2. 湖南畜禽安全生产协同创新中心, 长沙 410128
, ZHAO Jing1, XIANG Siting1, WANG Xihong1, HUANG Lin1, YI Xianglian1, ZHU Ruocen1, WU Jing1
, YI Jin1,2
2. Hunan Co-Innovation Center of Animal Production Safety, Changsha 410128, China
地塞米松 (dexamethasone, Dex) 是一种长效的糖皮质激素类药物。研究认为，血浆中糖皮质激素含量升高是应激反应的重要标志，因此可将某些应激时动物体内发生变化的理化指标作为应激因子，反过来刺激动物产生应激，如注射Dex可作为应激源[1-2]。此外，大量的研究表明，Dex能降低细胞的活力，促进活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 的产生，抑制抗氧化酶的活性，降低骨钙素基因的表达，从而导致细胞的氧化应激和免疫抑制[3-5]。研究发现，自然界的很多天然活性物质能调控机体的氧化应激和免疫反应，保障机体细胞内外环境的稳定和生理机能正常。
桦木酸 (betulinic acid, BA) 属于植物源性羽扇豆烷型五环三萜类物质，广泛分布桦木科、桃金娘科、鼠李科、五加科等多种植物中，BA具有抗肿瘤、抗微生物、抗炎、抗寄生虫、抗溃疡、免疫调节作用，抗氧化应激及抗疟等多种较强的生物活性[6-8]。本课题组前期研究发现，BA对Dex所致的氧化损伤具有保护作用，这种保护作用主要通过改善机体的氧化还原体系，降低脂质过氧化作用，缓解ROS对线粒体膜的损伤，恢复线粒体功能[9]。进一步研究发现，BA通过促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制促凋亡蛋白Bax表达，降低caspase-9和caspase-3表达，从线粒体信号通路抑制Dex所致淋巴细胞的凋亡，从而提高机体的免疫力和抗氧化应激的能力[10]。因此，BA作为免疫调节剂和抗氧化剂在动物健康养殖方面具有广阔的应用前景。BA是否对Dex引起的血清指标具有改善作用，还未见报道。本试验采用腹腔注射Dex诱导小鼠氧化应激模型，研究BA对Dex引起的小鼠血清指标变化的影响，旨为BA在畜牧业中的应用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料BA，以白桦树皮 (2016年春季收集于吉林省长春市，经60 ℃烘干后贮藏在黑暗、干燥处备用) 为原料，从白桦树皮中提取桦木醇，经琼斯试剂氧化制备中间产物桦木酮酸后，用硼氢化钠还原合成BA。具体按参考文献[11]制备。高效液相色谱 (HPLC) 法测定BA纯度为96.53%。
Dex磷酸钠注射液 (5 mg/mL, 濮阳市汇元药业有限公司)；谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)、碱性磷酸酶 (ALP) 活性，总蛋白 (TP)、白蛋白 (ALB)、总胆固醇 (TC)、甘油三脂 (TG)、总胆红素 (T-Bil) 和钙离子 (Ca2+) 含量测定试剂盒以及BS-200全自动生化分析仪均为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司产品；小鼠细胞色素C酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司；总抗氧化能力 (T-AOC)、抑制羟自由基能力、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性、谷胱甘肽 (GSH) 和丙二醛 (MDA) 含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 试验动物与饲粮试验动物为40只健康雄性昆明小鼠，4周龄，无特定病原体 (SPF) 级，体重为 (20±2) g。饲粮为小鼠普通育成料，由湖南斯莱克景达试验动物有限公司提供，主要原料为小麦、玉米、豆油、麸皮、豆粕、鱼粉、麦芽糊精、酵母、草粉和预混料，营养水平 (风干基础) 如下：粗蛋白质 (CP)20.50%、粗脂肪 (EE)4.62%、钙 (Ca)1.23%、磷 (P)0.91%、赖氨酸 (Lys)1.30%、蛋氨酸+半胱氨酸 (Met+Cys)0.68%。
1.3 试验方法将40只健康雄性昆明小鼠置于室温[(22~25) ℃]、相对湿度为50%~70%的动物饲养室，饲养1周后，小鼠随机分为5组，即对照 (normal control, NC) 组、Dex组、0.25 mg/kg BA组、0.50 mg/kg BA组、1.00 mg/kg BA组，每组8只。
取设定剂量的BA混悬于1%的可溶性淀粉溶液中，按0.01 mL/g BW给低、中、高剂量BA+Dex组小鼠灌胃，NC组和Dex组小鼠灌服1%可溶性淀粉溶液，每天09：00给药1次，连续14 d。第14天17：00 0.25 mg/kg BA组、0.50 mg/kg BA组、1.00 mg/kg BA组和Dex组小鼠腹腔注射Dex，诱导氧化应激模型，NC组小鼠腹腔注射生理盐水。
