2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 湖南省畜禽健康 养殖工程技术研究中心, 农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站, 长沙 410125;
3. 湖南省植物功能成分利用协同创新中心, 长沙 410128
2. Scientific Observing and Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in South-Central, Hunan Provincial Engineering Research Center of Healthy Livestock, Ministry of Agriculture, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. Hunan Co-Innovation Center of Utilizing Plant Functional Components, Changsha 410128, China
早期断奶容易导致仔猪腹泻、营养不良，进而影响仔猪生长性能，严重者甚至导致死亡。在饲粮中添加高剂量 (2 500~4 000 mg/kg) 的氧化锌具有提高断奶仔猪的生长性能、促进肠道发育、增强肠道功能、降低腹泻率等功能[1-2]，但长期使用也会带来营养拮抗、消化道紊乱、采食量降低、抑制生长发育、细菌产生耐药性、环境污染等问题[3]。另外，我国规定除了可以在断奶后2周的仔猪饲粮中添加3 000 mg/kg以内的氧化锌外，其他阶段都禁止使用高剂量氧化锌。所以，目前迫切需要研发出绿色、高效的饲用原料或饲料添加剂。我国中药资源丰富，其中除了含有大量的药物成分和生物活性物质[4]，还含有蛋白质、多糖、脂类、维生素和微量元素等营养成分，可以促进动物生长发育、增强机体免疫力和抗氧化功能、改善肠道微生态等[5]。但由于受加工目的、提取方法和工艺条件等因素的影响，中药成分的提取不够完全，中药渣中残留许多与中药原料功效类似的活性成分。因此中药渣也是一笔巨大的资源，如果对其进行进一步加工利用，不仅可以提高中药的综合利用率，节约中药资源，还能减少中药渣对环境的污染。研究表明，由黄芪、山楂、苍术、麦芽、大黄和大青叶等中药组成的芪楂口服液，含有黄芪甲苷、大黄酚和大黄酸等生物活性成分，具有益气扶正、除湿健脾、消食开胃之功效，临床上主要用于动物促生长和增强机体的免疫力[6]。笔者推测，芪楂口服液药渣 (Qi-Zha oral solution residues，QOR) 也具有相同的功效。此外，芪楂口服液药渣经过微生物发酵处理后，其中不仅含有中药的活性成分，还含有微生物细胞及其代谢产物等，可以促进动物的肠道健康。因此，本试验通过研究发酵前后芪楂口服液药渣中营养成分的变化及其对断奶仔猪生长性能、营养物质消化率、肠黏膜形态结构和紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响，探讨芪楂口服液药渣作为断奶仔猪饲料原料或饲料添加剂的可行性。
1 材料与方法 1.1 发酵芪楂口服液药渣制备试验选用芪楂口服液 (黄芪、山楂、苍术、麦芽、大黄和大青叶等中药组成) 的药渣，由湖南圣雅凯生物科技有限公司提供。芪楂口服液主要活性成分为黄芪甲苷、大黄酚和大黄酸等，其中中药活性成分水提率约为70%。取水提后的芪楂口服液药渣 (含水量为40%~60%)，按0.4%的比例接种复合菌种 (含枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌和丁酸梭菌等，活菌量≥2×1010 CFU/g)，置25 ℃以上条件下发酵1周，每天翻动1~2次，发酵后真空干燥，粉碎。
1.2 试验设计试验选用21日龄断奶的杜×长×大杂交仔猪120头 (平均体重6 kg左右)，公母各占1/2，随机分为4个组，每组5个重复，每个重复6头仔猪。4个组分别是对照组 (饲喂基础饲粮，不添加氧化锌)、芪楂口服液药渣组 (基础饲粮中添加5 kg/t芪楂口服液药渣)、发酵芪楂口服液药渣组 (基础饲粮中添加5 kg/t发酵芪楂口服液药渣) 和氧化锌组 (基础饲粮中添加3 000 mg/kg氧化锌)。基础饲粮参照NRC (2012) 营养需要配制成粉料，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平 (饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (as fed-basis) |
