2. 山东省绿色食品发展中心, 济南 250013;
3. 山东省动物疫病预防与控制中心, 济南 250022;
4. 山东新希望六和集团有限公司, 青岛 266061
, PEI Zongfei2, ZHU Lijun1, DONG Wenwen1, ZHOU Jianbo1, HU Liping3, WEI Kai1, HUANG He4
, ZHU Ruiliang1
2. Shandong Province Green Food Development Center, Ji'nan 250013, China;
3. Animal Disease Prevention and Control Center of Shandong Province, Ji'nan 250022, China;
4. Shandong New Hope Liuhe Group Co., Ltd., Qingdao 266061, China
植物乳杆菌是动物肠道中的正常菌群，具有较好的肠道黏附能力，能产生乳酸及抗菌物质[1-3]，并能够抑制肠道腐败菌和致病菌的繁殖，调节动物消化道微生物区系平衡，促进营养物质消化吸收，增强机体免疫力[4-6]。然而，益生菌活菌制剂进入动物消化道后易受消化道低pH胃酸、胆汁酸和消化酶等不利因素的影响，难以有足够的活菌数量到达肠道或定植肠道而发挥作用[7]。微胶囊技术是利用天然或合成的材料将固体、液体或气体等核心物质进行包埋和固化的技术，可显著增强菌体对外界不利环境的耐受力，大大提高菌体进入肠道内的存活率[8]。
多糖是一类生物大分子，具有提高机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生虫等功能[9]。本实验室前期研究已证明泰山松花粉多糖(TPPPS)能够显著增强动物的生产性能和免疫功能[10-11]。然而，植物乳杆菌和TPPPS之间是否存在协同作用尚不清楚。TPPPS作为一种水溶性多糖，易受胃酸和酶的破坏。因此，本试验以植物乳杆菌和TPPPS为芯材，海藻酸钠(AIg)和壳聚糖为壁材制备微胶囊，通过正交试验对微囊工艺进行优化，从而明确制备植物乳杆菌-TPPPS微胶囊的最佳工艺条件，并将此微胶囊经口服饲喂无特定病原体(SPF)小鼠，通过测定生产性能对该微胶囊进行效果检验，以期为新型益生菌微胶囊的开发提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 菌种、试剂和仪器 1.1.1 菌种试验用菌种为植物乳杆菌21794，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 主要试剂AIg，购自Xiya Reagent公司, 纯度98%；壳聚糖，购自Solarbio公司, 有效成分含量98%；胃蛋白酶，购自Sigma公司, 活性250 U/mg；胰蛋白酶，购自BioBasic公司, 活性250 U/mg。
1.1.3 主要仪器超净台，浙江苏净净化设备有限公司；JJ-2型组织捣碎匀浆机，武汉格莱莫检测设备有限公司；pH计，上海雷磁仪器厂；电热恒温培养箱，DNP-9082，上海精宏实验设备有限公司；光学显微镜，55i，日本尼康公司。
1.2 微胶囊制备及配方筛选 1.2.1 植物乳杆菌菌悬液的配制将活化好的菌种接种到MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h。将培养好的菌液离心(4 000 r/min，15 min，4 ℃)，弃上清液，无菌生理盐水洗涤离心菌泥2次，然后用生理盐水重新悬浮菌体，使植物乳杆菌数达到1010 CFU/mL，4 ℃保存。
1.2.2 微胶囊制备工艺流程将TPPPS加入到制备好的菌悬液中混合均匀，使TPPPS的含量为1 mg/mL。然后将经过高压灭菌的AIg(2.0%)和乳化剂(植物油含1.0%的司盘80) 以及一定量的碳酸钙(溶解于少量水中)加入到菌悬液中进行乳化(3 000 r/min，60 min)，形成油包水乳浊液。待乳化完全后加入适量冰醋酸降低反应的pH，继续反应30 min，加入1.0%的吐温80溶液固化30 min，静置，离心后用生理盐水清洗，得到AIg凝胶珠。然后将得到的AIg凝胶珠倒入到0.4%的壳聚糖溶液中进行交联，固化1 h后将微囊进行离心，清洗，置于4 ℃冰箱保存。
1.2.3 微胶囊制备配方筛选选择水相与油相体积比(A)、碳酸钙与AIg质量比(B)、碳酸钙与冰醋酸物质的量比(C)、壳聚糖浓度(D)作为影响因素，采用4因素3水平L9(34)正交试验设计，研究4个因素对微胶囊包埋率的影响，并参考粒径大小、成球效果等试验指标筛选出制备植物乳杆菌-TPPPS微胶囊的最佳条件。植物乳杆菌-TPPPS微胶囊配方L9(34)正交试验设计见表 1。
