胆固醇是很多甲壳动物的必需营养素[1]，其可转化为性激素、肾皮质激素，也是合成蜕壳激素的主要物质[2]；卵磷脂对维持细胞结构和功能以及动物的生长和分化具有重要作用[3]。甲壳动物在体内不能合成胆固醇，能部分合成磷脂，但是这种合成能力不能满足甲壳动物幼体新陈代谢的需要[4]，需要外源添加满足自身需求。研究表明，饲料中添加胆固醇可显著提高日本对虾(Penaeus japonicus)的增重率和存活率[5-6]；添加卵磷脂能够促进墨吉对虾[7](Penaeus merguiensis)、凡纳滨对虾[8](Litopenaeus vannamei)和斑节对虾[9](Penaeus monodon)的生长。甲壳动物生长发育总是伴随着蜕皮与蜕壳的进行，提高蜕壳频率能促进生长[10]。然而，以往研究中多见于单独添加胆固醇或卵磷脂对甲壳动物蜕壳的影响[5-9]，在饲料中同时添加胆固醇和卵磷脂的报道较少。
饲料中添加乳化剂能促使脂类进一步分散形成乳化微粒，增大油脂与脂肪酶和肠黏膜细胞的接触面积，提高脂类的消化吸收[11]。卵磷脂除营养作用外，还作为乳化剂添加在饲料中，但其乳化作用有限[12]。饲料中添加乳化能力更强的物质能否通过提高甲壳动物对脂类物质的消化吸收，进而促进蜕壳过程值得研究。近年来，一些枯草芽孢杆菌菌株经次级代谢产生的脂肽类物质——表面活性素(surfactin)因其很强的乳化能力，引起了人们的极大关注；其分子结构由13~15个碳原子组成的脂肪酸链和由7个氨基酸残基组成的肽链构成，其中脂肪酸链及肽链上的L-Leu2、D-Leu3、L-Val4、D-Leu6和L-Leu7构成其亲油基团，环链骨架与L-Glu1和L-Asp5 2个酸性氨基酸残基构成亲水基团，使其在较低的浓度下就可以聚集在一起形成胶束，具有优良的乳化特性，是目前已知的最强的生物表面活性剂之一[13-15]。本课题组以往的研究表明，饲料中添加表面活性素能够促进鱼体内脂肪的消化吸收，提高肝脏的抗氧化能力[15-16]。凡纳滨对虾蜕壳间期的肝胰腺抗氧化能力降低，容易造成机体应激[17-19]，改善凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力对蜕壳和生长具有重要意义。饲料中添加表面活性素能否对凡纳滨对虾蜕壳间期和肝胰腺抗氧化能力产生作用还鲜见报道。因此，本试验以凡纳滨对虾为试验动物，研究不同胆固醇和卵磷脂水平对蜕壳间期的影响，以及在适宜胆固醇和卵磷脂水平的饲料中添加不同水平表面活性素后蜕壳间期及肝胰腺抗氧化能力的变化，以期为凡纳滨对虾蜕壳的营养调控提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验一：试验一在集美大学水产学院生态实验室进行。凡纳滨对虾虾苗暂养2周后，将100尾均重为(0.61±0.02) g健康无病、规格均匀的凡纳滨对虾随机分为10组，每组10个重复，每个重复1尾虾。9个试验组(D1~D9组)分别饲喂添加0.2%、0.4%和0.6%胆固醇与1.0%、2.0%和3.0%卵磷脂的9种试验饲料，对照组(D10组)饲喂未添加胆固醇和和卵磷脂的基础饲料。试验期为35 d。
试验二：试验二在集美大学水产试验场进行。凡纳滨对虾虾苗暂养2周后，将90尾均重为(0.48±0.03) g健康无病、规格均匀的凡纳滨对虾随机分为6组，每组15个重复，每个重复1尾虾。对照组饲喂试验一中胆固醇和卵磷脂水平分别为0.4%和2.0%的试验饲料，5个表面活性素添加组分别饲喂在对照组饲料基础上添加10、20、40、80和160 mg/kg表面活性素的试验饲料。试验期为28 d。
1.2 饲料组成与饲养管理以鱼粉、豆粕和谷朊粉为蛋白质源，鱼油和豆油为脂肪源配制试验饲料，试验饲料组成及营养水平见表 1。饲料原料粉碎过60目筛，原料采用逐级扩大法混合，再加入鱼油、豆油和水混合均匀，用双螺杆制粒机(CD4×1TS型，华南理工大学科技实业总厂)挤压成直径为0.8 mm的颗粒料，自然风干后，置于自封袋中，-20 ℃冷冻保存备用。胆固醇和卵磷脂均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析纯级。表面活性素由福建正源有限公司提供，有效含量为80%。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
