。各消化酶的活性均用比活力 (U/mg prot) 表示。
1.4 统计分析采用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行单因素方差分析 (one-way AVOVA)，若差异达到显著性水平，则进行Tukey’s多重比较，显著性水平为P < 0.05。数值以“平均值±标准误”表示。
2 结果 2.1 饲料脂肪水平对拟穴青蟹仔蟹生长性能的影响由表 2可知，饲料脂肪水平显著影响拟穴青蟹仔蟹的WGR和SGR (P < 0.05)。以脂肪水平为8.14%时为拐点，低于此水平时，随着饲料脂肪水平的升高，WGR和SGR显著升高 (P < 0.05)；而高于此水平时则相反，WGR和SGR随着饲料脂肪水平的升高表现为显著降低 (P < 0.05)。拟穴青蟹仔蟹的SR在饲料脂肪水平为14.22%的组最低，显著低于其余各组 (P < 0.05)。
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表 2 饲料脂肪水平对拟穴青蟹仔蟹生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary lipid level on growth performance of juvenile Scylla paramamosain |
如图 1，经回归分析，WGR (y) 与饲料脂肪水平 (x) 的二次曲线回归方程为：y=-7.392 8x2+111.22x+17.438(R2=0.988 1)。由方程得出，当饲料脂肪水平为7.52%，WGR达到最高值，为435.75%。
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图 1 饲料脂肪水平与拟穴青蟹仔蟹WGR的回归分析 Figure 1 Regression analysis between dietary lipid level and WGR of juvenile Scylla paramamosain |
由表 3可知，饲料脂肪水平显著影响全蟹的粗蛋白质、粗脂肪含量 (P < 0.05)。饲料脂肪水平为8.14%的组全蟹粗蛋白质含量最高，为36.33%，显著高于其余各组 (P < 0.05)；饲料脂肪水平为14.22%的组全蟹粗蛋白质含量最低，为31.67%，显著低于饲料脂肪水平为6.36%和8.14%的组 (P < 0.05)。全蟹粗脂肪含量随着饲料脂肪水平的升高而持续升高，饲料脂肪水平为1.93%的组显著低于其余各组 (P < 0.05)，而饲料脂肪水平为12.30%和14.22%的组则显著高于其余各组 (P < 0.05)。饲料脂肪水平对全蟹的水分、粗灰分含量没有显著影响 (P>0.05)。
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表 3 饲料脂肪水平对拟穴青蟹仔蟹体组成的影响 Table 3 Effects of dietary lipid level on body composition of juvenile Scylla paramamosain |
由表 4可知，饲料脂肪水平对拟穴青蟹仔蟹的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均有显著影响 (P < 0.05)，三者均在饲料脂肪水平为8.14%时达到最高值。饲料脂肪水平为14.22%的组蛋白酶活性最低，显著低于饲料脂肪水平为8.14%的组 (P < 0.05)，其余各组间无显著差异 (P>0.05)。淀粉酶活性同样是在饲料脂肪水平为14.22%的组最低，为0.50 U/mg prot，显著低于其余各组 (P < 0.05)；饲料脂肪水平为1.93%和3.95%的组间淀粉酶活性差异不显著 (P>0.05)，二者均显著低于饲料脂肪水平为3.95%~12.30%的组 (P < 0.05)。饲料脂肪水平为8.14%和10.54%的组的脂肪酶活性显著高于其他各组 (P < 0.05)，且饲料脂肪水平为8.14%的组还显著高于饲料脂肪水平为10.54%的组 (P < 0.05)；此外，饲料脂肪水平为1.93%~6.36%的组间及饲料脂肪水平为12.30%~14.22%的组间脂肪酶活性无显著差异 (P>0.05)。
