鸡蛋是最普通的日常食品，但由于其胆固醇含量较高，严重影响着人们对蛋与蛋制品的消费心理[1]。苜草素中主要有效成分为黄酮 (≥5%)、多糖 (≥15%) 和皂苷 (≥5%)，具有降血脂、抗动脉粥样硬化、提高机体抗氧化和免疫功能作用[2-3]。研究表明，饲粮添加不同水平的苜蓿总甙可以增强肉鸡肝脏和血清谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性，降低血清丙二醛 (MDA) 含量，使动物机体不被脂质过氧化物伤害[4]。Deng等[5]研究发现，含水苜蓿提取物能够显著降低血清和肝脏的总胆固醇 (TC) 以及蛋黄、血清和肝脏的脂质含量，但对血清低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 和高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 含量无显著影响。Zhou等[6]进一步利用数字基因表达分析了苜蓿皂苷提取物降低蛋鸡胆固醇的效果，发现添加120 mg/kg效果最好。另外发现，饲粮中添加苜草素可以显著降低全蛋中的胆固醇和甘油三酯 (TG) 含量[7]，其促进肉仔鸡生长以前期抑制、后期促进的规律出现[8]，所以推测苜草素应该在生长周期长或有严重疾病隐患的情况下应用效果更为理想。苜草素兼有抗氧化与降低胆固醇的功效，但其研究主要集中在应用方面，对其抗氧化与降脂机理方面的研究较少。因此，本试验通过在饲粮中添加不同水平的苜草素，探讨其对产蛋后期蛋鸡生产性能、抗氧化能力、胆固醇代谢及相关基因表达的影响，并对其分子机理做初步探讨，旨在确定其适宜添加水平，为开发饲料资源和蛋鸡产业的可持续发展提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点试验于2015年6月11日至2015年8月21日在山西省大同市大同县建鑫养殖场和山西农业大学动物遗传育种与动物营养省级重点实验室进行。
1.2 试验材料与设计试验用苜草素是一种从紫花苜蓿中提取的天然植物提取物，其有效成分为15%多糖、5%黄酮、5%三萜皂苷，购自四川德阳三丰原科技股份有限公司。试验选用69周龄、健康的海兰褐蛋鸡324只，随机分为3组，每组6个重复，每个重复18只鸡。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮基础上分别添加500和1 000 mg/kg苜草素。试验预试期2周，正试期8周。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验采用3层阶梯式笼养，每笼3只鸡，每天饲喂4次，自由采食和饮水，自然光照补充人工光照到16 h，自然通风结合纵向负压通风，其他均按养殖场常规方法进行。
1.4 样品采集与制备 1.4.1 生产性能试验期间每日记录各重复的产蛋数、产蛋总重量，每7 d结料，记录各重复耗料重，计算各组平均日采食量，然后以组为单位统计产蛋率和料蛋比。
1.4.2 蛋品质试验第14、28、42和55天，每个重复随机抽取3枚鸡蛋测定蛋重、蛋形指数、蛋壳强度、蛋白高度、哈氏单位、蛋黄颜色、蛋壳厚度，取其平均值。试验结束时，每重复选取2枚鸡蛋称重，破壳后分离蛋清蛋黄，使用试剂盒测定蛋黄TC和TG的含量，试剂盒购自南京建成生物工程有限公司。
1.4.3 血浆及组织相关指标试验结束时每重复随机选取1只健康状况良好且体重接近的蛋鸡，空腹翅静脉采血5 mL，3 500 r/min离心10 min制备血浆，分装后-20 ℃保存。随后颈静脉放血致死，采用无菌操作迅速取出同一部位肝脏放入液氮中，置于-80 ℃待测。按照相应试剂盒测定血浆GSH-Px和总超氧化物歧化酶 (T-SOD) 活性，总抗氧化能力 (T-AOC)，MDA、TC、TG含量以及肝脏GSH-Px活性、TC和TG含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.4.4 肝脏总RNA提取和反转录采用Trizol法提取肝脏组织总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳、核酸蛋白仪测定RNA完整性、浓度和纯度。按照反转录试剂盒说明合成cDNA，-20 ℃保存备用。
1.4.5 引物设计根据测序数据库中GSH-Px、胆固醇-7α羟化酶 (CYP7A1)、固醇调节元件结合蛋白-1c (SREBP-1c)、硫氧还蛋白还原酶 (TrxR)1、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 (HMGCR) 的序列，设计其引物 (表 2)，并由华大基因 (北京) 合成。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
