牛奶总固形物中乳脂含量高达27%，是构成牛奶的重要物质基础，也是衡量乳品质的重要指标。氨基酸 (AA) 作为乳蛋白合成的主要前体物，不仅影响乳蛋白合成，对乳脂的合成也有影响[1]，因此，深入研究AA对乳脂合成的影响及其机理对改善乳品质有重要的意义。亮氨酸 (Leu) 是动物的必需氨基酸，研究发现，小鼠饲粮缺乏Leu后其白色脂肪组织中的脂肪合成受限制，脂肪酸合成酶 (FASN) 和乙酰辅酶A羧化酶A (ACACA) 基因以及固醇调节元件结合蛋白1c (SREBP1c) 和FASN蛋白的表达显著下降，血清游离脂肪酸和甘油的含量也显著下降[2]。体外研究发现，Leu在影响乳蛋白合成的同时，也促进奶牛乳腺上皮细胞 (BMECs) 内固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP1) 基因的表达和甘油三酯 (TG) 的合成[3]。这些结果提示Leu可能通过影响脂肪合成相关基因的表达促进脂肪合成。然而，采食高脂饲粮的小鼠摄入过量的Leu后，其体重下降，脂肪合成受抑制[4]。也有研究发现小鼠日摄入需要量2倍以上的Leu对血浆胆固醇和TG的合成无显著的影响[5]。可见，Leu对动物脂肪代谢的影响在不同的组织中不完全一样，有关Leu对奶牛乳脂合成的影响及其机理的研究报道很少。鉴于此，本试验以BMECs为模型，研究不同浓度Leu对乳脂合成相关基因及蛋白表达的影响，为进一步探讨Leu对乳脂合成的影响机理提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 主要试剂DMEM/F12基础培养基 (12400-024)、胎牛血清 (FBS，10099-141)、Ⅱ型胶原酶 (17101-015)、胰岛素转铁蛋白硒钠 (51500-056)、细胞培养用青链霉素混合液 (15140-122) 及0.05%胰蛋白酶胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液 (25300054) 均购自Gibco公司。Leu(L8912)、琼脂糖 (A9539)、氢化可的松 (H0135)、催乳素 (L6520)、表皮生长因子 (EGF，E4127)、油红O (O9755)、兔抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) 抗体 (AV32880) 购自Sigma公司。鼠抗SREBP1抗体 (ab3259) 购自Abcam公司。RIPA蛋白裂解液 (P0013C)、苯甲基磺酰氟 (PMSF，ST506)、二喹啉甲酸 (BCA) 蛋白浓度测定试剂盒 (P0012)、Western一抗稀释液 (P0023A)、Western二抗稀释液 (P0023D)、Western十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 电泳液 (P0014B)、Western转膜液 (P0012B)、ECL化学超敏显色液 (P0018) 均购自北京碧云天公司。RNAiso PLUS (D9109B)、PrimeScriptTM RT Master Mix (DRR036A) 和SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒 (DRR820A) 均购自TaKaRa公司。Tris-HCl缓冲液 (TBST)、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 抗体 (10494-1-AP)、辣根过氧化物酶 (HRP) 标记山羊抗兔二抗 (04-15-06)、HRP标记山羊抗鼠二抗 (LK2003) 分别购自HyClone、Proteintech、KPL、三箭公司。无蛋白封闭液 (C520041) 购自上海生工有限公司。
1.2 试剂配制生长培养基的配制：在100 mL的DMEM/F12基础培养基中添加10%胎牛血清、1%胰岛转铁蛋白、1 μg/mL氢化可的松、0.5%胰岛素转铁蛋白硒钠、10 ng/mL表皮生长因子、5 μg/mL催乳素、100 μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素和2.5 μg/mL两性霉素B。
Leu工作液的配制：称取0.118 g的Leu粉末溶于10 mL无血清的生长培养基中，配成浓度为90 mmol/L的Leu贮备液，0.22 μm滤器过滤。用无血清的生长培养基按照梯度稀释法将90 mmol/L的Leu贮备液根据试验要求配制成不同Leu浓度的细胞培养液。