凡纳滨对虾暂养期间，饲养于350 L水体的圆形养殖缸(直径100 cm，高85 cm)中，每日投喂3次基础饲料，定时吸污、换水。试验期间凡纳滨对虾养殖于装有24 h持续增氧的2 L透明塑料烧杯中，每天08:30、12:30和18:30饱食投喂。投喂0.5 h后吸出残料和粪便，换水约1/3。试验用水为试验场新鲜海水，盐度为24‰~28‰，pH 8.0~8.2，亚硝酸盐含量低于0.02 mg/L，氨氮含量低于0.2 mg/L，增氧机持续增氧。光照为自然光源和荧光灯，光照周期为12明(L)：12暗(D)。试验期间每日00：00—08：00每隔2 h观察蜕壳情况，08:00—24：00每隔4 h观察蜕壳情况，及时吸出外壳并做好记录。
1.4 样品采集与组织匀浆的制备试验二养殖试验结束后禁食24 h采集样品，摘取肝胰腺放入冻存管置于-80 ℃下备用。称取0.1 g肝胰腺组织，按重量(g) :体积(mL)=1 : 9加入0.86%冰冷的生理盐水，用匀浆机连续匀浆3~5次。最后把制备好的组织匀浆在4 ℃离心机下离心(3 000 r/min，10 min)，将上清液进行分装以备待用。
1.5 测定指标和方法蜕壳间期为相邻2次蜕壳的时间间隔(h)，参考龙晓文等[20]和关建义等[21]的方法，计算每尾虾试验开始1周后前3次脱壳的平均时间间隔。
凡纳滨对虾肝胰腺的总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。
1.6 数据统计分析试验数据用Excel 2003整理后，采用平均值±标准差(mean±SD)表示。试验一中数据采用SPSS 17.0统计软件进行双因素方差分析(two-way ANOVA)，试验二中数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，显著水平为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 饲料中胆固醇和卵磷脂水平对凡纳滨对虾蜕壳间期的影响由表 2可知，饲料中胆固醇水平可显著影响凡纳滨对虾的蜕壳间期(P < 0.05)，卵磷脂水平对凡纳滨对虾蜕壳间期的影响不显著(P>0.05)；饲料中胆固醇和卵磷脂水平对蜕壳间期的影响存在显著的交互作用(P < 0.05)。D2、D5和D6组凡纳滨对虾的蜕壳间期显著低于除D1和D7组外的其他各组(P < 0.05)，其中D5组蜕壳间期最短。
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表 2 饲料中胆固醇和卵磷脂水平对凡纳滨对虾蜕壳间期的影响 Table 2 Effects of dietary cholesterol and lecithin levels on intermolt period of Pacific white shrimp |
由表 3可知，与对照组相比，仅10 mg表面活性素添加组显著缩短凡纳滨对虾蜕壳间期(P < 0.05)，20、40、80和160 mg/kg表面活性素添加组与对照组间无显著差异(P>0.05)。
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表 3 饲料中添加表面活性素对凡纳滨对虾蜕壳间期的影响 Table 3 Effects of surfactin supplementation on intermolt period of Pacific white shrimp |
由表 4可知，仅10 mg/kg表面活性素添加组肝胰腺T-AOC显著高于对照组(P < 0.05)，20、40、80和160 mg/kg表面活性素添加组与对照组间无显著差异(P>0.05)；与对照组相比，各表面活性素添加组肝胰腺SOD活性显著提高(P < 0.05)，且各表面活性素添加组之间无显著差异(P>0.05)；10和20 mg/kg表面活性素添加组肝胰腺CAT活性显著高于对照组(P < 0.05)，其他表面活性素添加组肝胰腺CAT活性则较对照组显著降低(P < 0.05)；除10 mg/kg表面活性素添加组肝胰腺GSH-Px活性与对照组无显著差异(P＞0.05) 外，其他各表面活性素添加组肝胰腺GSH-Px活性均较对照组显著升高(P < 0.05)；10和20 mg/kg表面活性素添加组肝胰腺MDA水平显著低于对照组(P < 0.05)，40、80和160 mg/kg表面活性素添加组与对照组间无显著差异(P>0.05)。
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表 4 饲料中添加表面活性素对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力的影响 Table 4 Effects of surfactin supplementation on antioxidant ability in hepatopancreas of Pacific white shrimp |
