2. 农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室, 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 青岛 266071
2. Key Laboratory for Sustainable Utilization of Marine Fisheries Resource, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，又称南美白对虾，具有生长速度快、抗病能力强、抗逆性强等特点，是目前世界上养殖产量最高的三大虾类之一，养殖经济效益显著。在凡纳滨对虾的养殖生产中，营养全面的饲料是对虾健康养殖的基础[1]，合适的原料是保障饲料营养全面的关键，但是目前饲料原料的种类和资源有限，所以开发适宜的饲料原料具有重要意义。
海带(Laminaria japonica Aresch)属于大型褐藻类植物，是我国主要海藻养殖品种之一，其生产环境优越，可以富集多种维生素、微量元素及促进生长的活性因子，营养丰富且动物吸收利用率高[2]。目前，我国海带加工已逐步形成了以褐藻胶、甘露醇、碘为主要产品的工业体系，但是海带的工业利用率仅为30%左右，剩余的海带渣仍有大量成分，如蛋白质、纤维素和矿物质等，尚未得到充分开发利用，不但造成大量海带自然生物资源的浪费，而且在生产过程中会有大量富含有机质和营养盐的废渣排放，成为水体富营养化和赤潮诱发的潜在化学因素，给海洋渔业经济和生态带来影响和破坏[3]。近年来有关海藻类产品的应用研究很多，主要集中在家禽[4]、猪[5]、对虾[6]上，研究表明饲料中添加海藻或其提取物对养殖动物有一定的积极作用[7-10]。从20世纪50年代用海带粉作饲料添加剂研究开发至今，其研究和应用一直为人们所看好，目前海带渣在畜禽和水产饲料中直接添加应用的较广泛，但在对虾饲料生产中添加海带渣酶解产物的还很少。因此，本试验通过配制添加不同比例海带渣的饲料，研究对虾饲料中海带渣的试验添加比例，并得出适宜添加比例的基础上对海带渣采用不同酶进行酶解处理，研究海带渣酶解产物的应用效果，以期为海带渣的高值化利用提供参考及理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用凡纳滨对虾[体重(1.00±0.10) g]由潍坊新大地水产养殖有限公司提供；海带渣为商业提胶剩余产品，来自山东明月海藻集团有限公司；饲料原料购自青岛七好饲料有限公司；饲料级β-葡聚糖酶购自和氏璧生物技术有限公司，为粉状制剂，活性为50 000 U/g；饲料级蛋白酶购自和氏璧生物技术有限公司，为粉状制剂，活性为20 000 U/g。
1.2 海带渣酶解方法针对海带渣中含量较高的蛋白质和纤维素(海带渣的营养水平见表 1)，选择能对这2种物质作用的2类酶进行初步筛选，分别以酶解液中还原糖和氨基酸浓度作为评价指标，最终选定酶解效果较好的β-葡聚糖酶和蛋白酶对海带渣进行酶解处理，酶解处理方式参考王昌义等[11]的研究方法，具体方法如下：
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表 1 海带渣及其酶解产物的营养水平(干物质基础) Table 1 Nutrient levels of kelp meal and its enzymatic hydrolysates (DM basis) |
β-葡聚糖酶酶解海带渣(GT)：按海带渣质量的0.1%添加β-葡聚糖酶，固液比为1:20，充分搅拌后，50 ℃酶解处理24 h，将酶解后固液产物全都作为饲料添加剂；另用3，5-二硝基水杨酸法对酶解液中小分子还原糖的浓度进行测定，测得海带渣经β-葡聚糖酶酶解后生成还原糖的效率为8.98%。β-葡聚糖酶酶解海带渣的营养水平见表 1。
蛋白酶酶解海带渣(PT)：按海带渣质量的0.2%添加蛋白酶，固液比为1:20，充分搅拌后，45 ℃酶解处理24 h，将酶解后固液产物全都作为饲料添加剂；另用茚三酮显色法对酶解液中氨基酸的浓度进行测定，测得海带渣经蛋白酶酶解后生成氨基酸的效率为11.3%。蛋白酶酶解海带渣的营养水平见表 1。
1.3 试验方法养殖试验在中国水产科学研究院黄海水产研究所水生实验室进行，分为海带渣适宜添加比例试验和海带渣酶解产物应用效果试验2个试验。
1.3.1 试验1：海带渣适宜添加比例试验以鱼粉、豆粕、高筋粉、虾糠、维生素预混料、矿物质预混料等为原料配制基础饲料(D1组，作为对照组)，然后再配制分别以0.5%(D2组)、1.0%(D3组)、2.0%(D4组)、3.0%(D5组)和5.0%(D6组)的海带渣等量替代基础饲料中高筋粉的试验饲料。饲料组成及营养水平见表 2。将原料粉碎过80目筛、混合，经绞肉机(恒联TJ12-H)制成直径为2 mm的颗粒饲料，经60 ℃烘干至恒重，-20 ℃保存备用。