1.3 BMECs的培养采用胶原酶消化法培养BMECs，具体方法参照Sheng等[6]的方法进行。从内蒙古呼和浩特市北亚清真屠宰场选取3~5岁经产的健康泌乳中期的高产荷斯坦奶牛乳腺组织，0~4 ℃条件下运回实验室。从深层取约1 cm3组织块放入3×双抗的磷酸盐缓冲液 (PBS) 中。随后分别用3×双抗的PBS、75%酒精和1×PBS清洗。将腺泡丰富的组织剪成糊状后加入等体积0.5%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化1 h。80目滤网过滤后，179×g离心5 min，弃上清；PBS冲洗细胞，179×g离心3 min，重复冲洗2次。用生长培养基悬浮接种于25 cm2透气培养瓶中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，直至原代细胞贴壁率达约90%后用0.05%胰蛋白酶-EDTA纯化和传代细胞。
1.4 试验设计收集第3代BMECs并悬浮于生长培养基中按照试验要求的密度接种于细胞培养板上，于37 ℃、5% CO2培养24 h。试验采用单因子随机试验设计，将BMECs培养24 h后随机分为6个处理，每个处理6个重复。细胞培养液中Leu的浓度是参考庞学燕[7]和代文婷等[8]的研究结果，然后利用噻唑蓝 (MTT) 法通过细胞的增殖率确定，6个处理Leu的浓度分别为0.45、0.90、1.80、3.60、2.70和7.20 mmol/L，每个处理6个重复。在BMECs贴壁率为80%~90%时，换为无血清的生长培养基，12 h后按照试验设计要求换为不同Leu浓度的细胞培养液，37 ℃、5% CO2培养48 h。
1.5 测试指标与方法 1.5.1 BMECs内TG含量的测定BMECs内TG的含量参考Ramírez-Zacarías等[9]的方法测定，用吸光度 (OD) 值表示其含量，具体方法：将细胞悬液以5×104个/mL的密度接种于24孔培养板，按试验设计培养48 h后，弃培养液，PBS漂洗2次，每孔加入4%多聚甲醛溶液0.2 mL固定细胞1 h后，PBS漂洗2次，0.5 mL油红O工作液避光浸染2 h。然后用PBS漂洗3次，晾干培养板后，加入0.3 mL异丙醇萃取30 min，用全自动酶标仪在波长为510 nm处测定其OD值。
1.5.2 BMECs内乳脂合成相关基因表达的测定BMECs内乳脂合成相关基因的表达采用荧光定量PCR仪 (Thermo，美国) 检测，引物设计使用Primer 5.0进行 (表 1)，测定的基因包括FASN、ACACA、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶 (LPL)、PPARγ、SREBP1、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶 (GPAM)、磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)、黄嘌呤脱氢酶 (XDH)，并以GAPDH为管家基因。将细胞悬液以2×105个/mL的密度接种于24孔培养板，按试验设计培养48 h后提取总RNA。总RNA的提取采用Trizol法，于全自动酶标仪上检测总RNA的纯度与浓度，OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.2范围内表示RNA纯度较好。在2%凝胶上电泳检测RNA完整性。RNA反转录成cDNA的操作步骤按照PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒的说明书进行，反转录体系为10 μL。基因表达量的检测依据SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒的说明书进行操作，反应体系为20 μL。实时荧光定量PCR的反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s；60 ℃退火34 s，95 ℃延伸20 s，进行40个循环；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，51个循环；绘制熔解曲线。采用2-△△Ct法进行目的基因相对表达量的计算。
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表 1 乳脂合成相关基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of genes related with milk fat synthesis |
BMECs内乳脂合成相关蛋白的表达采用蛋白质免疫印迹 (Western blotting) 的方法测定。将细胞悬液以1×106个/mL的密度接种于25 cm2细胞培养瓶，按试验设计培养48 h后，弃上清，PBS清洗贴壁生长的细胞2次，弃去上清，加入含0.1%PMSF的RIPA细胞裂解液250 μL，4 ℃裂解5 min后收集细胞悬液，4 ℃、15 455×g离心10 min，收集上清液检测PPARγ和SREBP1蛋白的表达。将60 μg待检测蛋白样品与5×上样缓冲液按照4:1的比例混合，100 ℃变性5 min后进行电泳，于浓缩胶上80 V电泳40 min，分离胶上120 V电泳100 min。目的蛋白经电泳分离后转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。