紫花苜蓿 (Medicago sativa L.) 是一种高产优质的豆科牧草，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质，且能值较高，具有良好的营养价值、饲用价值和药用价值[1-2]，因此在世界范围内种植广泛。苜蓿生产对于畜牧业的发展有极大影响，近年来我国逐渐开始重视畜牧业，因此苜蓿生产也有了一定规模[3]。
在我国东北和华北等苜蓿主产区由于收获时雨淋造成的损失颇大，因此多采用青贮技术来解决苜蓿保存的问题。青贮作为一种常见的加工技术，能保持青绿饲料的营养，使其适口性好，消化率高，增加其供应时间，但苜蓿蛋白质含量高，可溶性碳水化合物及干物质含量低，缓冲容量高，难于青贮成功[4-5]。青贮添加剂可以有效解决此类问题，常用的青贮添加剂有发酵促进剂、发酵抑制剂和营养性添加剂等。乳酸菌作为发酵促进剂，能促使青贮初期尽快进入乳酸发酵阶段，促进葡萄糖等单糖向乳酸转化，使pH迅速降低，同时抑制蛋白质水解作用，降低氨态氮、乙酸和丁酸浓度，减少酵母菌和霉菌产生。Tabacco等[6]将布氏乳杆菌添加到玉米青贮中，发现其有效抑制肠球菌和肺炎克雷伯菌等有害细菌生长，并提高青贮的有氧稳定性。纤维素酶能分解苜蓿中的纤维素、半纤维素和木质素，并能降解结构性糖类成为乳酸菌可利用的可溶性糖 (WSC)，增加乳酸的发酵底物[7-8]。同时刘振宇等[9]报道，植物细胞壁可经酶制剂降解后被瘤胃微生物利用，使水溶性维生素等有机物的干物质消化率得到提高。含水量对青贮也有较大影响，舒思敏等[10]对扁穗牛鞭草的原料含水量设置75.3%、64.2%、54.6% 3个水平，发现中、低含水量下青贮效果好，青贮料pH和氨态氮浓度较低，乳酸菌数量较多，杂菌数量少。张英等[11]对不同生长时期的王草设置高、半干、低3个含水量青贮，发现半干青贮下王草品质最好。含水量过高或过低均不利于青贮发酵，含水量高会使细胞液糖分过稀，达不到乳酸发酵所需浓度，同时有害菌迅速发酵，青贮品质变差，而含水量过低会抑制部分乳酸菌活性。
目前添加剂在禾本科的青贮中研究较多，近年来各大院校也加强了对提高苜蓿青贮品质的研究，取得一定成果，但针对本试验所使用的添加剂 (乳酸菌和纤维素酶) 浓度的研究尚不多见。本试验结合生产实际，在不同含水量下的青贮苜蓿中添加乳酸菌、纤维素酶以及二者复合物，通过测定其营养品质和发酵品质等的指标变化，阐明其品质变化规律[12]，并选出效果最佳的调控组合，以期为苜蓿青贮时的所需水分条件和添加剂的添加量提供依据，从而稳定、高效地进行苜蓿青贮生产。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验选用苜蓿品种为金皇后，2013年3月15日种植于西北农林科技大学草业科学教学试验区，在2015年5月7日 (现蕾期) 刈割，此时原料品质最好，刈割后分别对含水量为70%(鲜草) 和60%(阴干10 h) 的样品进行青贮。试验所用乳酸菌 (lactic acid bacteria，LA) 添加剂来自昆山佰生优生物科技有限公司，主要成分为保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus) 和植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)，活菌数为106 CFU/g。纤维素酶 (cellulase，CE) 来自国药集团化学试剂有限公司，相对分子质量为52 000~61 000，主要含β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和很高活力的木聚糖酶，酶活力超过15 000 U/g。
1.2 试验设计采用双因素完全随机设计，一因素为含水量，含2个水平，分别为70%和60%；另一因素为添加剂，分4个组，添加剂量为0时作为对照 (CK) 组，其余各组均含3个水平，分别为乳酸菌组 (LA组，3、6、9 mg/kg)、纤维素酶组 (CE组，25、50、100 mg/kg) 以及乳酸菌和纤维素酶混合组 (LA×CE组，3×25、6×50、9×100 mg/kg)，共20个组，每个组3个重复。将原料用铡刀铡成3~4 cm的小段，不同浓度的添加剂喷洒于不同含水量的原料上，对照组喷洒蒸馏水，混合均匀后分别装填到500 mL的塑料瓶中并压实，盖上内盖，用封口膜缠绕，再盖上外盖，用封口膜二次密封。共60个塑料瓶，青贮90 d。