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表 1 正交试验因素水平表 Table 1 Factor levels of orthogonal test |
将微胶囊置于解囊液[12]中搅拌30 min，待微胶囊完全溶解后计数。
包埋率(%)=(微胶囊中活菌数量/原料活菌数量)×100。
光学显微镜观察微胶囊，用测微尺测定微胶囊的粒径，计数500个以上，根据以下公式计算微胶囊的平均粒径：
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式中：Dav为平均粒径；d为微胶囊粒径；n为微胶囊个数。
1.2.5 微胶囊对体外模拟胃液的耐受试验取制备的微胶囊样品1 mL置于9 mL模拟胃液[12]中，37 ℃、180 r/min条件下分别振荡处理0、30、60、90、120 min后取样，按梯度浓度稀释法测活菌数，并以未包埋菌为对照组。
1.2.6 微胶囊储存稳定性检测将制备好的微胶囊样品置于37 ℃恒温箱中密封放置120 d，每30 d取1 mL微胶囊测活菌数，以未包埋菌为对照组。
1.3 动物试验 1.3.1 试验设计SPF小鼠48只，体重大约20 g(雌性，购自泰邦生物制品有限公司)，随机分为4组，每组12只。室温23~28 ℃条件下饲养，在试验开始前给予3 d适应环境。4组小鼠每天分别口服饲喂1 mL的植物乳杆菌(LP组)、植物乳杆菌+0.5% TPPPS(LP+TPPPS组)、微胶囊[Micro(LP+TPPPS)]组、磷酸盐缓冲液(PBS组)。饲养试验42 d，在7、14、21、28、35、42 d采样检测相关指标。采集样本前12 h内停止饲喂。
1.3.2 小鼠体重变化及肠道菌的定植状况每组随机取3只小鼠，称重记录。剖检，无菌摘取回肠组织样品，研磨后倍比稀释，分别涂布到MRS培养基和麦康凯培养基中培养，测活菌数。
1.3.3 小肠组织学分析每组3只小鼠剖检后无菌摘取小肠组织样品，测定肠绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度/隐窝深度。
1.4 数据处理与分析所有数据用SPSS 17.0软件进行Duncan氏法多重比较分析，数据为平均值±标准差，P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 微胶囊最佳配方的筛选通过测定微胶囊包埋率和粒径大小，对微胶囊进行最佳配方的筛选。以包埋率为试验指标，极差(R)越大表明该因素对指标的影响越大。根据表 2结果判断，A、B、C、D 4种因素对微胶囊包埋率的影响大小依次递减，即水相与油相体积比>碳酸钙与AIg质量比>碳酸钙与冰醋酸物质的量比>壳聚糖浓度。数据分析发现，A2B2C3D2为最佳包埋条件，但该组合最初未在实际操作之列，故对此组合单独试验。结果发现，A2B2C3D2组合包埋率为81.6%，粒径为84.3 μm，综合评价优于其他组合。因此，植物乳杆菌和TPPPS微胶囊的最佳生产工艺为：水相与油相体积比为1:3，碳酸钙与AIg质量比为1:4，碳酸钙与冰醋酸的物质的量比为1:4，壳聚糖浓度为4 g/L。
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表 2 微胶囊配方筛选的L9(34)正交试验结果 Table 2 L9 (34) orthogonal test results of microcapsule recipe screening |
在光学显微镜下观察，最佳条件下制备的微胶囊呈规则球形，粒径分布均匀(图 1)。高倍镜下，空埋的AIg凝胶珠呈半透明状(图 1-A、1-D)，包埋植物乳杆菌和TPPPS的AIg凝胶珠透光度降低(图 1-B、1-E)，经过AIg和壳聚糖双层包被后颜色最暗，并且粒径大小更加均匀(图 1-C、1-F)。
