2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 矿物元素营养研究室, 北京 100193
2. Mineral Nutrition Research Division, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
1973年,世界卫生组织 (WHO) 和国际营养组织确认硒为人和动物体内必需的微量元素[1]。硒的营养主要是通过与酶蛋白结合发挥抗氧化作用。此外,硒还具有增强机体免疫、促生长、提高繁殖性能、降血脂、抗应激、抗衰老、抗癌等作用。长期以来,饲粮中硒的补充通常以无机硒 (亚硒酸钠) 作为硒源。然而,由于亚硒酸钠毒性较大且生物利用率较低,对动物和环境可能造成潜在的危害。Kim等[2]在猪饲粮中添加0~20 mg/kg酵母硒和亚硒酸钠形式的硒时猪表现出不同的中毒反应,且硒添加水平大于5.0 mg/kg时,随着硒添加水平的继续增加,与酵母硒组相比,亚硒酸钠组的猪中毒症状更严重,主要表现在猪的采食量和日增重大大降低,以及脱毛、蹒跚步态、冠状带分离、血浆谷草转氨酶 (GOT) 活性升高的发生率高等方面。郭军蕊[3]研究了饲粮中添加0~5.0 mg/kg蛋氨酸硒对肉仔鸡的饲用安全性,结果表明,饲粮中添加5.0 mg/kg蛋氨酸硒对1~42日龄肉仔鸡无明显不良影响。然而,关于酵母硒对肉仔鸡的安全性评价尚未见报道。本试验通过测定肉仔鸡生长性能、血液生理和血浆生化指标、器官指数和组织结构变化,以评价玉米-豆粕型饲粮添加不同水平酵母硒对1~21日龄和22~42日龄肉仔鸡的影响,为确定酵母硒在肉仔鸡饲粮中最高添加水平的安全系数提供科学依据,以确保其在肉仔鸡生产中的安全应用。
1 材料与方法 1.1 试验设计与处理试验采用单因子完全随机设计。根据前期试验研究得到的肉仔鸡玉米-豆粕型饲粮中酵母硒形式的硒适宜添加水平为0.15~0.50 mg/kg的结果[4-15],以及农业部颁布的《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南 (试行)》中的有关规定,将0.5 mg/kg看作是肉仔鸡饲粮以酵母硒为硒源时总硒含量的最高限量,共设置4个组,即不添加酵母硒的对照组、硒最高限量组以及分别为硒最高限量组的5和10倍的2个硒高倍剂量添加组,即酵母硒的添加水平分别为0、0.5、2.5和5.0 mg/kg (以硒计)。考虑到饲粮本底中硒含量约为0.1 mg/kg,故酵母硒添加水平分别设为0、0.4、2.4和4.9 mg/kg (以硒计)。
1.2 试验动物与饲粮选用320只健康商品代1日龄爱拔益加 (AA) 肉仔鸡,从中按体重和性别选取288只,随机分为4个组,每个组6个重复 (笼),每个重复12只鸡 (公母各占1/2)。试验期为42 d,分为2个阶段:1~21日龄和22~42日龄。饲养管理和常规免疫按《AA肉仔鸡饲养管理手册》进行。鸡只自由采食和饮水。试验期每天观察记录鸡只健康状况,如有鸡只死亡,立即解剖,观察分析病理死因,并结料。分别于试验期第21和42天以重复 (笼) 为单元称鸡空腹体重和剩料量,计算平均日采食量、平均日增重、料重比和死亡率。
参照NRC (1994)[16]家禽营养需要量中肉仔鸡营养建议量配制试验鸡1~21日龄和22~42日龄的玉米-豆粕型基础饲粮,基础饲粮组成及营养水平见表 1,并按上述组别设置分别在各阶段基础饲粮中通过调整玉米淀粉的用量而配制4种试验饲粮。酵母硒由安琪酵母有限公司提供,硒含量2 265 mg/kg。试验饲粮以粉料喂给。肉仔鸡饲粮中硒含量分析值见表 2。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平 (饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (as-fed basis) |
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表 2 肉仔鸡饲粮中硒含量分析值 Table 2 Analyzed values of selenium contents in broiler diets |