1.3 试验指标测定 1.3.1 感官评定按德国农业协会 (DLG) 青贮饲料感官评定标准及等级，根据气味、状态、色泽进行评分，将青贮饲料评定为优 (16~20分)、可 (10~15分)、中 (5~9分)、下 (0~4分)4个等级[13]。
1.3.2 指标测定 1.3.2.1 营养指标粗蛋白质 (CP) 含量：将5 mL浓硫酸和0.200 0 g样品在350 ℃下消煮50 min后加入过氧化氢，待溶液透明时冷却定容，使用意大利SYSTEA连续流动化学分析仪来测定样品中的氮浓度[14]。
粗脂肪 (EE) 含量：采用索式抽提法，将滤纸包放入抽提腔，倒入石油醚，浸泡过夜后在50 ℃水浴上加热，反复抽提6~8 h后烘干来测得[14]。
粗纤维 (CF) 含量：将样品置于玻璃坩埚中，在SLQ-6CF测定仪上经1.25%硫酸和1.25%氢氧化钠先后消煮后灼烧并烘干来测定[14]。
粗灰分 (Ash) 含量：将样品置于坩埚中，在KSW-4D-11-5马弗炉550 ℃下灰化3 h后测定[14]。
洗涤纤维含量：用Van Soest法在DGX-9053BC-1纤维分析仪 (购自ANKOM公司) 上测定。中性洗涤纤维 (NDF)：将样品装于滤袋，置于托盘上，与中性洗涤剂、无水亚硫酸钠、热稳定α-淀粉酶一起于消煮器中消煮75 min，消煮完后热水冲洗2次，冷水1次，第1次冲洗时加入α-淀粉酶，经丙酮浸泡后烘干称重[14]。酸性洗涤纤维 (ADF)：操作步骤与NDF测定基本相同，但消煮时加入酸性洗涤剂，且冲洗时不加α-淀粉酶[14]。相对饲用价值 (RFV) 的计算：
RFV=[(88.9-0.779ADF)×120/NDF]/1.29[15]。
1.3.2.2 发酵品质pH：称取10 g样品于100 mL锥形瓶中，加入90 mL蒸馏水，搅拌混合均匀，封口膜封口，在4 ℃下静置24 h，经4层纱布过滤后用FE20K pH计 (METTLER TOLEDO，苏黎世，瑞士) 进行测定[10]。
氨态氮/总氮 (AN/TN)：使用苯酚-次氯酸钠比色法。总氮是将浓硫酸、高氯酸与样品于380 ℃消煮3 h后，冷却定容到100 mL容量瓶，取2 mL上清液与等量蒸馏水于SYSTEA连续流动化学分析仪上测得。氨态氮是将氯化钾 (KCl) 与样品振荡过滤，取滤液5 mL于50 mL容量瓶，加碱性苯酚溶液和次氯酸钠溶液，用KCl定容，静置1 h后在UV-3100紫外可见分光光度计560 nm波长下比色测得[16]。
WSC含量：用蒽酮比色法。制作葡萄糖标准曲线，将样品加沸水煮沸10 min，冷却过滤定容，经吸取摇匀后加入蒽酮，在620 nm波长下比色测定吸光度来测得[17]。
1.4 数据处理与统计分析试验数据使用Excel 2010进行处理和统计，结果用平均值±标准差 (X±SD) 表示，采用SPSS 20.0进行单因素方差分析 (one-way ANOVA)，并用Duncan氏法对各组进行多重比较，P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 苜蓿原料的特性本试验青贮原料为现蕾期刈割的苜蓿，苜蓿原料的特性如表 1所示。苜蓿原料含有较高的CP，含量为19.94%；CF含量为27.95%；EE含量较低，为1.77%。苜蓿原料中NDF和ADF含量分别为41.96%和32.95%，RFV为140.34%。
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表 1 苜蓿原料的特性 (干物质基础) Table 1 The characteristics of alfalfa material (DM basis) |
