硒是动物机体的必需微量元素，作为谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase，GSH-Px) 活性中心的组成成分，硒可以调节体内的氧化还原状态，在机体抗氧化方面也有至关重要的作用[1]。硒还能维持公禽的精液质量，有利于生育繁殖，可维持发育中胚胎的抗氧化系统[2]，且有抗癌作用[3]。硒在生物体内主要以有机硒的形式存在，主要为含硒氨基酸和蛋白质。其中，硒代氨基酸包括硒代胱氨酸 (selenocystine，SeC) 和硒代蛋氨酸 (selenomethionine，SeMet) 等。随着对硒研究的不断深入，人们逐渐意识到通过饮食摄入适量的硒对维持身体健康具有重要的意义，因此富硒鸡蛋受到越来越广泛的关注。国内的补硒剂包括有机硒和以亚硒酸钠 (sodium selenite，SS) 为主的无机硒化合物。SS的利用率和安全系数较低，有些国家已经限制SS作为硒营养补充剂的应用。与无机硒相比，有机硒更易在机体组织器官中存留[2]。作为硒代氨基酸，SeC是一种选择性高、毒性低的抗肿瘤药物，能诱导人类乳腺癌细胞凋亡[4]。硒代半胱氨酸 (selencysteine，SeCys) 可能是人体的第21种必需氨基酸[5]，L-硒代半胱氨酸 (L-selencysteine，L-SeCys) 是SeCys的左旋结构。L-硒甲基硒代半胱氨酸 (L-Se-methylselenocysteine，L-MSC) 是SeCys的甲基化衍生物，为甲基硒的重要前体物质，已被卫生部批准为新型营养强化剂 (食品添加剂新品种2009年第9号公告)，作为第3代补硒营养强化剂和广谱抗癌剂，其应用前景广阔[6]。缺硒会引发健康问题，硒过量也会对机体产生不良影响，我国饲料添加剂安全使用规范 (农业部公告第1224号) 和欧洲管理执行委员会 (commission implementing regulation No.427/2013)[7]均推荐家禽配合饲料中硒的最高限量为0.5 mg/kg。研究表明，蛋中硒含量在饲喂含硒饲粮第4~21天内增加[8-9]，饲粮中添加0.3 mg/kg硒[酵母硒 (YSe) 和SS]对生产性能影响不显著，但显著增加蛋中硒含量[10-12]。目前关于比较SeC、L-MSC、L-SeCys等有机硒与SS对蛋鸡生产性能和蛋中硒含量影响的研究较少。鉴此，本研究旨在比较饲粮中添加相同剂量的SeC、L-MSC、L-SeCys和SS对产蛋鸡生产性能、蛋品质、抗氧化能力、蛋中硒含量和硒转化率的影响，以期为开发新硒源和生产富硒鸡蛋提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料与试验动物试验用硒源见表 1。试验动物为26周龄体况良好、产蛋率接近的海兰灰蛋鸡。
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表 1 试验用硒源 Table 1 Selenium sources used in the experiment |
参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004) 配制基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表 2。试验鸡采用4层立体笼养，每笼3只，采用随机编号安排组位，避免环境和位置的影响。自由采食和饮水，自然光照加人工补光 (16 h/d)，相对湿度50%~60%，自然通风结合纵向负压通风；每天清粪2次，每周消毒1次，常规免疫。预试期1周，正试期4周。