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表 2 试验1中所用饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 2 Composition and nutrient levels of diets used in experiment one (DM basis) |
海带渣适宜添加比例试验为期49 d。选取630尾平均初始体重为(1.00±0.10) g的健康凡纳滨幼虾，随机分成6组，每组3个重复，每个重复35尾，以重复为单位养殖在容量为150 L的大白桶中。养殖期间水体温度为21~28 ℃，盐度为30‰~33‰，pH为7.0~7.6，溶解氧浓度在6.5 mg/L左右。试验虾适应期为1周，1周后按对虾体重的3%~5%投喂相应的配合饲料，每天饱食投喂2次。在投饵前称量饲喂量，投饵后1 h用虹吸法收集残饵，烘干称重，每天记录摄食量。每周换水2次，24 h连续充气，期间发现死虾及时捞出，以免影响水质。
1.3.2 试验2：海带渣酶解产物应用效果试验根据试验1得出的海带渣添加比例为3.0%时效果最好，选择添加3.0%海带渣的试验饲料作为海带渣对照组(A组)，然后再分别用β-葡聚糖酶酶解海带渣(B组)和蛋白酶酶解海带渣(C组)对A组饲料中的海带渣进行等量替代，制作含3.0%海带渣酶解产物的试验饲料。饲料组成及营养水平见表 3。
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表 3 试验2所用饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 3 Composition and nutrient levels of diets used in experiment two (DM basis) |
酶解海带渣应用效果试验为期56 d。选取315尾平均初始体重为(1.00±0.10) g的健康幼虾，随机分成3组，每组3个重复，每个重复35尾。其他养殖条件同试验1。
1.4 样品采集与指标测定 1.4.1 样品采集与处理试验开始和结束时对各组对虾计数和称重。试验结束时，停止投喂24 h，每个重复随机选择5尾(每组共15尾虾)，用洁净的干布吸净体表水分，使用吸入抗凝剂的一次性无菌注射器从头胸甲插入心区采集血液。采集好的血液经过4 ℃、5 000 r/min离心15 min后取上清到新的离心管中，于-80 ℃冷藏，用于非特异性免疫酶活性的测定。另在冰盒上解剖取对虾的胃，取样后立即放入离心管中，-80 ℃冷藏，用于消化酶活性的测定。
1.4.2 指标测定及计算公式饲料中粗蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法(VELP, UDK-142 Autom Atic Distillation Unit，意大利)；粗脂肪含量的测定采用索氏抽提法(SOXTEC2050 FOSS脂肪测定仪，瑞典)；粗灰分含量的测定采用失重法[在微波马弗炉中(550±20) ℃灼烧9 h]；水分含量的测定采用直接干燥法[在数显鼓风干燥箱中(105±2) ℃恒温干燥3 h]。
对虾的成活率(survival rate, SR)、增重率(weight gain rate, WGR)、特定生长率(specific growth rate, SGR)、饲料系数(feed conversion ratio, FCR)、日摄食率(daily feeding rate, DFR)的计算公式如下：
成活率(%)=100×终末对虾尾数/初始对虾尾数；
增重率(%)=100×(终末平均体重-初始平均体重)/初始平均体重；
特定生长率(%/d)=100×(ln最终体质量-ln初始体质量)/养殖天数；
饲料系数(%)=100×投喂总量/(终末总重-初始总重)；
日摄食率(%)=100×投喂总量/[养殖天数×(终末总重+初始总重)/2]。
相关酶活性测定：胃蛋白酶(pepsin, PP)、胃纤维素酶(cellulase, CL)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性及样品蛋白质含量均采用南京建成生物工程研究所的相关试剂盒测定，并以比活力表示；酚氧化酶(polyphenol oxidase, PO)活性采用上海酶联生物科技有限公司的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定。