动物试验在中国科学院亚热带农业生态研究所新五丰永安实验基地进行，时间为2015年7月16日至2015年8月14日，试验期为28 d。严格按照断奶仔猪管理方案进行饲养，每次饲粮添加量以吃饱后槽内略有余料为度，自由饮水。
1.3 生长性能与腹泻率测定分别于试验第1、7和28天空腹称取每头仔猪的体重，每天记录每栏仔猪的采食量，计算每组仔猪各阶段的平均日采食量 (ADFI)、平均日增重 (ADG) 和料重比 (F/G)。
每天09:00和16:00，观察仔猪肛门处粪便污染情况和栏上残留粪便的形态，确定腹泻仔猪头数，统计每组仔猪的腹泻率。
1.4 发酵前后芪楂口服液药渣中营养成分测定试验开始前，采集发酵前后芪楂口服液药渣，-20 ℃保存，参照张丽英[7]的方法测定干物质 (DM)、粗蛋白质 (CP)、粗脂肪 (EE)、粗纤维 (CF)、酸性洗涤纤维 (ADF)、中性洗涤纤维 (NDF) 和粗灰分 (Ash) 的含量，利用温式全自动量热仪测定总能 (GE)。
1.5 营养物质消化率测定在试验第1和21天，在各组饲粮中添加0.1%的氧化钛作为外源指示剂，采集每组饲粮，-20 ℃保存；在试验第7和28天，清晨采集每栏仔猪的新鲜粪便样品，-20 ℃保存，参照Li等[8]的方法测定DM、CP、EE和GE的消化率。
1.6 肠道形态结构测定取前段空肠和后段回肠组织，用生理盐水冲洗，置于10%中性福尔马林溶液中固定。
将固定的组织经水洗、透明、浸蜡、包埋等处理后，在室温下制备5 μm的切片，经展片、烘片后苏木精-伊红 (HE) 染色，中性树胶封片。在OLYMPUS BX-51显微镜下观察、拍照，测量绒毛高度 (VH)、绒毛宽度 (VW) 和隐窝深度 (CD)，并计算绒毛高度/隐窝深度 (V/C) 值。
1.7 肠道紧密连接蛋白mRNA相对表达量测定分别取前段空肠、后段回肠和结肠组织，生理盐水冲洗，液氮速冻后-80 ℃保存。利用RNA Isolation Solvent试剂提取肠道组织总RNA，PrimeScript RT试剂盒反转录。以β-肌动蛋白 (β-actin) 为内参，利用实时荧光定量PCR技术对肠道紧密连接蛋白闭锁蛋白 (occludin)、紧密连接相关蛋白-1(ZO-1) 进行定量分析。β-actin上、下游引物序列分别为CTGCGGCATCCACGAAACT和AGGGCCGTGATCTCCTTCTG；occludin上、下游引物序列分别为ATGCCTCCTCCCCTTTCG和CGCCCGTCGTGTAGTCTGTC；ZO-1上、下游引物序列分别为TACCCTGCGGCTGGAAGA和GGACGGGACCTGCTCATAACT，基因序列由上海生工合成。反应体系为10 μL：5 μL Luminaris Color Higreen high ROX qPCR Master Mix (2×)，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，2.2 μL Nuclease-free H2O，2 μL cDNA模板。反应程序为：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。
1.8 数据统计与分析利用Execl 2010整理数据后，用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析 (one-way ANOVA)，并用Duncan氏法对各组平均值进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 发酵前后芪楂口服液药渣营养成分的变化由表 2可知，发酵后芪楂口服液药渣中DM、CP、ADF、Ash含量和GE分别比发酵前提高了0.84%、10.70%、3.57%、1.73%和4.20%，CF、NDF和EE含量分别比发酵前降低了55.69%、48.51%和32.45%。
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表 2 发酵前后芪楂口服液药渣的营养成分含量 Table 2 Nutrient contents of QOR before and after fermentation |
由表 3可知，试验第1~7天、第8~28天和第1~28天，各试验组仔猪的ADFI和ADG均无显著差异 (P>0.05)。试验第1~7天，发酵芪楂口服液药渣组仔猪的F/G显著高于其他3组 (P < 0.05)；试验第8~28天和第1~28天，发酵芪楂口服液药渣组仔猪的F/G最低。