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表 2 基础饲粮组成及营养水平 (风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验选用26周龄体况良好、产蛋率接近的海兰灰蛋鸡450只，随机分为5组，每组6个重复，每个重复15只鸡。对照组饲喂基础饲粮 (不额外补充硒)，SeC、L-MSC、L-SeCys和SS组饲粮在基础饲粮中以不同形式的硒源添加0.30 mg/kg硒，饲粮中硒含量实测值分别为0.08(对照组)、0.36(SeC组)、0.35(L-MSC组)、0.31(L-SeCys组) 和0.37(SS组) mg/kg。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 生产性能每天09:30收蛋，以重复为单位记录蛋重、产蛋数、软破蛋及异形蛋数, 计算平均蛋重和产蛋率。每周定时结料、称重，以重复为单位计算平均日采食量和料蛋比。
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试验第2和4周末，每重复随机取3枚蛋，测定蛋品质。采用SONOVA蛋品质自动分析仪 (Egg AnalyzerTM，Orka Technology Ltd.) 测定蛋重、蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色；蛋壳强度分析仪 (Egg Force Reader，Orka Technology Ltd.) 测定蛋壳强度；蛋壳厚度测定仪 (Eggshell Thickness Gauge，Orka Technology Ltd.) 测定蛋壳厚度；蛋形指数测定仪 (Egg Index Reader，Fujibira Industry Co., Ltd.) 测量蛋形指数。蛋成分分析：全蛋、蛋壳、蛋黄和蛋清分别称重，并统计蛋壳、蛋白和蛋黄比例。
1.4.3 血浆抗氧化指标试验第4周末，每重复随机取2只鸡，空腹翅静脉采集抗凝血，4 000 r/min、4 ℃离心10 min制备血浆，分装，-20 ℃保存。比色法测定血浆GSH-Px活性和总抗氧化能力 (T-AOC)，黄嘌呤氧化酶法测定血浆总超氧化物歧化酶 (T-SOD) 活性，硫代巴比妥酸法测定血浆丙二醛 (MDA) 含量。上述指标均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，严格按照试剂盒说明书操作。
1.4.4 蛋中硒含量利用氢化物-原子荧光光谱法 (GB 5009.93—2010) 测定全蛋液中硒含量。于试验第4周末，每重复随机取2枚蛋，去壳，蛋液混匀，冻干。电热板加热消解：称冻干全蛋粉2 g，置消化瓶，加入10.0 mL混合酸 (硝酸与高氯酸体积比为9 : 1)，放几粒玻璃珠，加盖表面皿，静置过夜，电热板加热，期间及时补加硝酸溶液，溶液变为清亮无色，且有白烟时，继续加热至剩余2 mL，冷却，加入5.0 mL盐酸，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟，此时将六价硒还原为四价。冷却，转移至50 mL容量瓶，定容，混匀备用。取10.0 mL消化液，于15 mL离心管，加盐酸 (6 mol/L)2.0 mL、铁氰化钾 (100 g/L)1.0 mL，混匀。利用原子荧光光谱仪测定硒含量，同时设空白对照 (超纯水) 和标准样品对照 (硒标准参照物GBW8551)。
1.4.5 蛋中硒转化率根据料蛋比，计算蛋中硒转化率：
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采用SPSS 19.0进行单因素方差分析 (one-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，以P < 0.05作为显著性标准，以P < 0.01作为极显著性标准，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析 2.1 胱氨酸类硒源对产蛋鸡生产性能的影响由表 3可知，与SS组和对照组相比，胱氨酸类硒源各组产蛋鸡的平均蛋重、产蛋率和料蛋比均无显著差异 (P>0.05)；L-SeCys组平均日采食量在试验1~2周时显著低于对照组 (P < 0.05)，其余各组平均日采食量无显著差异 (P>0.05)。结果表明，饲粮中添加相同水平的不同硒源，胱氨酸类硒源在一定程度上降低了产蛋鸡的平均日采食量，而对产蛋率、平均蛋重和料蛋比均无显著影响。