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A:空埋的AIg凝胶珠(苏木精伊红染色，40×) calcium alginate gel beads embedding nothing (HE staining, 40×)；B：包埋植物乳杆菌和TPPPS的AIg凝胶珠(苏木精伊红染色，40×) calcium alginate gel beads embedding Lactobacillus plantarum and TPPPS (HE staining, 40×)；C：包埋植物乳杆菌和TPPPS的AIg和壳聚糖微胶囊(苏木精伊红染色，40×) calcium alginate and chitosan microcapsules embedding Lactobacillus plantarum and TPPPS (HE staining, 40×)；D:空埋的AIg凝胶珠(苏木精伊红染色，200×) calcium alginate gel beads embedding nothing (HE staining, 200×)；E：包埋植物乳杆菌和TPPPS的AIg凝胶珠(苏木精伊红染色，200×)calcium alginate gel beads embedding Lactobacillus plantarum and TPPPS (HE staining, 200×)；F包埋植物乳杆菌和TPPPS的AIg和壳聚糖微胶囊(苏木精伊红染色，200×) calcium alginate and chitosan microcapsules embedding Lactobacillus plantarum and TPPPS (HE staining, 200×)。 图 1 光学显微镜下微胶囊的形态观察 Figure 1 Morphologic observation of microcapsules under optical microscope |
通过检测微胶囊化的植物乳杆菌在模拟胃液中的存活率来评估微胶囊对模拟胃液的耐受性。由表 3可知，模拟胃液处理30 min对照组中未经微胶囊化的植物乳杆菌存活数量显著低于微胶囊组(P＜0.05)。在模拟胃液中处理60 min微胶囊组存活率为70.83%，处理120 min存活率为62.36%，而对照组中未经微胶囊化的植物乳杆菌在模拟胃液中处理60 min全部死亡。以上结果说明植物乳杆菌经微胶囊包埋后显著提高对模拟胃液的耐受性。
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表 3 微胶囊化后的植物乳杆菌对模拟胃液的耐受性 Table 3 Tolerance of L. plantarum in simulated gastric juice after microencapsulation |
由表 4可知，在37 ℃条件下储存120 d微胶囊中植物乳杆菌的存活率为45.9%，而对照组中未经微胶囊化的植物乳杆菌的存活率为31.2%，活菌数量2组间差异显著(P < 0.05)。该结果表明微胶囊化后的植物乳杆菌储存稳定性得到了显著提高。
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表 4 微胶囊化后的植物乳杆菌对37 ℃储存条件的耐受性 Table 4 Tolerance of L. plantarum under 37 ℃ storage conditions after microencapsulation |
由表 5可知，Micro(LP+TPPPS)组和LP+TPPPS组的体重显著高于LP组和PBS组(P < 0.05)，其中Micro(LP+TPPPS)组小鼠体重最高，LP组和PBS组的差异不显著(P>0.05)。与PBS组相比，其他3组均呈现一定程度的乳酸菌数量增加和大肠杆菌数量降低的趋势，其中Micro(LP+TPPPS)组和LP+TPPPS组与PBS组的差异显著(P < 0.05)，而LP组和PBS组的差异不显著(P>0.05)。结果表明，植物乳杆菌单独使用可以改善肠道环境，维持肠道菌群的平衡，改善小鼠的生产性能，协同使用TPPPS后效果更好，将二者微胶囊化后效果最佳。
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表 5 微胶囊对小鼠体重及肠道细菌数量的影响 Table 5 Effects of microcapsules on body weight and intestinal bacteria number of mice |
由表 6可知，Micro(LP+TPPPS)组、LP+TPPPS组和LP组的绒毛高度显著高于PBS组(P < 0.05)。Micro(LP+TPPPS)组、LP+TPPPS组和LP组的隐窝深度显著低于PBS组(P < 0.05)，Micro(LP+TPPPS)组和LP+TPPPS组的差异不显著(P>0.05)。Micro(LP+TPPPS)组和LP+TPPPS组的绒毛高度和隐窝深度的比值显著高于PBS组(P < 0.05)，LP组略高于PBS组，但是差异不显著(P>0.05)。