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表 4 饲料脂肪水平对拟穴青蟹仔蟹消化酶活性的影响 Table 4 Effects of dietary lipid level on digestive enzyme activities of juvenile Scylla paramamosain |
脂肪是水产动物生长过程中所需能量和必需脂肪酸的重要来源。在三大营养素中，脂肪所含能量最高，在饲料中加入适当的脂肪作为能源物质，能有效提高蛋白质效率，达到节约蛋白质的作用，进而节约饲料成本，提高养殖效率[5-6]。饲料中的脂肪不仅是某些脂溶性营养素 (维生素A、维生素K、胡萝卜素等) 的溶剂，除能有效促进这些营养素的消化吸收外，还可为水产动物提供类脂，如磷脂、胆固醇等，这些类脂是构建细胞膜的基本原料，能满足各种组织器官的修补和新生组织的合成[13]。此外，在水产动物饲料中添加适量的脂肪还能改善饲料的适口性，提高增重率和饲料转化率，降低养殖过程中对水体的污染[6]。因此，在饲料配方和饲料营养的研究中，对适宜脂肪水平的研究越来越受到重视。
不同甲壳动物对饲料中脂肪的利用能力有较大区别，其饲料最适脂肪水平也各不相同。本研究中采用二元回归方法分析饲料脂肪水平对拟穴青蟹仔蟹WGR的影响，得出拟穴青蟹仔蟹饲料适宜脂肪水平为7.52%。其他学者的研究得出，饲料脂肪水平为6.61%~9.96%时可满足中华绒螯蟹仔蟹的生长[7]，三疣梭子蟹饲料中最适脂肪水平为9%[8]，脊尾白虾饲料中最适脂肪水平为5%~7%[9]等。
前人对甲壳动物的研究中，王猛强等[14]对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 的研究发现，随着饲料脂肪水平的升高，凡纳滨对虾幼虾和大规格虾的WGR、SGR、蛋白质效率均呈先增后降的趋势，饲料转化率呈先降后升的趋势，幼虾阶段和大规格虾阶段饲料中最适脂肪水平分别为4.83%~5.98%和5.57%~7.86%。孙龙生等[15]在对罗氏沼虾的研究中指出，饲料脂肪水平的变化对其WGR有显著影响，随着饲料脂肪水平 (6%~12%) 的升高，WGR呈先增后降的趋势，综合生长发育及饲料利用率，罗氏沼虾饲料中适宜脂肪水平为9%。段青源等[8]在三疣梭子蟹的研究中发现，当饲料蛋白质水平为40%时，三疣梭子蟹的WGR随着饲料脂肪水平的升高呈先增后降的趋势，三疣梭子蟹饲料中最适脂肪水平为9%。在本研究中，拟穴青蟹仔蟹的WGR和SGR在饲料脂肪水平为8.14%的组达到最高，且显著高于其余各组；当饲料脂肪水平低于8.14%时，拟穴青蟹仔蟹的WGR、SGR随着饲料脂肪水平的升高而上升；超过8.14%之后再升高饲料脂肪水平，拟穴青蟹仔蟹的WGR、SGR不增反降。这一结果与上述学者在其他甲壳动物的研究中得到的结论相一致。饲料中的脂肪水平过低或过高均不利于拟穴青蟹仔蟹的生长的原因可能为：1) 过低的饲料脂肪水平会使得饲料提供的能量、必需脂肪酸以及脂溶性维生素不足以满足拟穴青蟹仔蟹生长的需要，导致生长发育受阻[13]；2) 当饲料脂肪供给量不足以满足能量需求时，会使得饲料中部分蛋白质被当作能源消耗，从而导致拟穴青蟹仔蟹的蛋白质需求也得不到满足[9]；3) 高脂肪水平饲料虽然在一定程度上可以起到节约蛋白质的作用，但是一味的提高饲料中的脂肪水平，会引起甲壳类动物肌肉组织中脂肪过量沉积，从而影响产品外观和品质，这种现象已在克氏螯虾 (Procambarus clarkii)[16]、日本沼虾 (Macrobrachium nipponensis)[17]等中得到证实；4) 饲料脂肪水平过高时会导致饲料适口性降低，并且高饲料脂肪水平还可能引起饲料氧化变质，使得饲料适口性进一步下降，从而导致拟穴青蟹仔蟹生长减缓[9]。
饲料脂肪水平在1.93%~8.14%时，饲料脂肪水平变化对拟穴青蟹仔蟹的SR无显著影响，这与其他学者在凡纳滨对虾[14]、克氏螯虾[16]、日本沼虾[17]、日本对虾 (Penaeus japonicus)[18]等上的研究结果一致。本试验养殖过程中，在投喂量相同的情况下，饲料脂肪水平为14.22%的组饲料剩余量较多，可能是高脂肪水平导致饲料适口性降低，使得拟穴青蟹仔蟹摄食率下降，无法满足生长发育，从而导致此组SR显著低于其余各组。