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表 3 饲粮中添加胱氨酸类硒源对产蛋鸡生产性能的影响 Table 3 Effects of dietary cystine selenium sources on performance of laying hens |
由表 4可知，与SS组和对照组相比，胱氨酸类硒源各组产蛋鸡的蛋白高度、哈氏单位、蛋壳强度、蛋形指数、蛋黄和蛋白比例均无显著差异 (P>0.05)，但胱氨酸类硒源各组第4周末的哈氏单位均高于SS组，且各试验组的蛋白高度均高于对照组。试验第4周末，SS组蛋黄颜色显著高于其他各组 (P < 0.05)；SeC和SS组蛋壳厚度显著高于其他各组 (P < 0.05)，L-MSC和L-SeCys组蛋壳厚度显著高于对照组 (P < 0.05)；对照组的蛋壳比例显著低于各试验组 (P < 0.05)。结果表明，蛋鸡饲粮中补充适量硒能提高蛋黄颜色，增加蛋壳厚度和蛋壳比例，在一定程度上提高蛋白高度和哈氏单位。
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表 4 饲粮中添加胱氨酸类硒源对产蛋鸡蛋品质的影响 Table 4 Effects of dietary cystine selenium sources on egg quality of laying hens |
由表 5可知，与SS组和对照组相比，胱氨酸类硒源各组产蛋鸡的血浆GSH-Px活性显著升高 (P < 0.05)，SeC、L-SeCys和L-MSC组的血浆GSH-Px活性分别比SS组提高了141.42%、83.59%和117.33%。胱氨酸类硒源各组的血浆T-SOD活性与SS组相比无显著差异 (P>0.05)，SeC和SS组血浆T-SOD活性显著高于对照组 (P < 0.05)，L-SeCys和L-MSC组血浆T-SOD活性也高于对照组 (P>0.05)。胱氨酸类硒源各组的血浆MDA含量与SS组相比无显著差异 (P>0.05)。对照组血浆T-AOC显著低于其他各组 (P < 0.05)，L-MSC组的血浆T-AOC最高，显著高于SS组 (P < 0.05)。结果表明，饲粮中添加硒源能提高产蛋鸡的机体抗氧化水平。
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表 5 饲粮中添加胱氨酸类硒源对产蛋鸡血浆抗氧化指标的影响s Table 5 Effects of dietary cystine selenium sources on plasma antioxidant indexes of laying hens |
由表 6可知，与对照组相比，饲粮中添加胱氨酸类硒源显著提高了蛋中硒含量 (P < 0.05)，其中L-MSC组最高；与SS组相比，SeC、L-MSC和L-SeCys组蛋中硒含量分别提高了12.00%、27.90%和4.63%(P>0.05)。硒源对蛋中硒转化率有一定的影响，4种硒源蛋中硒转化率顺序为L-MSC>L-SeCys>SeC>SS；胱氨酸类硒源各组蛋中硒转化率均高于SS组 (P>0.05)。
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表 6 饲粮中添加胱氨酸类硒源对产蛋鸡蛋中硒含量和硒转化率的影响 Table 6 Effects of dietary cystine selenium sources on selenium content and selenium conversion rate in egg of laying hens |