转膜完成后，用蒸馏水冲洗1 min，室温封闭1 h后，TBST洗涤3次，每次2 min。然后分别用兔抗PPARγ(1:250) 和鼠抗SREBP1(1:50) 于4 ℃孵育过夜，取出PVDF膜后TBST洗涤3次，每次5 min。分别用山羊抗兔二抗 (1:1 000) 和山羊抗鼠二抗 (1:500) 室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次8 min。用ECL化学超敏显色液进行显色，凝胶成像仪上照相分析 (Tanongis-1000，上海天能生物科技公司)。图片用Quantity one软件进行灰度值分析，PPARγ和SREBP1蛋白的相对表达量采用各处理与Leu浓度为0.45 mmol/L的处理的比值表示。
1.6 数据处理所有数据利用Excel 2007进行计算和整理，采用SAS 9.0软件的回归统计程序进行一次线性与二次曲线回归分析，P < 0.05表示回归关系显著，0.05≤P < 0.10表示回归关系趋于显著。
2 结果 2.1 Leu对BMECs内TG含量和乳脂合成相关基因表达的影响由表 2可知，不同浓度 (0.45~7.20 mmol/L) Leu处理的BMECs内TG含量差异不显著 (P>0.05)，但0.90~2.70 mmol/L Leu处理的TG含量在数值上高于其他处理。随着Leu浓度的增加，BMECs内FABP3基因的相对表达量呈显著的一次线性下降 (P=0.018)，LPL基因的相对表达量呈显著的二次曲线下降 (P=0.016)，二者在3.60~7.20 mmol/L Leu处理的相对表达量均较低；BMECs内FASN和ACACA基因的相对表达量均呈显著的二次曲线增加 (P=0.013、P=0.002)，FASN基因的相对表达量以1.80~2.70 mmol/L Leu处理较高，7.20 mmol/L Leu处理较低；BMECs内ACACA基因的相对表达量以1.80~7.20 mmol/L Leu处理较高，其他处理均较低。BMECs内SCD1和PPARγ基因的相对表达量与Leu浓度无显著的回归关系 (P>0.05)，但从数值上看，PPARγ基因的相对表达量以0.90~2.70 mmol/L Leu处理较高，7.20 mmol/L Leu处理最低。BMECs内SREBP1基因的相对表达量随Leu浓度的增加呈显著的二次曲线增加 (P=0.022)，以1.80 mmol/L Leu处理的相对表达量最高，7.20 mmol/L Leu处理的相对表达量最低。BMECs内AGPAT6、GPAM、LPIN1和BTN1A1基因的相对表达量随Leu浓度的增加呈显著的一次线性下降 (P=0.018、P=0.032、P=0.034、P < 0.001)，以0.45~2.70 mmol/L Leu处理的AGPAT6、GPAM和BTN1A1基因的相对表达量较高，以0.45~1.80 mmol/L Leu处理的LPIN1基因的相对表达量较高。BMECs内XDH基因的相对表达量与Leu浓度无显著的回归关系 (P>0.05)。
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表 2 Leu对BMECs内TG含量和乳脂合成相关基因表达的影响 Table 2 Effects of Leu on TG content and expression of genes related with milk fat synthesis in BMECs |
由表 3和图 1可知，BMECs内PPARγ蛋白的相对表达量与Leu浓度无显著的剂量依赖关系 (P>0.05)，但从数值上看，以0.90~2.70 mmol/L Leu处理的相对表达量较高，3.60~7.20 mmol/L Leu处理的相对表达量较低。BMECs内SREBP1蛋白的相对表达量随着Leu浓度的增加呈显著的二次曲线增加 (P=0.032)，以0.90~3.60 mmol/L Leu处理的相对表达量较高，且尤以1.80 mmol/L Leu处理的相对表达量最高，以7.2 mmol/L Leu处理的相对表达量最低。
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表 3 Leu对BMECs内乳脂合成相关蛋白表达的影响 Table 3 Effects of Leu on expression of proteins related with milk fat synthesis in BMECs |
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GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶glycerol phosphate dehydrogenase；PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ peroxisome proliferator-activated receptor gamma；SREBP1：固醇调节元件结合蛋白1 sterol regulatory element binding protein 1。 图 1 Leu对BMECs内乳脂合成相关蛋白表达的影响 Figure 1 Effects of Leu on expression of proteins related with milk fat synthesis in BMECs |