配合试验饲粮时现场采样,粉碎过200目筛后置于封口样品袋中低温干燥保存以备分析粗蛋白质、钙和硒含量。分别于试验鸡的21和42日龄时,所有鸡只禁食而不禁水1夜后,于第2天08:00分别称鸡只空腹个体活重,从每个重复笼中按笼平均体重选取2只鸡 (公母各1只),翅静脉采血10~15 mL。其中,取一份抗凝血测定血液常规生理指标;另一份于3 000 r/min离心20 min,分离血浆并分装,于-20 ℃冻存,以备分析血浆生化指标。各重复 (笼)2只鸡的全血或血浆合为1个分析样品。
于42日龄试验结束采血后,从每组的各重复 (笼) 中按笼平均体重另选取2只鸡 (公母各1只),屠宰后摘取胸腺、法氏囊、脾脏、胰脏、心脏、肺脏、肝脏、肾脏、腺胃和肌胃,另取出十二指肠、空肠和回肠挤出其中内容物,分别称重,计算器官指数;测量十二指肠、空肠、回肠长度,计算小肠各段长度指数;同时观察记录各个脏器的形态变化。
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各脏器称重后,每个组从其中3个重复 (笼) 各取1只公鸡、另3个重复 (笼) 各取1只母鸡的部分肝脏、肾脏、心脏、肺脏和脾脏,放入装有4%福尔马林溶液的棕色瓶中固定,以备制作切片,观测其组织结构变化。
1.4 样品分析 1.4.1 饲料原料和饲粮样品分析样品经浓硝酸和高氯酸湿法消化后,采用IRIS IntrepidⅡ等离子体发射光谱仪 (TE,美国) 测定饲料原料和饲粮中钙含量[17];饲料原料和饲粮中粗蛋白质含量按AOAC (1990)[18]中所述方法测定;酵母硒产品及饲料原料和饲粮中的硒含量采用荧光法[19]测定。
1.4.2 全血、血浆及组织指标分析采用KX-21血细胞自动分析仪 (SYSMEX,日本) 测定血液常规生理指标 (血红蛋白含量、红细胞压积);采用TBA-40FR全自动生化分析仪 (Toshiba,日本) 测定血浆生化指标[乳酸脱氢酶 (LDH)、GOT、谷丙转氨酶 (GPT)、肌酸磷酸激酶 (CK)、碱性磷酸酶 (APK) 活性及尿素氮 (UN)、总蛋白 (TP)、白蛋白 (ALB)、葡萄糖 (GLU)、总胆红素 (TBILL)、肌酐 (CREA)、总胆固醇 (TC) 和甘油三酯 (TG) 含量];采用试剂盒 (南京建成生物工程研究所) 测定血浆谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性。
1.4.3 组织结构检查按Deng等[20]和Ashraf等[21]报道的方法进行组织结构检查。主要步骤为:将固定的标本经水洗、透明、浸蜡、包埋等处理后,制成5 μm的切片,经苏木精-伊红 (HE) 染色后,在显微镜下观察肝脏、肾脏、心脏、肺脏和脾脏组织结构形态变化,并用图像采集系统采集相应组织图像。
1.5 数据统计分析所有数据均用SAS 9.0[22]软件中的一般线性模型 (GLM) 程序进行方差分析,差异显著者,以最小显著差异 (LSD) 法比较平均值间的差异显著性。以0.05作为本研究中各项数据的差异显著性检验水平。数据以平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 酵母硒对肉仔鸡生长性能及死亡率的影响由表 3可知,饲粮添加不同水平酵母硒除对肉仔鸡22~42日龄平均日采食量和1~42日龄平均日增重有显著影响 (P < 0.05) 外,对1~21日龄、22~42日龄和1~42日龄肉仔鸡其他生长性能指标及死亡率均无显著影响 (P>0.05),而对1~42日龄肉仔鸡平均日采食量有影响趋势 (P=0.07)。与对照组相比,饲粮添加0.4和2.4 mg/kg酵母硒显著提高了22~42日龄肉仔鸡平均日采食量 (P < 0.05),饲粮添加0.4、2.4和4.9 mg/kg酵母硒显著提高了1~42日龄肉仔鸡平均日增重 (P < 0.05),而各酵母添加硒之组间差异不显著 (P>0.05)。