以合成的cDNA为模板，按照SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒说明 (购自大连TaKaRa有限公司)，采用20 μL体系，在实时荧光定量PCR仪 (7500，美国ABI公司) 上进行。反应条件为：预变性95 ℃ 30 s，聚合酶链式反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共45个循环。熔解曲线分析程序为：95 ℃ 10 s, 60 ℃ 1 min，随后温度以每10 s 0.5 ℃的速度上升至95 ℃。采用相对定量分析法，以β-肌动蛋白 (β-actin) 作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA表达量。
1.5 数据处理与统计分析采用SPSS 19.0统计软件对数据进行单因素方差分析 (one-way ANOVA)。所有数据以“平均值±标准差”表示，用Duncan氏法比较各组之间指标差异的显著性，采用LSD法对差异显著的数据进行极显著差异比较。
2 结果与分析 2.1 苜草素对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响由表 3可知，饲粮中添加苜草素显著提高了产蛋率、降低了料蛋比 (P < 0.05)，其中以1 000 mg/kg组产蛋率最高 (比对照组增加了9.13%)，料蛋比最低 (比对照组降低了5.98%)，而各组平均蛋重与平均日采食量无显著差异 (P>0.05)。
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表 3 苜草素对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响 Table 3 Effects of polysavone on performance of laying hens during late period of laying |
由表 4可知，饲粮中添加苜草素对蛋白高度、哈氏单位、蛋形指数、蛋黄颜色及蛋壳厚度无显著影响 (P>0.05)，但对蛋壳强度有一定影响，其中以500 mg/kg组蛋壳强度最高且显著高于对照组 (P < 0.05)。
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表 4 苜草素对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响 Table 4 Effects of polysavone on egg quality of laying hens during late period of laying |
由表 5可知，与对照组相比，饲粮中添加1 000 mg/kg苜草素极显著提高了血浆中GSH-Px、T-SOD及肝脏GSH-Px的活性 (P < 0.01)，显著提高了血浆中T-AOC、降低了MDA的含量 (P < 0.05)；添加500 mg/kg苜草素对血浆中GSH-Px活性、T-AOC、MDA含量以及肝脏中GSH-Px活性无显著影响 (P>0.05)，但极显著提高了血浆T-SOD活性 (P < 0.01)。
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表 5 苜草素对产蛋后期蛋鸡抗氧化能力的影响 Table 5 Effects of polysavone on antioxidant ability of laying hens during late period of laying |
由表 6可知，与对照组相比，饲粮中添加1 000 mg/kg苜草素极显著降低了肝脏与蛋黄中TC和TG含量 (P < 0.01)，添加500 mg/kg苜草素极显著降低了肝脏TG含量 (P < 0.01)，显著降低了肝脏TC含量 (P < 0.05)。饲粮添加苜草素对血浆TC和TG含量无显著影响 (P>0.05)。
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表 6 苜草素对产蛋后期蛋鸡脂质代谢的影响 Table 6 Effects of polysavone on lipid metabolism of laying hens during late period of laying |
由表 7可知，与对照组相比，饲粮中添加1 000 mg/kg苜草素极显著提高了肝脏TrxR1、CYP7A1、SREBP-1c的mRNA表达量 (P < 0.01)，极显著降低了HMGCR的mRNA表达量 (P < 0.01)，而对GSH-Px的mRNA表达量无显著影响 (P>0.05)。
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表 7 苜草素对产蛋后期蛋鸡肝脏抗氧化、脂质代谢相关基因mRNA表达量的影响 Table 7 Effects of polysavone on mRNA expression quantity of genes related to antioxidant and lipid metabolism in liver of laying hens during late period of laying |