细胞内脂肪酸的自由扩散效率较低，而且不具有生物靶向性，所以大部分脂肪酸的靶向性运输都需要相关转运蛋白的参与[14]。LPL和FABP3基因是参与哺乳动物多种组织中长链脂肪酸 (LCFA) 摄取与细胞内转运的重要基因[15]。在玉米秸秆为粗饲料的条件下，奶牛阴外动脉灌注AA后，乳腺对LCFA的摄取及乳脂中的C18:0、c-9, c-12-C18:2和C18:3含量也下降[16]。本研究结果得出，随着Leu浓度的增加，BMECs内FABP3和LPL基因的相对表达量下降，说明Leu可能抑制BMECs内LCFA的摄入与转运。目前，关于Leu对FABP3和LPL基因表达影响的研究报道极少，有待于进一步研究探讨。
固醇调节元件结合蛋白 (SREBP) 和PPARγ是乳脂合成的重要调控因子。沉默BMECs内SREBP1基因后，ACACA和FASN基因的相对表达量显著下降[17]。用PPARγ的激活剂罗格列酮处理BMECs后，FASN和ACACA基因的相对表达量增加[18]。ACACA是脂肪酸从头合成的一种限速酶，催化乙酰-辅酶A (CoA) 羧化生成丙二酰CoA。FASN是一种多功能的酶系统，以一种代谢酶类参与脂肪的生成和沉积，是体内脂肪合成途径中的一个关键酶。在泌乳期间乳腺内FASN基因编码的蛋白FASN调控中短链脂肪酸 (SMCFA)(C4~C16) 的合成[19]。Cheng等[2]的研究发现，小鼠饲粮缺乏Leu后白脂肪组织中FASN和ACACA基因的相对表达量以及FASN和SREBP1c蛋白的相对表达量显著下降。另有研究发现，Leu上调BMECs内SREBP1基因的表达[3]。本研究结果显示，1.8~2.7 mmol/L的Leu可上调SREBP1和PPARγ基因和蛋白的表达，其靶基因ACACA和FASN的表达也上调。这说明Leu对乳脂的合成有显著的影响，且SREBP1和PPARγ可能参与Leu对乳脂合成的调控；此外，Leu对乳脂合成的影响与剂量有关，1.8~2.7 mmol/L的Leu可促进SMCFA的合成。
GPAM、AGPAT6和LPIN1是参与TG合成的主要基因，同时其编码的蛋白也是参与乳脂合成的关键酶[20]。GPAM催化脂酰CoA结合到甘油-3-磷酸的sn-1位点形成溶血磷脂酸，AGPAT催化第2个脂酰辅酶A结合到甘油-3-磷酸的sn-2位点形成磷脂酸。LPIN1能转移磷酸基团，将磷脂酸转变成二酰甘油，然后，另外一个脂酰CoA酯化到甘油的sn-3位点形成TG。乳腺细胞内的TG在一系列蛋白的作用下形成脂滴。BTN1A1和XDH是参与脂滴形成的主要蛋白[21]。BTN1A1在乳腺细胞分泌时帮助形成乳脂滴，XDH在乳脂肪球和细胞顶膜偶联过程中起重要作用。Leu、异亮氨酸 (Ile) 和缬氨酸 (Val) 等支链氨基酸 (BCAA) 对饲喂高脂饲粮的小鼠肥胖和脂肪代谢平衡具有一定影响，BCAA组小鼠肝脏和肌肉中TG的含量较对照组显著降低[22]。然而，日摄入2倍以上需要量的Leu对小鼠血浆胆固醇和TG的合成无显著的影响[5]。这些研究结果说明Leu对TG合成的影响结果不尽一致。本研究结果表明，高浓度 (3.60~7.20 mmol/L) Leu尽管抑制GPAM和AGPAT6基因的表达，但对TG的合成并没有显著的抑制效果；结果也得出Leu促进了脂肪酸的从头合成，但抑制了与LCFA的摄取与转运有关的基因的表达，这可能是导致其对TG合成影响不显著的主要原因。本研究还得出，高浓度Leu下调脂滴形成相关基因BTN1A1基因的表达。在奶山羊BMECs内，FASN基因干扰后BTN1A1基因的相对表达量和脂滴形成数量显著下降[23]，说明高浓度Leu处理BMECs内BTN1A1基因表达的下调可能与FASN基因表达的下调有关。综合结果得出Leu对脂肪酸从头合成基因FASN和ACACA基因的表达均具有促进作用，且呈剂量依赖关系，FASN基因的表达以1.80~2.70 mmol/L的Leu促进效果较好，ACACA基因的表达以1.80~7.20 mmol/L的Leu促进效果较好；Leu上调SREBP1基因及蛋白的表达，1.80 mmol/L的Leu促进效果最好；Leu抑制FABP3、LPL、AGPAT6、GPAM和BTNIA1基因的表达，但只在添加高浓度 (3.60~7.20 mmol/L) 的Leu时抑制作用较大。综合乳脂合成的多项指标，Leu浓度为1.80~2.70 mmol/L效果较好。
4 结论Leu浓度为1.80~2.70 mmol/L时，对BMECs内FASN、ACACA和SREBP1基因及SREBP1蛋白表达的促进效果较好，对TG合成及脂滴形成相关基因的表达抑制作用较小。
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