1.5 数据统计分析试验所得数据用Excel 2007整理，以平均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0分析软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法比较组间差异显著性，以P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 海带渣添加比例及其酶解产物对凡纳滨对虾生长性能的影响由表 4可知，各海带渣添加组对虾的增重率和特定生长率均高于对照组，其中D4、D5组与对照组的差异达显著水平(P＜0.05)。饲料系数和日摄食率均以D5组最低，显著低于对照组以及D2、D3组(P＜0.05)。
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表 4 海带渣添加比例对凡纳滨对虾生长性能的影响 Table 4 Effects of kelp meal adding proportion on growth performance of Litopenaeus vannamei |
由表 5可知，B组对虾的增重率和特定生长率均显著高于A和C组(P＜0.05)。B、C组对虾的饲料系数和日摄食率均显著低于A组(P＜0.05)。C组成活率最高，且与A、B组差异显著(P＜0.05)，A、B组成活率无显著差异(P＞0.05)。
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表 5 海带渣酶解产物对凡纳滨对虾生长性能的影响 Table 5 Effects of kelp meal enzymatic hydrolysates on growth performance of Litopenaeus vannamei |
由表 6可知，凡纳滨对虾的胃中纤维素酶活性随着海带渣添加比例的增加而升高，且D5、D6组的胃中纤维素酶活性显著高于其他各组(P＜0.05)。对虾胃中胃蛋白酶活性随着海带渣添加比例的增加呈现先上升后下降的变化，以D5组活性最高，D6组活性最低，且这2组间的差异达到显著水平(P＜0.05)。
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表 6 海带渣添加比例对凡纳滨对虾胃中消化酶活性的影响 Table 6 Effects of kelp meal adding proportion on digestive enzyme activities in stomach of Litopenaeus vannamei |
由表 7可知，B和C组对虾的胃中纤维素酶活性较A组显著降低(P＜0.05)，且B组胃中纤维素酶活性还显著低于C组(P＜0.05)。对虾胃中胃蛋白酶活性以B组最低，显著低于A、C组(P＜0.05)。
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表 7 海带渣酶解产物对凡纳滨对虾胃中消化酶活性的影响 Table 7 Effects of kelp meal enzymatic hydrolysates on digestive enzyme activities in stomach of Litopenaeus vannamei |
由表 8可知，对虾血清中ACP活性各组间差异不显著(P＞0.05)。对虾血清中SOD活性随海带渣添加比例的增加呈先上升后下降的趋势，以D5组活性最高，为276.86 U/mL，显著高于其他各组(P＜0.05)。对虾血清中PO活性以D5组最高，D6组最低，D3、D4、D5组显著高于其他组(P＜0.05)，D6组显著低于其他各组(P＜0.05)。
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表 8 海带渣添加比例对凡纳滨对虾血清中非特异性免疫酶活性的影响 Table 8 Effects of kelp meal adding proportion on serum non-specific immune enzyme activities of Litopenaeus vannamei |
由表 9可知，B、C组血清中ACP和PO活性均显著高于A组(P＜0.05)，且B、C组之间无显著差异(P＞0.05)；C组血清中SOD活性显著高于A、B组(P＜0.05)，且A、B组之间无显著差异(P＞0.05)。
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表 9 海带渣酶解产物对凡纳滨对虾血清中非特异性免疫酶活性的影响 Table 9 Effects of kelp meal enzymatic hydrolysates on serum non-specific immune enzyme activities of Litopenaeus vannamei |