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表 3 发酵前后芪楂口服液药渣对断奶仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of QOR and fermented QOR on growth performance of weaned piglets |
由表 4可知，试验各阶段，氧化锌组仔猪的腹泻率均显著低于其他3组 (P < 0.05)。试验第1~7天，芪楂口服液药渣组仔猪的腹泻率稍低于对照组，差异不显著 (P>0.05)；试验第1~28天和第8~28天，芪楂口服液药渣组仔猪的腹泻率均稍高于对照组，但差异均不显著 (P>0.05)。试验各阶段，发酵芪楂口服液药渣组仔猪的腹泻率均稍高于芪楂口服液药渣组，但差异均不显著 (P>0.05)。
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表 4 发酵前后芪楂口服液药渣对断奶仔猪腹泻率的影响 Table 4 Effects of QOR and fermented QOR on diarrhea rate of weaned piglets |
由表 5可知，各试验组试验第7天仔猪的DM、GE、CP和EE消化率和试验第28天仔猪的GE消化率均无显著差异 (P>0.05)。试验第28天，发酵芪楂口服液药渣组仔猪的DM消化率显著低于对照组 (P < 0.05)，与芪楂口服液药渣组和氧化锌组无显著差异 (P>0.05)；发酵芪楂口服液药渣组仔猪的EE消化率显著低于对照组和芪楂口服液药渣组 (P < 0.05)，与氧化锌组无显著差异 (P>0.05)；发酵芪楂口服液药渣组仔猪的CP消化率显著低于对照组和氧化锌组 (P < 0.05)，与芪楂口服液药渣组无显著差异 (P>0.05)。
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表 5 发酵前后芪楂口服液药渣对断奶仔猪营养物质消化率的影响 Table 5 Effects of QOR and fermented QOR on nutrient digestibility of weaned piglets |
由表 6和图 1、图 2可知，芪楂口服液药渣组仔猪的空肠绒毛宽度显著高于对照组 (P < 0.05)。氧化锌组仔猪的空肠绒毛宽度显著高于对照组 (P < 0.05)；回肠绒毛宽度和隐窝深度显著低于对照组 (P < 0.05)，与芪楂口服液药渣组、发酵芪楂口服液药渣组无显著差异 (P>0.05)。氧化锌组仔猪回肠的V/C值显著高于对照组和芪楂口服液药渣组 (P < 0.05)，与发酵芪楂口服液药渣组无显著差异 (P>0.05)。
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表 6 发酵前后芪楂口服液药渣对断奶仔猪肠黏膜形态结构的影响 Table 6 Effects of QOR and fermented QOR on intestinal mucosal morphology of weaned piglets |
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A：对照组；B：芪楂口服液药渣组；C：发酵芪楂口服液药渣组；D：氧化锌组。下图同。 A: Control group; B: QOR group; C: Fermented QOR group; D: Zinc oxide group. The same as below. 图 1 断奶仔猪的空肠形态结构 Figure 1 The jejunum morphology of weaned piglets (100×) |
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图 2 断奶仔猪的回肠形态结构 Figure 2 The ileum morphology of weaned piglets (100×) |
由表 7可知，各试验组仔猪空肠、回肠和结肠的occludin和ZO-1 mRNA相对表达量均无显著差异 (P>0.05)。
