2. 山东省农科院畜牧兽医研究所, 济南 250100
2. Animal Husbandry and Veterinary Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China
1935年Underwood和Marston分别发现羊的消瘦病是由缺钴引起的，从而确定了钴是动物必需的微量元素，这也是确认的第6种动物必需的微量元素[1]。钴是维生素B12(钴胺素) 的重要活性组分，主要通过维生素B12参与机体造血和营养物质的消化、代谢等，进而影响体内蛋白质、脂肪和糖的代谢。钴在机体代谢过程中，能激活磷酸酶、精氨酸酶和过氧化氢酶，且能抑制细胞色素氧化酶和琥珀酸脱氢酶的活性，改善基础代谢中糖和氮的吸收，促进动物生长[2]。在家兔上，本课题组前期试验发现，饲粮中添加不同水平 (0.1~6.4 mg/kg) 的钴对生长獭兔的日增重和饲料转化效率均没有显著影响[3]。NRC (2005) 在对禽类的研究中发现含硫氨基酸 (尤其是半胱氨酸) 易与钴形成复合物，降低钴的吸收率。Kincaid等[4]研究表明，奶牛干奶期 (尤其是产前55~20 d) 血清中维生素B12的含量下降，饲粮中补充钴可以增加瘤胃中维生素B12的合成量，还可以增加初乳和常乳中维生素B12的含量。Schwarz等[5]对处于生长期的奶牛和成熟奶牛的研究证实机体所需钴的量大于NRC的推荐值。这些结果说明不同物种间对钴的需要量差异较大。
钴也可促进纤维分解菌活动，从而促进纤维消化[6]。动物一旦缺钴，就会出现异嗜、拒食、生长不良、消瘦和贫血等症状，以及血液中维生素B12含量下降、甲基丙二酸和同型半胱胺含量升高、红细胞减少、血红蛋白含量下降等[7-9]。近年来，钴因其具有重要的生物学功能而被营养学家所重视。饲粮中钴可提高动物对饲料尤其是劣质饲料的消化率，Krasnodebska[10]报道，给饲喂半合成饲粮的阉公羊每天补充1 mg钴，可使粗纤维消化率提高13.4%。Singh等[11]给犊牛饲喂低质牧草并补充尿素，再另外补充钴后发现非蛋白氮和其他养分的利用率明显提高。穆秀梅等[12]研究表明，饲料中添加钴和维生素B12有利于断奶羔羊的生长发育，增加羔羊的日增重。Hertz等[13]研究指出，饲料中添加钴使鲤鱼的成活率、受精卵的孵化率、蛋白质的合成率等均有提高或改善。但是目前钴的研究多集中在反刍动物和水产动物方面，在家兔上钴的添加是否也能影响到饲粮中营养物质的消化代谢，目前尚未知。因此，本试验在饲粮中添加不同水平的钴，通过测定饲粮营养物质表观消化率、氮代谢和钴代谢等指标，进一步确定饲粮中钴的添加水平，为确定生长獭兔钴需要量提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验时间、地点饲养试验于2015年10月1日至2015年12月1日在山东农业大学动物科技学院试验基地动物试验舍进行，兔舍为封闭式平房，水泥地板，采用单笼饲养；样品测定在山东农业大学动物科技学院畜牧平台实验室完成。
1.2 试验动物分组与饲养管理选取平均体重为 (855.6±22.0) g的35日龄左右的断奶獭兔200只 (公母各占1/2)，按性别和体重随机分为5组，每组40个重复，每个重复1只试验兔，各组间体重差异不显著 (P>0.05)。5组试验兔分别饲喂在基础饲粮中添加0(对照)、0.1、0.4、1.6、6.4 mg/kg钴的试验饲粮，制成颗粒后钴含量实测值分别为0.27、0.35、0.60、1.83、6.62 mg/kg。基础饲粮参考De Blas等[14]的生长兔饲养标准配制，其组成及营养水平见表 1。钴以硫酸钴[购自广西南宁益维饲料科技有限公司，钴含量为 (1.00±0.05)%，生产批号为20150308-5]的形式进行添加，预试期7 d，正试期53 d。试验兔单笼饲养，试验期间早、晚各饲喂1次。试验前对兔舍、兔笼、料盒和饮水设备进行彻底清洗和消毒，试验期间自然采光和通风，自由采食和饮水，3~5 d带兔消毒兔舍1次。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