禁食15 h (自由饮水) 后，眼眶采血扑杀，收集血液，室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，收集血清。
用全自动生化分析仪检测血清中ALP、ALT、AST活性，TP、ALB、TC、TG、T-Bil和Ca2+含量；用ELISA试剂盒检测血清细胞色素C (CytC) 含量 (竞争法)；血清T-AOC采用化学比色法测定；血清抑制羟自由基能力采用Fenton反应法测定；血清SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定；血清GSH含量采用二硫代二硝基苯甲酸法测定；血清MDA含量采用硫代巴比妥酸显色法测定。
1.4 数据分析与处理采用SPSS 17.0软件对统计数据，采用单因素方差法分析数据，两两比较采用q检验，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05为差异显著。
2 结果 2.1 BA对小鼠体重的影响在连续灌胃BA 14 d中，小鼠未出现任何异常反应及死亡现象。BA对小鼠体重的影响见表 1，各组小鼠体重无显著的差异 (P>0.05)。
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表 1 BA对小鼠体重的影响 Table 1 Effects of BA on body weight of mice |
BA对血清酶活性的影响见表 2，与NC组相比，Dex组血清ALT和AST活性极显著升高 (P < 0.01)，血清ALP活性也升高，但差异不显著 (P>0.05)。与Dex组相比，各BA剂量组血清ALP的活性极显著降低 (P < 0.01)，且呈量效关系；与Dex组相比，各BA剂量组血清ALT和AST的活性降低，但差异不显著 (P>0.05)。
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表 2 BA对小鼠血清酶活性的影响 Table 2 Effects of BA on serum enzyme activities of mice |
BA对血清TC和TG含量的影响见表 3，与NC组相比，Dex组的血清TC和TG的含量均极显著升高 (P < 0.01)。与Dex组相比，0.50 mg/kg BA组、1.00 mg/kg BA组血清TG含量极显著下降 (P < 0.01)；0.50 mg/kg BA组血清TC的含量极显著降低 (P < 0.01)。
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表 3 BA对小鼠血清TC和TG含量的影响 Table 3 Effects of BA on serum TC and TG contents of mice |
BA对血清TP和ALB含量的影响见表 4，与NC组相比，Dex组的血清TP和ALB含量的含量均显著或极显著升高 (P < 0.05或P < 0.01)。与Dex组相比，各BA剂量组血清TP和ALB含量无显著差异 (P>0.05)。
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表 4 BA对小鼠血清TP和ALB含量的影响 Table 4 Effects of BA on serum TP and ALB contents of mice |
BA对血清T-Bil、Ca2+和CytC含量的影响见表 5，与NC组相比，Dex组血清中T-Bil和CytC含量极显著升高 (P < 0.01)。与Dex组相比，0.50 mg/kg BA组和1.00 mg/kg BA组血清中T-Bil含量显著或极显著降低 (P < 0.05或P < 0.01)，各BA剂量组血清CytC含量显著或极显著降低 (P < 0.05或P < 0.01)。与NC组相比，Dex组的血清Ca2+含量降低；与Dex组相比，0.50 mg/kg BA组和1.00 mg/kg BA组血清中Ca2+含量显著或极显著升高 (P < 0.05或P < 0.01)，且呈量效关系。
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表 5 BA对小鼠血清T-Bil、Ca2+和CytC含量的影响 Table 5 Effects of BA on serum T-Bil, Ca2+ and CytC contents of mice |
BA对血清抗氧化能力的影响见表 6。与NC组相比，Dex组血清抑制羟自由基能力和GSH含量显著或极显著降低 (P < 0.05或P < 0.01)，MDA的含量极显著升高 (P < 0.01)，T-AOC和SOD活性有所下降，但差异不显著 (P>0.05)。与Dex组相比，各BA剂量组血清T-AOC、抑制羟自由基能力、GSH含量显著或极显著升高 (P < 0.05或P < 0.01)；0.50 mg/kg BA组和1.00 mg/kg BA组血清SOD活性显著升高 (P < 0.05)；0.25 mg/kg BA组和0.50 mg/kg BA组血清MDA含量显著或极显著下降 (P < 0.05或P < 0.01)，但1.00 mg/kg BA组反而极显著上升 (P < 0.01)。