本研究中，饲料显著影响蜕壳间期，且在胆固醇水平为0.4%时蜕壳间期最短。这与Tao等[22]和Sheen[2]在饲料中分别添加0.32%和0.51%胆固醇显著提高中华绒螯蟹和锯缘青蟹蜕壳频率的结果类似，也与墨吉对虾[7](Penaeus merguiensis)和黑虎虾[23](Penaeus monodon)饲料中胆固醇需要量为0.5%的研究结果接近。胆固醇在虾蟹类甲壳动物体内不能由固醇前体从头合成，需要外源添加来满足需求[24]。胆固醇在对虾体内吸收后被Y-器官先转化为5β-diketol，再转化为蜕皮激素，并与位于眼柄X-器官窦腺复合体分泌的蜕皮抑制激素相互拮抗，从而调控蜕壳周期长短[25-27]。本试验中蜕壳间期的缩短，可能是适宜的胆固醇水平促进了蜕皮激素的合成，抑制了蜕皮抑制激素的合成所致[28-29]，具体的作用途径及机制还有待进一步研究。
本试验中，饲料适宜卵磷脂水平有缩短凡纳滨对虾蜕壳间期的趋势，适宜的卵磷脂水平为2.0%，这与Thongrod等[7]在墨吉对虾中得出的结果一致。此外，Wang等[30]发现，饲料中卵磷脂水平为0.5%时对三疣梭子蟹蜕壳频率无显著影响，但卵磷脂水平为1%和2%水平时蜕壳频率有升高趋势，这与本研究结果类似。本研究中，饲料卵磷脂与胆固醇水平的交互作用对凡纳滨对虾蜕壳间期有显著影响。这种交互作用也出现在美洲海螯虾(Homarus americanus)的研究中，即饲料中不添加卵磷脂情况下, 美洲海螯虾胆固醇的需要量为0.5%[31]，添加卵磷脂的情况下美洲海螯虾胆固醇的需要量为0.25%[32]，这可能与卵磷脂通过乳化作用促进胆固醇在肠道内的消化吸收有关[33]。而Briggs等[34]在罗氏沼泽虾饲料中分别添加0、0.5%、1.0%的胆固醇和0、5%的卵磷脂，未发现对蜕壳频率的影响存在显著交互作用，与本试验结果不同，这可能是对虾种类、试验条件、胆固醇和卵磷脂水平等方面的差异所致，饲料中胆固醇和卵磷脂水平对凡纳滨对虾蜕壳间期产生交互作用的机制还有待进一步查明。
3.2 饲料中添加表面活性素对凡纳滨对虾蜕壳间期和肝胰腺抗氧化能力的影响本试验中，饲料中添加10 mg/kg表面活性素缩短了凡纳滨对虾的蜕壳间期，这可能是适量的表面活性素通过乳化作用提高了脂类的消化吸收[13-16]，尤其是促进与蜕壳有关的胆固醇和卵磷脂在体内贮存而缩短凡纳滨对虾蜕壳间期的。该试验结果与试验一中凡纳滨对虾的蜕壳间期结果总体上有一定差异，可能与2批虾苗在饲养1周后首次蜕壳时间的早晚、虾苗质量的好坏及体重差异等有关，这都需要在将来的研究中进一步证实。
正常情况下，体内自由基的产生和清除处于平衡状态中，SOD、CAT与GSH-Px是生物体抗氧化酶系的重要酶类，对生物体内活性氧自由基地清除起着关键的作用。T-AOC是衡量机体总抗氧化能力的重要指标，机体内MDA的水平越高表明机体脂质受活性氧、自由基氧化损害的程度越大[35]。本试验中，饲料中适量添加表面活性素显著提高凡纳滨对虾肝胰腺SOD、CAT、GSH-Px活性和T-AOC，降低MDA水平，说明表面活性素具有提高凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力的作用。这与李剑[15]和翟少伟等[36]在饲料中添加50 mg/kg表面活性素提高了吉富罗非鱼肝胰脏抗氧化能力的结果一致，孙秀文[16]在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)幼鱼上也有类似的报道。表面活性素提高水产动物肝脏或肝胰腺抗氧化能力可能与其分子中含有天冬氨酸和谷氨酸2种酸性氨基酸，它们与Fe2+和Cu2+螯合，降低金属离子的催化反应，减少自由基的生成，从而改善肝胰脏的健康状况有关[15, 36-37]。
本研究中，随着表面活性素添加水平的升高，凡纳滨对虾蜕壳间期呈升高的趋势，而肝胰腺抗氧化能力呈下降的趋势。这可能与表面活性素的乳化特性有关，其在临界胶束浓度以下时，随着添加水平的增加乳化能力增强，当添加水平超过其临界胶束浓度后，乳化能力趋于稳定，乳化效果不再增强[38-39]。
4 结论① 本试验条件下，饲料中胆固醇水平及其与卵磷脂水平的交互作用可显著影响凡纳滨对虾蜕壳间期，胆固醇和卵磷脂水平分别为0.4%和2.0%时蜕壳间期最短。
② 在胆固醇和卵磷脂水平分别为0.4%和2.0%的饲料中添加10 mg/kg表面活性素可缩短凡纳滨对虾蜕壳间期，提高肝胰腺抗氧化能力。
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