饲养试验结束前6 d，每组随机抽取8只试验兔，转移到经消毒处理的代谢笼内，单笼饲养，并饲喂相应的试验饲粮，自由采食和饮水。预试期3 d，预试期后连续3 d收集每只试验兔全天的粪样和尿样，4 ℃密封保存，同时记录每只试验兔每天的采食量、排粪量和排尿量。鲜粪称重后，取其中一部分称重后加10%的硫酸固氮，每天取样比例相同，然后在烘箱中于65 ℃下烘72 h，称重即得粪样的风干重，最后将3 d的风干粪样混合粉碎，混匀后-20 ℃冷冻保存待测。尿样测量后，取一定比例盛入备好的250 mL塑料瓶中，加入5 mL浓硫酸固氮，每天取样比例相同，混匀后置于-20 ℃冷冻保存待测。
在试验开始后的第54天清晨空腹称重，每组随机抽取8只试验兔空腹称重后立即心脏采血10 mL，分离血清，置于-20 ℃冷冻保存待测；屠宰后取组织样品，液氮保存后待测。
1.4 测定指标和方法 1.4.1 饲粮营养物质表观消化率能量通过美国Parr-6200高压氧弹仪进行测定；干物质 (DM) 含量依据GB/T 6435-2006所述方法测定；粗纤维 (CF) 含量采用酸碱洗涤法测定；粗蛋白质 (CP) 含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪 (EE) 含量采用索氏抽提法测定；粗灰分 (Ash) 含量采用高温灼烧法测定；中性洗涤纤维 (NDF)、酸性洗涤纤维 (ADF)、酸性洗涤木质素 (ADL) 含量采用范氏纤维洗涤法测定；钙 (Ca) 含量采用高锰酸钾滴定法测定，磷 (P) 含量采用钼黄比色法测定，钴含量采用GB/T 13884-2003所述方法测定。上述指标具体测定方法参见张丽英[15]主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》。饲粮营养物质表观消化率根据以下公式计算：
饲粮营养物质表观消化率 (%)=100×(食入的营养物质量-粪中相应营养物质量)/食入的营养物质量。
1.4.2 氮代谢指标饲粮、粪和尿中氮含量利用凯氏定氮法进行测定，具体方法参见张丽英[15]主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》。氮代谢指标根据以下公式计算：
可消化氮 (digestible nitrogen，DN，g/d)=食入氮 (nitrogen intake，IN)-粪氮 (fecal nitrogen，FN)；
沉积氮 (retention nitrogen，RN，g/d)=IN-FN-尿氮 (urinary nitrogen，UN)；
氮表观消化率 (nitrogen apparent digestibility，NAD，%)=100×DN/IN；
氮利用率 (nitrogen utilization rate，NUR，%)=100×RN/IN；
氮生物学效价 (nitrogen biological value，NBV，%)=100×RN/DN。
1.4.3 胰腺消化酶活性胰腺胰蛋白酶和糜蛋白酶活性分别采用南京建成生物工程研究所生产的胰蛋白酶测试盒和糜蛋白酶测试盒测定。具体原理为：胰蛋白酶能催化水解底物精氨酸乙酯的酯链，使其在253 nm处的吸光度值升高，根据吸光度值的变化可以计算出酶的活性；而糜蛋白酶可以水解酪蛋白产生含酚的氨基酸，酚试剂可被含酚的氨基酸还原成蓝色物质，通过比色可测定酶的活性。
1.4.4 血清生化指标血清总蛋白 (TP)、白蛋白 (ALB) 和尿素 (UR) 含量均采用日本和光纯药工业株式会社提供的试剂盒，按照试剂盒说明书在日立7020型全自动分析仪上进行测定。
1.4.5 饲粮、粪、尿及组织中钴含量饲粮、粪、肌肉、脾脏、肾脏样品在105 ℃下烘干后，取适量，在马福炉中炭化至无炭粒，然后用HNO3-HClO4(3:1) 消化，煮沸数分钟后冷却，定容过滤，采用原子吸收分光光度法对样品中钴含量进行测定。血清和尿用HNO3-HClO4(4:1) 消化后，采用原子吸收分光光度法测定其中钴含量。
1.5 数据处理与分析用SAS 9.1.3统计软件中的GLM程序进行数据的方差分析，并采用Duncan氏法进行数据的多重比较。
2 结果与分析 2.1 饲粮钴添加水平对断奶至3月龄獭兔饲粮营养物质表观消化率的影响由表 2可以看出，饲粮钴添加水平对饲粮DM、CP和钴的表观消化率均无显著影响 (P>0.05)，但上述指标随饲粮钴添加水平的升高均有先升高后降低的趋势，在1.6 mg/kg钴添加组中DM和CP的表观消化率最高，在0.4 mg/kg钴添加组中钴的表观消化率最高。饲粮钴添加水平对饲粮能量、EE、Ash、CF、NDF、ADF、ADL、Ca和P的表观消化率均无显著影响 (P>0.05)。