由表 2可见，70%含水量青贮时，6 mg/kg LA组、50 mg/kg CE组以及6×50 mg/kg LA×CE组相比CK组均能显著提高青贮料的CP和EE含量 (P＜0.05)，显著降低CF含量 (P＜0.05)；并且6 mg/kg LA组青贮料的CP和EE含量显著高于3 mg/kg LA组 (P＜0.05)，CF含量显著低于3和9 mg/kg LA组 (P＜0.05)；50 mg/kg CE组青贮料的CP含量显著高于25 mg/kg CE组 (P＜0.05)，CF含量显著低于25和100 mg/kg CE组 (P＜0.05)；6×50 mg/kg LA×CE组青贮料的CP含量显著高于其他LA×CE组 (P＜0.05)，CF含量显著低于其他LA×CE组 (P＜0.05)。
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表 2 不同含水量及添加剂浓度对青贮苜蓿营养成分的影响 Table 2 Effects of different moisture and additive concentration on nutrient component of alfalfa silage |
60%含水量青贮时，6×50 mg/kg组相比CK组能显著提高青贮料的CP含量 (P＜0.05)，显著降低CF含量 (P＜0.05)；同时6×50 mg/kg组相比其余各组能显著提高青贮料的EE含量 (P＜0.05)；6 mg/kg LA组青贮料的CP含量显著高于3和9 mg/kg LA组 (P＜0.05)，而3组之间的CF含量没有显著差异 (P＞0.05)；50 mg/kg CE组青贮料的CP含量显著高于25和50 mg/kg CE组 (P＜0.05)，并且CF含量显著低于25 mg/kg CE组 (P＜0.05)；6×50 mg/kg LA×CE组青贮料的CP和EE含量显著高于其他LA×CE组 (P＜0.05)。
同一添加剂在不同含水量下青贮比较，除9 mg/kg LA组和100 mg/kg CE组外，其余60%含水量下青贮料的CP含量均显著高于70%含水量 (P＜0.05)。除6 mg/kg LA组外，其余60%含水量下青贮料的CF含量均显著低于70%含水量 (P＜0.05)。3 mg/kg LA组及6×50、9×100 mg/kg LA×CE组60%含水量下青贮料的EE含量显著高于70%含水量 (P＜0.05)，而其余各组均无显著差异 (P＞0.05)。青贮料的Ash含量变化无明显规律。并且，含水量、添加剂及含水量×添加剂对青贮料的CP、CF、EE和Ash含量均存在显著影响 (P＜0.05)。
2.3 不同含水量及添加剂浓度对洗涤纤维含量及RFV的影响由表 3可见，苜蓿中的NDF和ADF含量可较为准确地反映出饲料本身被家畜利用的真实情况。70%含水量青贮时，各CE组和LA×CE组以及6 mg/kg LA组青贮料的NDF和ADF含量显著低于CK组 (P＜0.05)，同时RFV显著高于CK组 (P＜0.05)。3和6 mg/kg LA组青贮料的ADF含量显著低于9 mg/kg LA组 (P＜0.05)。50 mg/kg CE组青贮料的ADF含量显著低于25和100 mg/kg CE组 (P＜0.05)。
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表 3 不同含水量及添加剂浓度对青贮苜蓿洗涤纤维和相对饲用价值的影响 Table 3 Effects of different moisture and additive concentration on detergent fiber content and relative feeding value of alfalfa silage |
60%含水量青贮时，各CE组和LA×CE组青贮料的RFV均显著高于CK组 (P＜0.05)，而各LA组的RFV与CK组没有显著差异 (P＞0.05)。所有添加剂组相比CK组均显著降低了青贮料的ADF含量 (P＜0.05)，但仅6×50和9×100 mg/kg LA×CE组显著降低了青贮料的NDF含量 (P＜0.05)。另外，3 mg/kg LA组青贮料的ADF含量显著低于6和9 mg/kg LA组 (P＜0.05)。