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表 6 BA对小鼠血清抗氧化能力的影响 Table 6 Effects of BA on serum antioxidant capacity of mice |
Dex是一种人工合成的长效的糖皮质激素，有很强的抗炎、抗过敏、抗毒素和抗休克作用，是临床上最常用的皮质激素治疗药物之一。有关研究表明, Dex超生理剂量或长期使用会造成肝脏的损伤[12-14]。ALT、AST和ALP是常用于检测肝脏损伤的指标。在作者前期的研究中，发现BA具有抗氧化损伤的能力，并且对酒精性肝损伤有预防性保护作用[15-17]，另据报道，BA通过上调Bcl-2表达和抗氧化功能对D-氨基半乳糖联合内毒素引起的急性肝衰竭有保护作用[18]。本试验结果显示，用Dex造模后血清AST和ALT活性极显著升高，血清ALP活性有所升高，说明Dex成功诱导氧化应激模型；在氧化应激的状态下，小鼠的肝脏受到了损伤，用BA预处理后，发现血清AST、ALT和ALP活性下降，说明BA对Dex诱导的肝损伤有一定的保护作用。
3.2 BA对血清TC和TG含量的影响糖皮质激素能够促进脂肪的分解，抑制脂肪的合成，从而使TC和TG的含量升高。研究发现，BA能通过调节脂肪和糖类的代谢，具有抗肥胖的作用[19]。作者前期研究发现，BA预处理后，通过降低血清中TC和TG的含量，肝组织MDA含量，增强SOD、CAT以及谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性，来保护酒精诱导的肝损伤，并且这种保护作用可能与BA自身的抗氧化性有关[16]。本试验中，用Dex预处理后，血清中TC和TG的含量极显著升高，用BA处理后，能够极显著降低血清TG含量，并呈剂量依赖，血清TC含量在0.50 mg/kg BA组极显著下降，说明BA对Dex引起的脂质代谢异常具有保护作用。
3.3 BA对血清TP和ALB含量的影响Dex能促进蛋白质的分解，抑制蛋白质的合成。夏伟等[16]报道，BA能显著升高由酒精性肝损伤引起的血清TP和ALB含量的下降。另据研究报道，BA通过减少肺脏和血浆中氧化剂的水平和升高抗氧化剂的水平，减弱急性肠穿孔引起的氧化性肺脏损伤，并对氧化性急性肺脏损伤败血病具有治疗作用[20]。但在本试验的中，Dex显著升高了血清TP和ALB的含量，这可能是腹腔注射Dex后，机体的一种代偿作用，动员机体组织的蛋白质进入血液，导致其血清含量升高。这与贺绍君等[21]研究Dex对肉鸡血清TP和ALB含量的影响是一致的。本试验中，用BA预处理后，血清TP和ALB含量的变化不显著，说明BA对Dex诱导的氧化损伤的蛋白质的代谢影响不大。
3.4 BA对血清T-Bil、Ca2+和CytC含量的影响肝在胆红素代谢中具有摄取、结合和排泄功能，其中任何一种功能障碍，均可引起黄疸。T-Bil的检查情况能反映肝脏损害的程度。本试验中，用Dex处理后，血清T-Bil含量极显著升高，用BA预处理能极显著降低血清T-Bil含量，且呈量效关系，说明BA对Dex诱导的肝损伤具有保护作用。糖皮质激素可以减少小肠和肾小管对Ca2+的吸收，因而可促进尿钙排泄，出现低血钙，引起水肿、骨质疏松。Park等[22]报道，BA具有防止骨损失患者的骨转移和癌症治疗引起的雌激素缺乏的潜力。本试验发现，小鼠腹腔注射Dex，血清Ca2+含量有所下降，而用BA预先处理后，小鼠血清Ca2+含量呈剂量依赖式升高，特别是在1.00 mg/kg BA组，血清Ca2+含量极显著升高。这说明BA能避免Dex引起的低血钙，增强对Ca2+的吸收。CytC和细胞凋亡有着密切的关系，Renz等[23]认为，CytC不仅能进入细胞质诱导凋亡，也可以由凋亡细胞释放到细胞外，检测血清CytC含量可以作为检测细胞凋亡的一个指标。本试验中，用BA预处理后，小鼠血清CytC含量下降，且呈量效关系。这与作者前期发现BA能从线粒体信号通路抑制Dex所致淋巴细胞的凋亡，从而提高机体的免疫力和抗氧化应激的能力[10]的结果是一致的。说明BA能缓解Dex诱导的细胞凋亡。
3.5 BA对血清抗氧化能力的影响BA是一种植物源性的免疫调节剂和抗氧化剂。在作者前期进行体内试验中发现，BA能有效增强小鼠免疫器官抗氧化能力[24]。并且，BA能加速细胞清除ROS自由基，对Dex诱导的氧化损伤有一定的保护作用，此外BA能通过改善肝脏组织中的氧化还原体系，维护抗氧化体系，降低脂质过氧化作用，对酒精诱导肝损伤有预防性的保护作用[3, 16]。本试验结果与此相似，本试验中，注射Dex能使血清抗氧化酶体系能力 (如抑制羟自由基能力、GSH含量) 大大降低，血清MDA含量升高，用BA预处理，能使血清抗氧化酶体系能力增强 (如T-AOC、抑制羟自由基能力、SOD活性、GSH含量)，血清MDA含量在BA低中剂量时极显著下降，值得注意的是BA在高剂量时血清MDA含量极显著升高，这有可能是BA的剂量过高对脂质过氧化起到了相反的作用。
4 结论BA缓解了Dex引起小鼠血清生化指标、抗氧化能力和CytC含量的变化，说明BA对Dex诱导的氧化损伤有预防性的保护作用。
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