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表 3 酵母硒对肉仔鸡生长性能及死亡率的影响 Table 3 Effects of selenium yeast on growth performance and mortality of broilers |
以上结果表明,饲粮添加不同水平酵母硒能显著提高肉仔鸡22~42日龄平均日采食量和1~42日龄平均日增重,而对其他生长性能指标及死亡率均无显著影响。
2.2 酵母硒对肉仔鸡血液血红蛋白含量、红细胞压积及血浆生化指标的影响由表 4可知,饲粮添加不同水平酵母硒对21和42日龄肉仔鸡血液血红蛋白含量及红细胞压积均无显著影响 (P>0.05)。
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表 4 酵母硒对肉仔鸡血液血红蛋白含量、红细胞压积的影响 Table 4 Effects of selenium yeast on HGB content and HCT in the blood of broilers |
由表 5可知,饲粮添加不同水平酵母硒除对21日龄肉仔鸡血浆尿素氮含量和GSH-Px活性以及42日龄血浆GSH-Px活性有显著影响 (P < 0.05) 外,对21和42日龄肉仔鸡血浆其他生化指标均无显著影响 (P>0.05)。与对照组相比,饲粮添加2.4 mg/kg酵母硒显著降低了21日龄肉仔鸡血浆尿素氮含量 (P < 0.05),但各酵母硒添加组之间无显著差异 (P>0.05);随着饲粮酵母硒添加水平的增加,21和42日龄肉仔鸡血浆GSH-Px活性均显著提高 (P < 0.05)。
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表 5 酵母硒对肉仔鸡血浆生化指标的影响 Table 5 Effects of selenium yeast on plasma biochemical parameters of broilers |
由表 6可知,饲粮添加不同水平酵母硒除了有增加42日龄肉仔鸡肌胃指数和空肠指数的趋势 (P=0.07) 外,对其他各器官指数均无显著影响 (P>0.05),且以上内脏器官外观未观测到任何异常变化,表明在本次试验条件下,饲粮添加0.4、2.4和4.9 mg/kg酵母硒不影响肉仔鸡主要内脏器官的发育。
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表 6 酵母硒对42日龄肉仔鸡器官指数的影响 Table 6 Effects of selenium yeast on organ indices of broilers at 42 days of age |
由图 1可见,饲粮添加不同水平酵母硒各组42日龄肉仔鸡心脏未见组织结构变化。各组均表现为心脏被膜光滑;心肌细胞排列紧密、整齐,细胞染色均匀;润盘及横纹间质无炎性细胞浸润;细胞核呈圆形或椭圆形,位于肌细胞的中央。
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图 1 酵母硒对42日龄肉仔鸡心脏组织结构变化的影响 Figure 1 Effects of selenium yeast on heart structural changes of broilers at 42 days of age |
由图 2可见,饲粮添加不同水平酵母硒各组42日龄肉仔鸡肝脏未见组织结构变化。各组均表现为肝小叶呈多角棱柱体,结构完整;肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,界限清晰,呈均匀的网状结构;肝索和肝窦结构完整清晰。
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图 2 酵母硒对42日龄肉仔鸡肝脏组织结构变化的影响 Figure 2 Effects of selenium yeast on liver structural changes of broilers at 42 days of age |