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表 6 微胶囊对小鼠小肠绒毛的形态结构的影响 Table 6 Effects of microcapsules on morphological structure of ileal villi of mice |
益生菌能够影响动物体内微生态平衡，促进肠道内有益菌(如双歧杆菌、乳酸杆菌等)的生长繁殖，产生各种消化酶，提高消化酶活性，有利于营养物质的分解利用。然而，临床上菌液型微生态制剂在使用中会有多种因素影响其使用效果，如营养要求高、增殖速度慢、易受动物肠道内环境影响、不易在肠道内定植等。经研究表明益生菌摄入量达到107 CFU/g方可发挥保健功能[13]。因此，为益生菌提供有效的物理屏障抵御不利环境对于保证其益生效果是十分必要的。微胶囊固定化菌体细胞，以其能获得高密度菌体细胞、高产率、低污染及可重复利用的优势，已成为生物工程领域研究的一个热点[14]。
多糖是一类由各种相同或者不同的单糖及糖醛酸通过糖苷键连接缩合而成的高分子化合物，天然存在于动物、植物、微生物等各种有机体中，是维持生命活动的基础物质之一。多种植物多糖作为新型的添加剂已被证明有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射等多种生物学作用，并且具有无毒、无害、无残留等特点。本实验室近年来对TPPPS开展了一系列的研究，发现TPPPS能够显著提高獭兔的生产性能，改善免疫抑制小鼠的免疫功能，提高兔瘟组织灭活苗的免疫效果，对B亚群禽白血病(ALV-B)具有直接抑制作用。但是，多糖的物理化学性质受其分子质量、化学成分、结构和构象等因素的影响容易受到胃环境的破坏[15-16]，在实际应用过程中，采用注射或口服投喂的方式操作繁琐且损失多，不利于其在生产中的应用及推广。因此，为了提高益生菌的存活量以及避免TPPPS的生物学活性受到胃酸破坏，本试验将植物乳杆菌和TPPPS共同包被成微胶囊，以微胶囊包包埋率为指标，筛选最佳制备条件。在最佳条件下制备的微胶囊包埋率达81.6%，平均粒径为84.3 μm，球形度好，大小均匀，且具备较强的耐酸能力，提高了植物乳杆菌到达肠道的数量。因此，本研究制备的微囊膜为植物乳杆菌提供了均匀稳定的微环境，对细菌具有支持和保护作用，可长时间保存，解决了植物乳杆菌作为饲料添加剂效价不稳定的问题。
动物肠道菌群形成一个庞大而复杂的微生态平衡系统，在维持胃肠道健康方面起着重要作用，具有营养、屏障和免疫功能。益生菌进入机体后，在肠道具有抗原识别部位的淋巴组织集合上发挥免疫佐剂作用，活化肠黏膜内的相关淋巴组织，使分泌型IgA抗体分泌增强，从而抵抗外源有害微生物定植于肠道，形成生物屏障[17]。本试验通过对小鼠肠道菌定植情况的分析，发现植物乳杆菌联合TPPPS在有效促进小鼠肠道内乳酸菌增殖、抑制大肠杆菌增殖方面显著优于植物乳杆菌单独使用。这说明了植物乳杆菌和TPPPS联合使用具有协同作用，可协同改善肠道环境。
小肠是机体营养物质消化吸收的主要场所，肠道的健康对营养物质的消化、吸收和转运起着重要的作用[18]。肠绒毛高度增加能使小肠吸收营养物质的面积增大，所以肠绒毛的长短直接影响着动物的生长发育[19]。隐窝深度主要是反映上皮细胞的生成率，绒毛高度/隐窝深度则综合反映小肠的功能状态，比值下降表明肠道消化和吸收功能下降，影响营养物质的吸收，降低动物生产性能[20]。本试验通过对小鼠小肠形态学变化的分析，发现植物乳杆菌、植物乳杆菌+0.5% TPPPS、微胶囊能不同程度的提高小肠绒毛的高度，降低隐窝深度，提高二者的比值。并且，植物乳杆菌协同TPPPS的效果优于单独使用植物乳杆菌，经微胶囊技术包被后效果最佳。此外，本试验还发现植物乳杆菌联合TPPPS可以促进小鼠体重的增加，且效果显著优于植物乳杆菌单独使用。以上研究结果表明，植物乳杆菌联合TPPPS在促进小鼠体重增加、改善肠道环境及肠道发育方面具有协同作用，这与王永芬等[21-22]报道的黄芪多糖协同益生菌对鸡的益生效果显著优于益生菌和多糖单独使用相类似。这些研究结果表明植物乳杆菌和TPPPS能够改善肠黏膜发育，调节肠道微生物组成，从而促进小鼠生长发育。
4 结论本试验制备的植物乳杆菌-TPPPS微胶囊粒径均匀，包埋率高，能够耐受胃酸环境，保存期长，且该微胶囊可以显著改善小鼠肠道发育和微生态环境，促进生长，其效果显著优于植物乳杆菌单独使用。
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