同一添加剂在不同含水量下青贮比较，除CK组70%含水量下青贮料的ADF含量显著低于60%含水量 (P＜0.05)、9 mg/kg LA组ADF含量在2含水量下差异不显著 (P＞0.05) 外，其余添加剂组的60%含水量青贮料的ADF含量均显著低于70%含水量 (P＜0.05)。另外60%含水量下的添加剂组相比CK组在青贮料的NDF含量上降低了0~2.1%，RFV上提高了2.69%~16.57%；而70%含水量下青贮料的NDF含量则降低了3.3%~8.05%，RFV提高了10.25%~31.68%，可以看出在70%含水量下添加剂对NDF、ADF含量和RFV的作用效果明显强于60%含水量。并且，含水量、添加剂及含水量×添加剂对青贮苜蓿NDF、ADF含量和RFV均存在显著影响 (P＜0.05)。
2.4 发酵品质测定及感官评分由表 4可见，70%含水量青贮时，与CK组相比，所有添加剂组均显著降低了青贮料的pH (P＜0.05)，25、50 mg/kg CE组与各LA×CE组均显著降低了青贮料的AN/TN (P＜0.05)，各LA组与LA×CE组均显著提高了青贮料的WSC含量 (P＜0.05)。50 mg/kg CE组青贮料的pH显著低于25和100 mg/kg CE组 (P＜0.05)。6×50 mg/kg LA×CE组青贮料的WSC含量显著高于其他LA×CE组 (P＜0.05)。CK组的感官得分最低，仅7分，为中等，表现为丁酸味颇重，叶子结构保持较差，带有褐色。各添加剂组的得分相似，为13~14分，评定等级为尚可，表现为酸味较强，呈淡黄色，但茎叶结构保持较差。
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表 4 不同含水量及添加剂浓度对青贮苜蓿发酵品质的影响 Table 4 Effects of different moisture and additive concentration on fermentation quality of alfalfa silage |
60%含水量青贮时，与CK组相比，所有添加剂组均显著降低了青贮料的pH (P＜0.05)，各LA组和LA×CE组均显著提高了青贮料的WSC含量 (P＜0.05)，各LA×CE组均显著降低了青贮料的AN/TN (P＜0.05)。50 mg/kg CE组青贮料的pH显著低于25和100 mg/kg CE组 (P＜0.05)，6×50 mg/kg LA×CE组青贮料的AN/TN显著低于其余LA×CE组 (P＜0.05)。CK组的感官得分为14，评定等级为尚可，表现为芳香味弱，略有白色，各添加剂组的得分在17~18分，为优等，表现为芳香味浓，色泽与原料相似，但茎叶结构保持较一般。
同一添加剂在不同含水量下青贮比较，除3×25和6×50 mg/kg LA×CE组青贮料的pH在不同含水量下表现为差异不显著 (P＞0.05) 外，其余各组60%含水量下青贮料的pH均显著低于70%含水量 (P＜0.05)，并且LA×CE组相比CK组在60%含水量下青贮料的AN/TN下降了1.19%~2.07%，WSC含量提高了1.35%~1.48%；在70%含水量下青贮料的AN/TN下降了0.99%~1.58%，WSC含量提高了0.52%~1.04%，因此在60%含水量下各添加剂组对pH、AN/TN、WSC含量的作用效果要优于70%含水量。并且，含水量对青贮苜蓿pH和WSC含量存在显著影响 (P＜0.05)，对AN/TN不存在显著影响 (P＞0.05)，添加剂及含水量×添加剂对青贮苜蓿pH、AN/TN和WSC含量均存在显著影响 (P＜0.05)。
3 讨论青贮原料的含水量大小在很大程度上影响着青贮效果，本试验选择70%和60% 2个含水量下的苜蓿进行青贮，结果可以看出，低含水量下青贮的苜蓿相较于高含水量，CP含量和RFV都有了明显的升高，EE含量变化不大，而CF、NDF、ADF的含量都有明显的下降。这是因为高含水量利于腐败菌生长，同时产生的渗出液导致饲草的养分流失较多，影响了青贮效果[18-19]。但半干青贮中干物质含量较高，可溶性碳水化合物含量较高，能够增加发酵底物，得到较低的pH以及较高的乳酸含量[20]。60%含水量下原料中营养成分流失少，相比70%含水量下干物质含量高，且未达到生理干旱，紫花苜蓿的营养被保存的较好，添加剂的使用对青贮的促进作用较为明显。Yang等[21]对含水量分别为85%、75%和65%的多花黑麦草进行青贮，发现65%含水量青贮时效果好，能使原料的WSC等养分浓缩，同时抑制酪酸菌、酵母菌等生长以及酶的作用和植物细胞的呼吸活动，使乳酸发酵占主导地位，相较于75%和85%含水量明显增加了CP含量，降低了CF含量和AN/TN。但苜蓿青贮时含水量过低将会使介质中水的活性降低，自身的产酸菌处于生理干旱状态，青贮中酸度的积累会受到抑制，不利青贮发酵[22]。同样有研究表明，风干后的苜蓿营养损失约30%，风干苜蓿直接青贮与使用添加剂青贮相比，其营养水平与发酵品质差异并不大[18, 23]。