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表 2 饲粮钴添加水平对断奶至3月龄獭兔饲粮营养物质表观消化率的影响 Table 2 Effects of dietary Co supplemental level on dietary nutrient apparent digestibility of weaned to 3-month-old Rex rabbits (n=8) |
由表 3可以看出，饲粮钴添加水平对IN有显著影响 (P < 0.05)，与对照组相比，0.1 mg/kg钴添加组IN显著降低 (P < 0.05)。饲粮钴添加水平对UN、RN、NUR有显著影响 (P < 0.05)，随着饲粮钴添加水平的升高，RN和NUR先降低后升高再降低，二者均在钴添加水平为1.6 mg/kg时最高，而UN则逐渐降低。饲粮钴添加水平对FN、DN、NAD、NBV均无显著影响 (P>0.05)。
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表 3 饲粮钴添加水平对断奶至3月龄獭兔氮代谢的影响 Table 3 Effects of dietary Co supplemental level on nitrogen metabolism of weaned to 3-month-old Rex rabbits (n=8) |
由表 4可以看出，饲粮钴添加水平对胰腺胰蛋白酶活性有显著影响 (P < 0.05)，对糜蛋白酶活性无显著影响 (P>0.05)。随着饲粮钴添加水平的升高，胰蛋白酶活性先增加后降低，且在钴添加水平为1.6 mg/kg时最高。
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表 4 饲粮钴添加水平对断奶至3月龄獭兔胰腺消化酶活性的影响 Table 4 Effects of dietary Co supplemental level on digestive enzyme activities in pancreas of weaned to 3-month-old Rex rabbits (n=8) |
由表 5可以看出，饲粮钴添加水平对血清UR含量有显著影响 (P < 0.05)，随着饲粮钴添加水平的升高，血清UR含量先降低后升高，且在钴添加水平为1.6 mg/kg时最低。饲粮钴添加水平对血清TP和ALB含量无显著影响 (P>0.05)。
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表 5 饲粮钴添加水平对断奶至3月龄獭兔血清生化指标的影响 Table 5 Effects of dietary Co supplemental level on serum biochemical indices of weaned to 3-month-old Rex rabbits (n=8) |
由表 6可以看出，饲粮钴添加水平对粪、尿、肌肉、脾脏和肾脏中钴含量均有显著影响 (P < 0.05)，且随着饲粮钴添加水平的升高，钴含量均持续增加。饲粮钴添加水平对血清钴含量无显著影响 (P>0.05)。
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表 6 饲粮钴添加水平对断奶至3月龄獭兔钴代谢的影响 Table 6 Effects of dietary Co supplemental level on Co metabolism of weaned to 3-month-old Rex rabbits (n=8) |