硒是人和动物机体必需的微量元素之一，缺硒会引发克山病、骨节病和地氟病等疾病，硒还具有抗氧化、抗应激、提高免疫力和抗癌等功能[12]。本试验表明，与SS组相比，饲粮中添加0.3 mg/kg硒 (胱氨酸类硒源) 对产蛋鸡的生产性能无显著影响。研究表明，饲粮中添加0.3 mg/kg硒 (SeMet、YSe和SS) 对蛋鸡的生产性能无显著影响，0.1、0.3和0.5 mg/kg硒 (SeMet) 对蛋鸡的生产性能也无显著影响[8]；有机硒或无机硒对蛋鸡的生产性能也无显著影响[10-11, 13]；富硒益生菌能显著增加蛋鸡的产蛋率和平均蛋重，降低料蛋比，这与益生菌直接相关[14]。蛋鸡的生产性能和对硒元素的敏感性受饲粮和蛋鸡的品种、日龄及机体代谢情况等因素的影响，所以饲粮中添加不同来源和水平的硒对生产性能的影响有别[15]。本试验选用了开产到高峰期过度的海兰灰蛋鸡，鸡体内的代谢和抗氧化能力均处于旺盛时期，生产性能受外界饲粮因素的影响较小；试验1~2周，L-SeCys组的平均日采食量显著低于对照组，但与SS组相比无显著差异，可能是因为试验初期蛋鸡未适应饲粮中添加的硒源；随着饲喂时间的延长，各组的平均日采食量无显著差异，产蛋率和平均蛋重均在增加，与SS相比，SeC、L-MSC、L-SeCys对蛋鸡生产性能的改善作用更强。
3.2 胱氨酸类硒源对产蛋鸡蛋品质的影响蛋鸡品种、产蛋日龄、营养水平和疾病等均影响蛋品质。蛋白高度和哈氏单位是衡量鸡蛋蛋白质量和新鲜度的重要指标[14]。研究表明，饲粮中添加0.3 mg/kg硒，YSe组蛋鸡的哈氏单位高于SS组，但差异不显著[11]。本试验研究表明，胱氨酸类硒源各组第4周末产蛋鸡的哈氏单位均高于SS组，且各试验组的蛋白高度均高于对照组，说明胱氨酸类硒源有提高哈氏单位的趋势。孙庆艳等[15]研究表明，饲粮添加不同来源和水平的硒，对常规蛋品质均无显著影响，但与对照组相比，添加硒组的蛋壳厚度略有增加，蛋黄颜色均有加深。本试验研究表明，饲粮中添加胱氨酸类硒源和SS对产蛋鸡的蛋形指数和蛋壳强度均无显著影响；试验第4周，SeC和SS组蛋壳厚度相同，显著高于其他各组，L-MSC和L-SeCys组蛋壳厚度显著低于SS组，对照组的蛋壳厚度显著低于各试验组。研究表明，YSe能够增加蛋壳厚度，但无显著差异[14]，说明硒能改善鸡蛋的蛋壳品质，可能是通过提高抗氧化能力来保护蛋壳[15]，SeC和SS对蛋壳厚度的作用效果优于L-MSC和L-SeCys。
3.3 胱氨酸类硒源对产蛋鸡血浆抗氧化能力的影响机体的健康程度与其抗氧化能力密不可分。硒是GSH-Px活性中心的必需组成成分，还可通过其他含硒酶或硒蛋白质调节机体的抗氧化能力，通过清除体内自由基而发挥抗氧化损伤作用，可防止大分子发生氧化应激反应[16]，在机体抗氧化防御系统中发挥着重要的作用。研究表明，0.3 mg/kg硒 (SeMet) 可显著提高全血中硒含量和GSH-Px活性[5]，0.3 mg/kg硒 (SeMet、YSe和SS) 均显著提高了血浆GSH-Px和T-SOD活性[8]。本研究表明，与SS组和对照组相比，胱氨酸类硒源各组产蛋鸡的血浆GSH-Px活性显著升高。研究表明，血液中硒含量与血浆T-SOD活性有密切关系，T-SOD活性可以相对反映出硒在体内清除自由基的程度，GSH-Px活性升高可减少过氧化物对T-SOD的损害[17]。GSH-Px和T-SOD是机体抗氧化系统的重要抗氧化酶，T-SOD能够将免疫反应中产生的超氧阴离子自由基 (O2-·) 转化为过氧化氢 (H2O2)，再通过GSH-Px和过氧化氢酶 (CAT) 作用转化为H2O和O2，从而提高机体的抗氧化能力。本试验研究表明，胱氨酸类硒源各组产蛋鸡的血浆T-SOD活性与SS组相比无显著差异，但SeC和SS组血浆T-SOD活性显著高于对照组。研究表明，0.2、0.5和1.0 mg/kg硒 (YSe和SS) 均能显著提高蛋鸡全血T-SOD活性[14]。
T-AOC是衡量机体抗氧化能力的综合指标[15]，食用有机硒能极显著提高肝脏的T-AOC[18]。本试验结果表明，胱氨酸类硒源各组产蛋鸡的血浆T-AOC均高于SS组，其中L-MSC组的血浆T-AOC最高，显著高于SS组；与对照组相比，饲粮中添加不同硒源均显著提高了血浆T-AOC。有机硒提高T-AOC，主要与GSH-Px活性的提高有关，有机硒中的硒比SS更容易构成GSH-Px的活性中心[18]。