苜蓿由于可溶性碳水化合物含量较低，缓冲能值高，直接青贮较为困难，青贮过程中添加剂的使用可明显改善其发酵品质。乳酸菌是青贮成功的关键之一，数量应达到105 CFU/g才能使pH迅速降低，有害微生物活动受到抑制，减少营养物质的消耗、分解和流失，降低有毒物质如胺等的产生，保证青贮料的质量[8, 24]。同时有报道表明，有氧环境下添加布氏乳杆菌可以改善青贮料的有氧稳定性从而抑制其好气变质[25-26]。本试验中乳酸菌的添加在降低pH上作用明显，可能是因为苜蓿原料上附着的乳酸菌数量得到提升，使乳酸发酵占主导地位，有害菌的生长受到抑制，促进有利发酵[12]，但LA组的AN/TN值与CK组相比降低不显著，这可能是因为乳酸发酵结束后纤维素酶继续作用，使蛋白质等营养物质降解加剧，饲料品质降低[27]。
纤维素酶可降解纤维素、半纤维素和木质素等动物不易消化的物质，并能水解细胞壁，释放内容物，增加乳酸的发酵底物，提高有机物消化率，改善饲草青贮品质[28-29]。本试验中苜蓿青贮添加纤维素酶可有效降低其ADF含量，增加ADF的可消化性，这和Zhang等[30]的研究结果一致，但Sun等[31]在胡枝子和驼绒藜中添加纤维素酶，发现相比对照青贮料的ADF含量没有降低，这可能与植物种类、生理状态、纤维素酶组成、青贮发酵条件等多方面影响有关[32]。李静等[33]在稻草青贮中添加乳酸菌和纤维素酶，发现纤维素酶对细胞壁的分解作用有限，发酵品质上与乳酸菌处理的互作作用较小，这就与稻草的木质化程度和水分含量上存在差异有关。
本试验中乳酸菌和纤维素酶共同添加时，降低了AN/TN，这与侯美玲等[34]的研究结果一致。同时NDF、ADF含量相比CK组均显著降低，RFV提高，这与Ni等[35]的研究结果一致。徐然等[36]以光叶紫花苕为原料青贮，发现乳酸菌和纤维素酶共同添加时，青贮料CP含量上升，NDF和ADF含量下降，但pH与CK组差异不显著，这与本试验结果不同，可能是由于乳酸菌和纤维素酶的种类和用量不同。本试验中2种添加剂复合添加与使用单一添加剂相比，发酵品质明显改善，但CP含量升高和NDF含量降低幅度不大，可能是2种添加剂间也存在一定的拮抗作用。6×50 mg/kg LA×CE组的青贮效果最佳，而同时添加高含量的乳酸菌和纤维素酶后，发现相较低含量添加其pH、AN/TN明显升高，WSC含量明显下降，发酵品质降低，这可能是因为2种添加剂用量增加，高浓度的乳酸菌使得青贮料的pH过低，从而使得纤维素酶的活性受到抑制，拮抗作用更加明显[37-38]。Tian等[39]将乳酸菌和纤维素酶复合添加于羊草青贮料中，发现其相比单一添加乳酸菌或纤维素酶，不能提高CP和WSC含量，降低AN/TN，可能也是因为存在此类作用。本次试验未进行乳酸、乙酸、丁酸等指标的测定，结合有机酸含量的测定将更加综合地反映苜蓿的青贮品质。也可设置多个干燥时间，测出苜蓿青贮的最佳含水量，能够获得最适的青贮条件，这些需要进一步的研究。
4 结论① 苜蓿青贮时添加乳酸菌能显著提高青贮料的WSC含量，显著降低pH，并且以6 mg/kg浓度最优。苜蓿青贮时添加纤维素酶能显著降低青贮料的ADF和pH，并且以50 mg/kg浓度最优。
② 乳酸菌和纤维素酶混合添加时，相比单独使用一种添加剂提高了青贮料的WSC含量，降低了青贮料的CF、ADF含量和pH，并且以6×50 mg/kg浓度最优。
③ 相同添加剂下60%含水量青贮料的CP含量均高于70%含水量，并且60%含水量青贮料的CF、ADF含量和pH低于70%含水量。因此60%含水量下青贮效果优于70%含水量。
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