本试验结果表明，饲料中添加海带渣能够促进凡纳滨对虾的生长，其中添加2.0%~3.0%的海带渣能够显著促进凡纳滨对虾生长，这与刘立鹤等[12]的研究结果相一致，原因可能是海带渣中含有蛋白质、矿物质以及各种维生素等营养物质，同时含有大量的多糖以及刺激动物生长的活性成分[13]。周歧存等[14]研究同样得出，在凡纳滨对虾饲料中添加3%的海藻粉，对虾增重率和蛋白质效率显著高于对照组，且饲料系数最低。
水产动物消化酶活性可反映其消化能力的强弱。李猛等[15]研究了饲料中添加不同比例的浒苔对刺参纤维素酶活性的影响，结果表明，随着浒苔添加比例的增加，肠道纤维素酶活性呈现先上升后下降的趋势。在本试验中，随着海带渣添加比例的增加，凡纳滨对虾胃中胃蛋白酶活性出现了先上升后下降的趋势而其胃中纤维素酶的活性则持续升高，其原因可能是：随着海带渣添加比例的增加，饲料中纤维素含量也相应的增加，刺激了对虾胃纤维素酶的分泌；纤维素含量高会加快食物在对虾肠道中的排空速度[16]，因此当海带渣添加比例过高时，影响了胃蛋白酶的活性。此外，本试验结果还表明，添加2%~5%海带渣组的对虾日摄食率显著低于其他组，可能是因为海带渣添加比例过高影响了饲料的适口性，降低了对虾的摄食量，从而影响了胃蛋白酶的分泌。
研究表明，海藻类产品能够提高日本对虾[17]和刺参[18]血清中的SOD等非特异性免疫酶的活性。SOD是机体清除氧自由基的重要抗氧化关键酶之一[19]，Regoli等[20]研究发现生物体对胁迫的适应能力主要取决于其抗氧化能力。PO能启动黑色素的合成，有效抑制病原体胞外蛋白酶和几丁质酶的活性，PO活性的强弱是衡量甲壳动物机体免疫能力强弱的重要参考指标[21]。本试验结果表明，饲料中添加适宜比例的海带渣能够提高凡纳滨对虾血清中SOD、PO的活性，这可能是添加的海带渣经消化释放了岩藻多糖[22]，而岩藻多糖具有增强免疫力[23]、提高抗病毒性和抗氧化能力的功能[24-25]，而添加5%海带渣组的对虾血清中SOD、PO的活性显著下降，可能是因为随着海带渣添加比例的升高，被消化产生的多糖类浓度升高，而过高浓度的糖类对动物免疫活性有抑制作用[26]。ACP是溶酶体酶的标志酶，在对虾免疫反应中有重要的生物学意义[27-28]。在本试验中，饲料中添加海带渣后对虾血清中ACP活力虽有升高，但效果不显著，可能是海带渣被消化分解产生的物质含量低不能明显改变ACP活性。
3.2 海带渣酶解产物对凡纳滨对虾生长、消化和非特异性免疫力的影响酶制剂在酶解饲料原料时可以将大分子营养物质转化为分子质量小且更易吸收的营养物质，本试验选用的β-葡聚糖酶是一种纤维素酶，可以将海带渣中的纤维素降解为小分子的糖类。张志勇等[29]研究发现，在凡纳滨对虾饲料中添加海藻β-葡聚糖可显著提高其生长性能，本试验中β-葡聚糖酶酶解海带渣组对虾的增重率、特定生长率显著高于其他2组，且饲料系数最低，这可能是海带渣中的纤维素被酶降解为可消化的糖类并且氧化分解提供能量，并通过减少肠道蠕动减少了能量消耗，从而使更多的营养物质用于生长[30-31]。
本试验中，β-葡聚糖酶酶解海带渣组对虾胃中胃蛋白酶和纤维素酶活性显著低于海带渣对照组和蛋白酶酶解海带渣组，这是因为该组饲料中纤维素含量降低，对纤维素酶的分泌没有促进作用；而蛋白酶酶解海带渣组对虾的胃蛋白酶活性略高于海带渣对照组，可能是因为海带渣被蛋白酶处理后产生了大量氨基酸和小肽等物质，增强了相应底物的浓度，对胃蛋白酶的分泌起到了一定的促进作用[32]。
李桂芹[33]的研究表明海带多糖能提高动物机体的免疫功能。刘晋等[34]研究表明海藻糖类能提高对虾血清中免疫酶的活性。本试验条件下，β-葡聚糖酶酶解海带渣和蛋白酶酶解海带渣组对虾血清中ACP、PO活性及蛋白酶酶解海带渣组对虾血清中SOD活性显著高于海带渣对照组，因此海带渣经β-葡聚糖酶和蛋白酶酶解后可提高对虾血清中非特异性免疫酶的活性。而β-葡聚糖酶酶解海带渣组对虾血清中SOD活性低于其他2组，这可能是因为海带渣经β-葡聚糖酶酶解后释放产生的还原性小分子糖类浓度过高，而高浓度的糖类对动物机体的SOD活性有一定抑制作用[26, 35]。在饲料中提供充足的氨基酸是维持动物正常免疫功能和保护宿主抵抗疾病所必需的[36]。大量研究表明，蛋白质是以小肽和氨基酸的形式被动物吸收[37]，小肽能增强机体的免疫能力[38]。仇哲等[39]研究表明，海带中氨基酸含量丰富，酶解后氨基酸及必需氨基酸含量上升，在本研究中海带渣经蛋白酶酶解后生成氨基酸的效率为11.3%，提高了饲料中小肽及氨基酸的含量，从而增强了凡纳滨对虾的非特异性免疫力[40]。
4 结论① 在本试验条件下，凡纳滨对虾饲料中海带渣的适宜添加比例为3.0%。
② 海带渣经β-葡聚糖酶酶解后可以促进凡纳滨对虾的生长，提高其非特异性免疫力；而海带渣经蛋白酶酶解后可提高凡纳滨对虾的非特异性免疫力，但对其生长无促进作用。
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