MDA是机体脂质过氧化的产物，随着体内氧自由基的活性增强，氧化作用增强，MDA含量升高，抗氧化作用减弱。研究表明，YSe可极显著降低血清MDA含量[15, 19]，显著降低肝脏MDA含量，提高肉鸡血浆GSH-Px活性，极显著提高肝脏T-AOC[18]。本试验结果表明，胱氨酸类硒源各组的血浆MDA含量与SS组相比无显著差异；与对照组相比，饲粮中添加不同硒源均降低了血浆MDA含量。因为饲粮中添加一定量硒元素能提高GSH-Px和T-SOD的活性，后者能抑制MDA的产生，从而减少过多自由基对机体的伤害[19]。血液中硒含量与饲粮中硒水平呈显著线性关系 (R2=0.968，P < 0.001)[7]。
3.4 胱氨酸类硒源对产蛋鸡蛋中硒含量和硒转化率的影响硒是人体必需的微量元素之一，主要源于食物。鸡蛋是人类膳食的重要组成部分，故可通过提高鸡蛋中硒含量来达到补充硒的目的。研究表明，鸡蛋中硒含量与饲粮中硒水平呈线性关系[10, 14, 20]。饲喂含硒饲粮后，蛋中硒元素在2 d后开始沉积，7 d达到高峰[21]；更换饲粮4周后，蛋中硒含量下降到正常水平[22]。白来航蛋鸡饲粮中添加0.3 mg/kg硒的不同硒源均能显著提高蛋中硒含量[4]。研究表明，饲粮中添加相同水平 (0.3 mg/kg硒) 的4种硒源均能显著提高蛋中硒的沉积量[15]，提高第4和8周末蛋中硒含量[13]。饲粮中添加0~0.5 mg/kg硒，蛋中硒含量呈线性增加[7]。本研究表明，与SS组相比，饲粮中添加0.3 mg/kg硒 (SeC、L-MSC和L-SeCys) 均提高了蛋中硒含量，其中，L-MSC组的蛋中硒含量最高；与对照组相比，饲粮中添加胱氨酸类硒源均提高了蛋中硒含量。前人研究表明，饲粮中添加相同水平的不同硒源，有机硒组蛋中硒含量显著高于无机硒组[11, 13]。
富硒蛋中硒含量为200~500 μg/kg (DB36/T 566—2009、DB6124.01—2010)，本试验SeC、L-MSC、L-SeCys、SS组蛋中硒含量分别为200.70、229.20、187.50和179.20 μg/kg，均达到或接近富硒蛋标准。关于硒摄入的每日推荐量，不同地区的规定有别。我国《营养素补充剂申报与审评规定 (试行)》中规定，硒的摄取量最低为15 μg/d；国际学术组织联合会 (FAO/WHO/IAEA) 规定男女成人膳食中硒最低需要量分别为21和16 μg/d，建议膳食中硒最适生理需要量为41 μg/d[23]；美国科学院食物及营养组提出美国男女成人每日膳食中硒供给量分别为70及55 μg/d[24]。每天食用2~3枚L-MSC组鸡蛋即能满足机体对硒的需要量。
有研究指出，硒在小肠中被吸收，有机硒可主动穿过肠壁，生物利用率高，无机硒只能通过被动扩散进入肠壁[3]，故有机硒的沉积效果远优于无机硒[7, 10]，所以本试验中有机硒各组的蛋中硒转化率高于SS组，与前人的研究结果一致[12, 14-15]。本研究结果也表明，各试验组蛋中硒转化率均显著低于对照组，这与胡华锋等[25]研究结果相一致。硒供应不足时，家禽会动员体内储存的硒来维持健康[26]，满足部分需要；家禽也会更好地利用摄入的有限的硒源维持蛋中硒含量，故对照组蛋中硒转化率最高。
本研究表明，L-MSC和SeC作为饲粮中硒源补充剂能够显著提高产蛋鸡蛋中硒含量，具有实践应用性。L-MSC具有抗氧化、抗衰老、治疗心脑血管疾病和解重金属毒等作用[4]，还是一种有效的细胞增长抑制剂，能有效抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，能抑制多种癌基因的表达[27]。2002年，L-MSC被美国食品药品监督管理局 (FDA) 认定为最新一代硒源类饮食补充剂，2009年被我国批准为新型食品营养强化剂。所以富含L-MSC的鸡蛋不仅可以增强机体的抗氧化能力，也具有一定的防癌功效。
4 结论① 与SS相比，饲粮中添加0.3 mg/kg硒 (SeC、L-MSC、L-SeCys)，未见显著影响海兰灰蛋鸡的生产性能和除蛋壳厚度、蛋黄颜色以外的蛋品质指标。
② 与SS相比，3种胱氨酸类硒源均可提高产蛋鸡的血浆GSH-Px活性和T-AOC，显著增强机体抗氧化水平，其中SeC和L-MSC效果更好。
③ 3种胱氨酸类硒源均能提高蛋中硒含量，L-MSC在蛋中沉积效果更好。
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