獭兔合成维生素B12需要钴的参与，而维生素B12作为甲基丙二酰辅酶A变位酶和5-甲基四氢叶酸甲基转移酶的辅酶，参与糖的异生过程和蛋氨酸合成。在羊上，Becker等[16]发现缺钴绵羊对CF的表观消化率显著高于不缺钴的绵羊；Pal等[17]发现饲喂0.25 mg/kg BW的硫酸钴显著提高绵羊总碳水化合物、无氮浸出物和CF的消化率。Kadim等[18]比较了饲喂低水平钴饲粮和皮下注射2 000 μg钴山羊的营养物质表观消化率，结果发现低水平钴饲粮使DM、CP、EE的表观消化率和消化能均降低。Lopez-Guisa等[19]指出，在低质饲粮中给青年牛提供高于NRC推荐量的钴 (0.24 mg/kg) 可促进低质饲粮的消化。Tomlinson等[20]报道，钴的营养功能除了通过瘤胃微生物合成维生素B12外，还可提高纤维分解菌的活性，从而促进纤维的消化。然而，Saxena等[21]在犊牛饲粮中添加0.25、0.30、0.40 mg/kg钴后表明，DM、CP、EE和CF的表观消化率均不受钴添加水平的显著影响；Hussein等[22]在体外试验中发现，补加高剂量 (5~30 mg/kg) 的钴对DM和CF的表观消化率没有显著影响；Kišidayovaás等[23]的体外试验也得出，在含钴0.2 mg/kg的基础饲粮中补加钴 (2、4、8 mg/kg) 并不能促进DM、NDF和ADF的降解。本试验结果表明，饲粮钴添加水平对獭兔饲粮中各营养物质的表观消化率均无显著影响，但DM、CP和钴的表观消化率随着饲粮钴添加水平的升高有先升高后降低的趋势。有关钴对营养物质表观消化率影响的研究较多，但结果不尽一致，这说明钴对营养物质表观消化率的影响存在物种差异性。
3.2 饲粮钴添加水平对断奶至3月龄獭兔氮代谢的影响钴作为维生素B12的重要组成部分，与氮的同化、血红素和肌肉蛋白质的合成密切相关[24]。饲粮缺钴，则维生素B12的合成缓慢，影响饲粮中含氮物质的利用[25]。钴能促进喂以非豆科干草的牛对尿素的利用和对纤维素的消化，并能提高牛的生长速度。Mburu等[26]给东非小山羊饲喂缺钴饲粮，与饲喂足够量钴 (硫酸钴形式) 饲粮相比，UN较高，表明瘤胃中饲粮氮的发酵减少，氮的损失增加，可导致生长率降低和身体状况不良。Roginski等[27]报道，饲粮中添加钴使鲤鱼的生长速度、成活率、受精卵的孵化率、蛋白质的合成等均有提高或改善。Anadu等[28]报道，在罗非鱼的饲料中添加氯化钴，会使蛋白质合成加快。在本试验中，饲粮钴添加水平对獭兔FN、DN、NAD、NBV均无显著影响，对IN、UN、RN、NUR有显著影响，随着饲粮钴添加水平的升高，IN、RN和NUR均先降低后升高再降低，UN则逐渐降低，且IN、RN和NUR均在钴添加水平为1.6 mg/kg时达到最大值，说明在獭兔饲粮中添加适宜水平的钴能够提高蛋白质的消化率和利用率，其消化率的提高可能是由于胰腺中蛋白质消化相关酶活性增大所致，而血清中UR含量的降低也间接证明机体蛋白质利用率的提高。血清中TP和ALB含量并未随饲粮钴添加水平的变化而发生显著变化，这与李庆云等[29]在北京鸭饲粮中添加1.0和2.0 mg/kg钴显著提高血浆TP及ALB含量的结果不一致，这可能是由于所研究物种不同所致。
3.3 饲粮钴添加水平对断奶至3月龄獭兔钴代谢的影响利用组织钴含量作为评价钴营养状况的指标，其优点在于样品污染降低，使测定更为准确。饲粮钴吸收的主要部位是小肠后段，与铁部分共享肠黏膜转运通道。动物体内的钴含量较低，为0.03~0.06 mg/kg，其中43%分布于肌肉组织，14%分布于骨组织，其余的43%则分布于其他各种软组织内。钴在肝脏、肾脏中的含量较高、其次是肾上腺、脾脏、胰腺和骨骼组织，其余组织和器官中的含量则较少[30]。血液中钴含量很低而且变化幅度大，全血钴含量为38 μg/dL，而血浆钴含量为0.5~0.7 mg/dL，表明大量的钴存在于红细胞中。血浆中的钴大部分与α-球蛋白和β-球蛋白形成不稳定化合物，少部分以离子形式存在，血液中钴含量可反映饲粮钴营养的状况[31]。在本研究中，血清钴含量未随饲粮钴添加水平的变化而发生显著变化。已有研究表明动物血清中的元素含量相对稳定，一般不受元素添加量的影响，而肝脏是元素主要的代谢器官，受饲粮中元素含量的影响较大，一般与饲粮元素添加量呈正相关[32-34]。在本研究中，獭兔肌肉、肝脏和肾脏中钴含量均随着饲粮钴添加水平的升高而持续增加。钴主要以阳离子形式随尿排出，少量与胆汁一起排泄，未被利用的钴大部分随粪排出，随着饲粮钴添加水平的增加，尤其是6.4 mg/kg钴添加组，其粪和尿中钴含量显著高于其他各组，这可能是由于饲粮中钴添加过量所致。
4 结论综合本试验测定指标，断奶至3月龄獭兔饲粮钴适宜添加水平为0.4~1.6 mg/kg (饲粮中钴含量实测值为0.60~1.83 mg/kg)。
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