由图 3可见,饲粮添加不同水平酵母硒各组42日龄肉仔鸡肺脏未见组织结构变化。各组肺脏成鲜红色;三级支气管上皮细胞无炎性渗出物;表面微绒毛粗细一致,分布均匀;肺房上皮表面平整,细胞核呈圆形或椭圆形,位于细胞的中央;呼吸毛细管径大小均匀一致,管腔内无异物,上皮细胞表面光滑;呼吸毛细管周围毛细血管丰富。
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图 3 酵母硒对42日龄肉仔鸡脾脏组织结构变化的影响 Figure 3 Effects of selenium yeast on spleen structural changes of broilers at 42 days of age |
由图 4可见,饲粮添加不同水平酵母硒各组42日龄肉仔鸡脾脏未见组织结构变化。各组均表现为脾脏结构清晰完整,脾小结数量和脾小结直径未见变化;中央动脉直径和周围淋巴鞘厚度未见差异。
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图 4 酵母硒对42日龄肉仔鸡肺脏组织结构变化的影响 Figure 4 Effects of selenium yeast on lung structural changes of broilers at 42 days of age |
由图 5可见,饲粮添加不同水平酵母硒各组42日龄肉仔鸡肾脏未见组织结构变化。各组均表现为肾脏皮质部肾小球体积适中,结构正常,囊腔清晰;肾小管上皮细胞胞浆均质红染;髓质小体的集合管上皮细胞胞浆较均质。
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图 5 酵母硒对42日龄肉仔鸡肾脏组织结构变化的影响 Figure 5 Effects of selenium yeast on kidney structural changes of broilers at 42 days of age |
以上结果表明,在本次试验条件下,饲粮添加不同水平酵母硒的肉仔鸡主要内脏器官均未观测到其显微结构和形态的组织结构变化。
3 讨论 3.1 酵母硒对肉仔鸡生长性能及死亡率的影响硒是甲状腺原氨酸脱碘酶Ⅰ(ID-Ⅰ) 的主要组成成分,ID-Ⅰ控制着机体甲状腺激素[三碘甲状腺原氨酸 (T3)、甲状腺素 (T4)]的活性。ID-Ⅰ能催化T4脱碘转变成活性更强的T3,甲状腺激素对于动物体的生长发育起重要作用。研究显示,动物缺硒能引起ID-Ⅰ的活性下降,进而降低了T4向T3的转化速度,使血液T4的含量上升而T3的含量下降。因此,缺硒动物生长受阻的机制可能是其体内生长激素合成量的不足,进而影响机体正常的生理代谢和生长发育。饲粮中添加适宜的有机硒对畜禽生长性能有明显的改善作用。范淳[6]研究表明,饲粮添加0.1~0.2 mg/kg酵母硒形态硒可使生长快速的白羽肉鸡达到较好的日增重和饲料转化效率。林长光等[23]研究表明,饲粮中添加酵母硒或纳米硒,可显著提高仔猪初生窝重和断奶窝重。郭云霞等[24]研究表明,夏季高温条件下在柴鸡饲粮中添加0.5 mg/kg酵母硒形态硒可极显著提高其产蛋率,且添加0.5和1.0 mg/kg酵母硒形态硒均可极显著降低料蛋比。本试验研究表明,饲粮添加不同水平酵母硒能显著提高22~42日龄肉仔鸡平均日采食量和1~42日龄平均日增重,而对其他生长性能及死亡率无显著影响。
3.2 酵母硒对肉仔鸡血液中血红蛋白含量及红细胞压积的影响动物血液中血红蛋白含量、红细胞压积等血液常规指标可作为衡量机体健康状况的依据。本试验研究结果表明,饲粮添加不同水平酵母硒对肉仔鸡21和42日龄血红蛋白含量及红细胞压积均无显著影响。郭军蕊[3]研究结果显示,饲粮中添加高剂量蛋氨酸硒 (总硒含量为5 mg/kg) 对42日龄肉仔鸡血液中血红蛋白含量及红细胞压积均无显著影响,与本试验结果一致。这表明饲粮中添加酵母硒对肉仔鸡血液中血红蛋白含量及红细胞压积无明显影响。
3.3 酵母硒对肉仔鸡血浆生化指标的影响血浆总蛋白和白蛋白的含量在一定程度上可以反映机体蛋白质的合成和代谢状况[25]。尿素氮是动物机体蛋白质消化代谢的主要终末产物。血浆中尿素氮含量可以反映机体蛋白质代谢水平,当血浆尿素氮含量低时,说明蛋白质利用率高。本研究结果表明,与对照组相比,饲粮添加2.4 mg/kg酵母硒显著降低了21日龄肉仔鸡血浆尿素氮含量,而对血浆总蛋白和白蛋白的含量无显著影响。孙春阳等[26]研究结果表明,饲粮中添加葡萄糖氧化酶和酵母硒混合添加剂显著降低了21和42日龄血清尿素氮含量,与本试验结果类似。这说明酵母硒有提高肉仔鸡机体蛋白质利用率的作用。