苜草素中主要活性成分为黄酮、多糖和皂苷。研究表明，饲粮中添加600 mg/kg苜草素可显著降低料蛋比[9]。Mansoub[10]选用500只海兰W-36蛋鸡在其饲粮中添加100、150和200 mg/kg苜草素，发现200 mg/kg组产蛋率和产蛋量最高，而150 mg/kg组饲料转化率最高。谢泰华[11]分别在产蛋前期和产蛋后期蛋鸡饲粮中添加500和1 000 mg/kg苜草素，发现可显著提高产蛋前期蛋鸡产蛋率和平均蛋重，降低平均日采食量和料蛋比，提高产蛋后期蛋鸡产蛋率、降低料蛋比，但对平均蛋重和平均日采食量无显著影响。本试验结果表明，添加苜草素显著提高了蛋鸡的产蛋率，降低了料蛋比，与上述结果基本一致，并且延缓了71周龄以后蛋鸡产蛋率下降趋势。原因可能是苜蓿中的黄酮刺激腺垂体释放卵泡刺激素和黄体生成素，继而促进了卵泡的生长和成熟及卵巢颗粒细胞的生长和增殖，进而提高了产蛋率[12]。
3.2 苜草素对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响评价蛋品质的主要指标包括蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数、蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色等。蛋壳强度和蛋壳厚度直接影响鸡蛋的破损率，哈氏单位直接反映鸡蛋新鲜程度及蛋白品质[13]。研究表明，试验后期苜草素可显著提高蛋壳强度，而蛋壳厚度几乎不受影响[11]。侯永刚等[14]研究发现，饲粮中添加60 mg/kg苜蓿皂苷，除了降低蛋黄和全蛋胆固醇含量外，还显著提高蛋壳厚度、且哈氏单位最高。梁轩等[15]的研究发现，在饲粮中添加苜草素对蛋品质各指标产生影响，但没有一定规律性。本研究结果表明，添加苜草素后蛋壳强度有不同程度增强，但蛋壳厚度无规律性变化，原因可能是苜草素中的苜蓿皂苷促进了蛋壳腺的分泌，多糖可能通过调节钙离子浓度，促进了肠道钙离子的吸收[16]。虽然哈氏单位无显著变化但有增高趋势，说明苜草素中的活性物质增强了鸡蛋蛋白质代谢，从而提高了蛋白质的沉积[17]。
3.3 苜草素对产蛋后期蛋鸡血浆、肝脏抗氧化能力及相关基因表达的影响机体抗氧化能力是影响动物健康的重要因素，而体内GSH-Px、T-SOD、T-AOC、MDA、TrxR等指标均反映机体抗氧化能力。研究表明，苜蓿中的活性物质有增强血清抗氧化性、降低MDA含量以及预防心血管疾病等作用，添加不同水平的苜蓿总甙可以增强肉鸡肝脏和血清GSH-Px活性，降低MDA含量，使动物机体不被脂质过氧化物伤害[4]。本研究结果表明，饲粮中添加1 000 mg/kg苜草素极显著或显著提高了血浆GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC以及肝脏GSH-Px活性和TrxR1 mRNA表达量，降低了血浆MDA的含量，具有提高肝脏GSH-Px mRNA表达量的趋势，表明饲粮中添加苜草素可通过提高抗氧化基因在机体中的表达量增强机体抗氧化能力。
3.4 苜草素对产蛋后期蛋鸡脂质代谢的影响禽类的胆固醇主要在肝脏合成，蛋黄几乎包含了鸡蛋中的全部胆固醇。研究表明，皂苷作为苜草素中主要活性物质，可降低胆汁在肠道中的吸收，随着胆固醇排泄量增加，鸡蛋中胆固醇沉积量随之下降[18]。在饲粮中添加1 000 mg/kg苜草素可显著降低58~65周龄海兰褐蛋鸡蛋黄TG含量[7]，添加500 mg/kg苜草素，肉仔鸡血清TG和TC含量显著降低[3]。本研究表明，饲粮中添加1 000 mg/kg苜草素极显著降低了蛋黄中TC和TG含量，而对血浆TC和TG含量无显著影响，说明苜草素对蛋鸡血液TC与蛋黄胆固醇的作用没有必然相关关系[19]。其原因可能是鸡蛋胆固醇含量由蛋黄中的脂蛋白含量决定，而不是由血液胆固醇含量决定，因此血液中胆固醇含量的增加或降低，并不影响蛋中胆固醇含量的变化趋势[20]。
研究表明，CYP7A1是胆汁酸合成的限速酶，对维持机体胆固醇稳定具有重要作用。SREBP-1c基因属于固醇调节元件结合蛋白家族，当体内胆固醇含量较高时，可促进脂肪酸生成并与胆固醇合成胆固醇酯，从而消耗胆固醇[21]。HMGCR是内源胆固醇合成过程中的限速酶[22-23]，如果抑制了HMGCR活性，机体内源性胆固醇合成则减少。Zhou等[6]通过数字基因表达谱技术评估苜蓿皂苷提取物降低鸡蛋胆固醇含量的分子机理，发现饲喂120 mg/kg苜蓿皂苷60 d后蛋黄胆固醇含量持续下降，且上调了蛋鸡肝脏CYP7A1基因表达量。李宁等[1]在饲粮中添加苜草素，发现添加600、900、1 200 mg/kg苜草素显著降低了蛋鸡肝脏HMGCR mRNA表达量，通过调控HMGCR mRNA的表达可以控制血清和蛋黄中的胆固醇含量。本研究发现，饲粮中添加苜草素显著提高了蛋鸡肝脏CYP7A1与SREBP-1c mRNA表达量，降低了HMGCR mRNA表达量，从而推测苜草素降低肝脏TC和TG含量、导致蛋黄TC和TG含量降低，可能是通过促进胆固醇排泄、抑制胆固醇合成及影响胆固醇逆转运这几种途径来实现的。
4 结论饲粮中添加苜草素可降低产蛋后期蛋鸡蛋黄TC和TG含量，提高生产性能、蛋壳强度、机体抗氧化和胆固醇代谢能力，其适宜添加水平为1 000 mg/kg。
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