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表 7 发酵前后芪楂口服液药渣对断奶仔猪紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响 Table 7 Effects of QOR and fermented QOR on tight junction protein mRNA relative expression of weaned piglets |
受营养、环境和心理等多方面的影响，断奶常导致仔猪生长性能下降、腹泻等应激反应[9]。饲粮中添加发酵中药，可缓解仔猪断奶应激反应，改善其生长性能，降低腹泻率[10]。在本试验中，断奶后第1~28天，在饲粮中添加芪楂口服液药渣和发酵芪楂口服液药渣不影响仔猪的生长性能，但发酵芪楂口服液药渣组仔猪的F/G比芪楂口服液药渣组降低了3.9%，表明发酵芪楂口服液药渣在降低F/G方面具有一定的效果。这可能与芪楂口服液药渣发酵后其中含有的CP、DM和GE含量均有所提高有关。张鹏[11]的研究表明，发酵板蓝根制剂可显著提高仔猪的ADFI和ADG，并降低腹泻率和饲料报酬。韩宇等[12]报道，发酵黄芪能显著提高仔猪的ADG，降低腹泻率。上述研究结果的差异可能与发酵药渣中所含有的有效成分和营养物质不同有一定的关系。据报道，复方中药或复方发酵中药可以显著提高仔猪肠道酶原活性，增强免疫力、抗氧化和抗炎能力，调节肠道菌群平衡，加强消化吸收功能，降低腹泻率[13-14]。而本试验中，饲粮添加芪楂口服液药渣和发酵芪楂口服液药渣后仔猪腹泻率升高，可能与仔猪的消化吸收能力降低、肠道内环境紊乱有关[15]。
3.2 发酵前后芪楂口服液药渣对断奶仔猪营养物质消化率的影响中药中所含的生物活性物质不仅可以提高机体的免疫功能，维持内环境平衡，保护动物机体的健康，而且可以提高营养物质的消化率和利用率[16-17]。例如，中草药本身不仅能刺激仔猪对食物中营养物质 (特别是蛋白质或氨基酸) 的消化吸收[18]，也可以通过直接信号传导机制来调节营养物质的代谢，如氨基酸、一氧化氮 (NO) 和吡咯啉-5-羧酸信号等[19-20]。在本试验中，发酵芪楂口服液药渣组DM、GE、EE和CP消化率在试验第7天时大于、试验第28天时小于对照组和氧化锌组，提示发酵芪楂口服液药渣可在一定程度上提高断奶仔猪前期肠道消化能力，但降低了断奶仔猪后期肠道的消化力。前人研究表明，饲粮中添加一定比例的苍术、山楂、神曲和甘草等中药粉剂，可提高生长猪对饲粮中DM、CP、Ash和CF的表观消化率[21]。而本试验所用的芪楂口服液药渣中，黄芪补中益气，山楂健脾开胃，苍术燥湿健脾，水苏糖调节肠道pH。消化率结果和前人研究结果不太一致，可能与药渣组分及其添加剂量有关。
3.3 发酵前后芪楂口服液药渣对断奶仔猪肠黏膜形态结构的影响肠绒毛高度越大，小肠吸收面积就越大；肠绒毛宽度越大、隐窝越深，消化吸收能力就越差；V/C比值越小，消化吸收功能就越低[22-23]。本试验结果表明，发酵芪楂口服液药渣组空肠和回肠绒毛长度及V/C值大于、绒毛宽度和隐窝深度小于芪楂口服液药渣组，表明发酵芪楂口服液药渣在改善肠道形态结构方面效果更佳。这可能与发酵后药渣有效活性成分发挥更完全的作用、肠道有益菌含量升高有关。另外，本试验还发现，饲粮添加氧化锌后仔猪的V/C值增加；发酵芪楂口服液药渣组空肠和回肠的V/C值与氧化锌组无显著差异，提示其在改善肠道形态结构方面与氧化锌效果相当。Li等[24]也报道，饲粮添加3 000 mg/kg氧化锌能显著增加小肠黏膜的绒毛高度及相关基因的表达，可减少断奶应激对小肠形态结构的损伤，这与本试验结果一致。
3.4 发酵前后芪楂口服液药渣对断奶仔猪紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响occludin和ZO-1常被作为肠道组织紧密连接屏障和通透性功能的指标[25]。张影超等[26]研究表明，仔猪断奶前后紧密连接蛋白mRNA的高表达对仔猪抗腹泻具有重要意义。但在本试验中，试验各组空肠、回肠和结肠的ZO-1和occludin的mRNA相对表达量无显著差异，提示氧化锌和发酵前后芪楂口服液药渣不影响肠上皮细胞的紧密连接，没有改变肠道的通透性。但这与本试验中发酵前后芪楂口服液药渣组仔猪腹泻率升高有所矛盾，具体原因还需进一步深入探究。
4 结论与芪楂口服液药渣相比，饲粮添加发酵芪楂口服液药渣可在一定程度上改善肠道形态结构；并且二者对紧密连接蛋白mRNA相对表达量没有显著影响。虽然发酵前后芪楂口服液药渣预防腹泻的效果不如氧化锌明显，但其来源广泛、价格低廉，可作为饲料原料或饲料添加剂用于养猪生产。
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