血浆中谷丙转氨酶和谷草转氨酶是反映机体肝功能的重要指标。当肝脏受到损伤时,血浆谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性会升高。血浆中磷酸肌酸激酶活性能反映出心肌细胞受损的水平。碱性磷酸酶多存在于骨骼及肝脏中,可以将相应底物去磷酸化产生磷酸,然后与钙结合沉积于骨骼中,肝脏或成骨细胞出现损伤时,碱性磷酸酶活性会升高。本试验研究结果显示,饲粮添加不同水平酵母硒对血浆中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶及碱性磷酸酶等活性均无显著影响,这与郭军蕊[3]研究结果相似。这表明饲粮中添加0.4、2.4、4.9 mg/kg酵母硒对肉仔鸡肝脏和心脏均无不良影响。
硒是GSH-Px的必需组成部分,GSH-Px的活性高低可反映机体抗氧化能力强弱。Wang等[27]研究结果表明,饲粮添加不同硒源 (亚硒酸钠、酵母硒) 均显著提高了肉仔鸡血浆GSH-Px活性。王巧莉等[28]研究结果表明,添加酵母硒可显著提高肉鹅血浆中GSH-Px活性。硒是GSH-Px的活性中心,机体中30%~40%的硒以GSH-Px的形式存在,GSH-Px活性与硒在一定水平范围内随硒水平的升高而升髙。本研究结果表明,21和42日龄,各酵母硒添加组随着酵母硒添加水平的增加肉仔鸡血浆GSH-Px活性均显著提高。这说明饲粮添加高水平酵母硒可提高肉仔鸡的抗氧化能力。
3.4 酵母硒对肉仔鸡器官指数的影响免疫器官指数和消化器官指数是反映动物免疫和消化功能的重要参考指标。杜禛等[29]报道,高硒对鸡肠道黏膜有毒性作用,而在本试验中,饲粮添加0.4、2.4、4.9 mg/kg酵母硒对肉仔鸡内脏和胃肠器官指数均无显著影响。本试验中添加的高水平硒并未对鸡肠道黏膜有显著影响,可能与硒添加形态的不同及鸡品种的不同有关。
3.5 酵母硒对肉仔鸡主要组织结构变化的影响祁周约等[30]用硒含量分别为8.06和13.08 mg/kg的高硒玉米配制的高硒饲粮饲喂60日龄的育成鸡,釆集心脏、肝脏、脾脏、胸肌等组织进行病理学检查,发现高硒组以心肌萎缩变形、肝脏灶状坏死为主要症状。尹小平[31]添加12 mg/kg亚硒酸钠形态硒,饲喂柳州黑鸡45 d,病理变化主要表现在心脏、肝脏等实质器官的变性、坏死。本试验中,饲粮添加酵母硒未观测到肉仔鸡心脏等主要内脏器官组织显微结构和形态的组织结构变化。此结果与前人研究结果[30-31]不一致,可能因为本试验的高水平酵母硒组的硒含量更低,且硒的添加形态不同。这表明饲粮添加高水平酵母硒 (2.4、4.9 mg/kg) 不会引起肉仔鸡重要组织结构变化。
本试验中,由于实际测得的基础饲粮硒含量值低于0.10 mg/kg,使得饲粮中添加0.4 mg/kg酵母硒的最高限量组实测总硒含量只为0.41 mg/kg,低于我国农业部于2009年发布的《饲料添加剂安全使用规范》(第1224号) 公告中规定的以酵母硒为硒源时配合饲粮中硒的最高限量0.5 mg/kg。本试验研究结果显示,饲粮添加0.4、2.4、4.9 mg/kg酵母硒并未对肉仔鸡生长性能、血浆生化指标、免疫器官及主要脏器发育造成不良影响,因此,肉仔鸡饲粮中酵母硒的添加水平为0.4 mg/kg,即肉仔鸡饲粮中硒的总量为0.41 mg/kg时,具有10倍多的安全系数,对肉仔鸡饲喂是安全的。
4 结论饲粮添加0.4~4.9 mg/kg的酵母硒对肉仔鸡生长性能、血常规指标、多数血浆生化指标和主要脏器发育均无不良影响,主要内脏均未观测到组织病理学变化,所有鸡只均未出现毒性反应。因此,肉仔鸡饲粮中酵母硒的添加水平为0.4 mg/kg,即肉仔鸡饲粮中硒的总含量为0.41 mg/kg时,具有10倍多的安全系数,对肉仔鸡饲喂是安全的。
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