3.2 饲料脂肪水平对拟穴青蟹仔蟹体组成的影响斯烈钢等[17]对日本沼虾的研究中发现，改变饲料脂肪水平对全虾中粗脂肪和干物质含量、肌肉中粗脂肪含量以及肝胰脏中干物质含量有显著影响。徐维娜等[16]对克氏螯虾的研究发现，饲料脂肪水平对全虾中粗脂肪、粗蛋白质、干物质和粗灰分含量均有显著影响；在肌肉中，饲料脂肪水平仅对粗脂肪含量有显著影响；在肝胰脏中，饲料脂肪水平对干物质和粗脂肪含量有显著影响。王猛强等[14]在凡纳滨对虾的研究中发现，随着饲料脂肪水平的上升，肌肉中粗蛋白质含量先升后降，肌肉中粗蛋白质含量在饲料脂肪水平为10.13%的组最高；饲料脂肪水平对凡纳滨对虾幼虾全虾和大规格虾肌肉中水分、粗灰分含量无显著影响。
本试验中，饲料脂肪水平在1.93%~14.22%范围内变化对拟穴青蟹仔蟹全蟹中粗蛋白质、粗脂肪的含量有显著影响，对水分、粗灰分的含量无显著影响。在饲料脂肪水平为1.93%~8.14%时，升高饲料脂肪水平，全蟹粗蛋白质含量随之升高，造成这种现象的可能原因为：饲料中的脂肪具有节约蛋白质的作用，随着饲料脂肪水平的上升，饲料中的脂肪足够满足拟穴青蟹仔蟹的能量需求，使得饲料中蛋白质的利用率升高，进而促进生长。而在饲料脂肪水平为8.14%~14.22%时，高饲料脂肪水平使得全蟹中粗蛋白质含量有所下降，究其原因可能为：高脂肪水平饲料的能量较高，摄入高能食物会给予中枢神经反馈增强饱腹感，从而减少摄食，进而使得蛋白质和其他营养物质摄入减少，影响生长[19-20]。
3.3 饲料脂肪水平对拟穴青蟹仔蟹消化酶活性的影响研究证明，甲壳动物的消化酶活性取决于其消化吸收的生理特点和所摄食的饵料，其消化酶活性的高低能反映出对摄食饲料营养元素的适应性和消化吸收能力，进而决定了其生长发育的快慢[21]。饲料成分对水产动物消化酶活性影响的研究有很多，一般规律为饲料中某种成分增加，消化该成分的相应的消化酶活性增加，并且其他种类的消化酶活性也会发生相应变化[22]。本研究中拟穴青蟹仔蟹的3种消化酶活性均较低，其中蛋白酶活性在1.42~4.27 U/mg prot，淀粉酶活性在0.50~0.91 U/mg prot，脂肪酶活性在 (1.91~10.29)×10-2 U/mg prot，与其他学者测定的三疣梭子蟹[23]、中华绒螯蟹[24]、锯缘青蟹[25]的消化酶活性结果类似。
饲料脂肪水平对不同甲壳动物消化酶活性的影响具有复杂性和多样性。在对克氏螯虾的研究中，饲料脂肪水平对其肠道和肝胰脏的脂肪酶活性具有显著影响，当脂肪水平为10%时，2种组织中脂肪酶活性均显著提高；但是，提高饲料脂肪水平并不会对其肠道和肝胰脏的淀粉酶活性造成显著影响[16]。而在日本沼虾的研究中，饲料脂肪水平对其肝胰脏的蛋白酶和脂肪酶活性都有显著影响，当饲料脂肪水平从5%提高至11%时，肝胰脏中蛋白酶和脂肪酶活性显著提高[17]。本研究的试验结果与上述研究结果基本一致，饲料脂肪水平的变化对拟穴青蟹仔蟹的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均有显著影响，3种消化酶活性的变化规律均为先增后降。酶是一种具有催化作用的蛋白质，当饲料脂肪水平上升时，饲料中的脂肪足以提供能量，使得蛋白质的利用率升高，从而适应性分泌合成的酶可能也增多[26]。同时，因为投喂饲料的营养成分不同，机体摄入的营养素的量随之不同，机体要适应饲料性质，从而加强对营养物质的吸收和物质之间的转化，提高营养素的吸收利用[16]。但是一味的升高饲料脂肪水平可能会抑制脂肪酶活性[27-28]。此外，高脂肪水平饲料所含总能较高，蛋白质和碳水化合物不需要作为能源物质，其消化酶分泌可能随之适应性降低，并且脂肪氧化后具有一定毒性，也可能进一步降低蛋白质和碳水化合物的利用率[22]。
4 结论饲料脂肪水平过高或过低均会影响拟穴青蟹仔蟹的生长。以WGR为评价指标，通过二元回归分析得出拟穴青蟹仔蟹饲料中最适脂肪水平为7.52%。
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