2. 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室, 农业部动物免疫学重点实验室, 郑州 450002;
3. 甘肃农业大学生命科学技术学院, 兰州 730070
2. Key Laboratory of Animal Immunology, Henan Academy of Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Animal Immunology of Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450002, China;
3. College of Life Science Technology, Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China
玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是引起全球食品安全和畜牧饲料安全问题的主要生物毒素之一，长期摄入ZEN污染的饲料可引发雌激素过多综合征，导致生殖器官发生病变和功能障碍[1-2]。ZEN在玉米、小麦等谷物中污染范围特别广泛[3]，给养猪生产尤其是母猪繁殖性能造成巨大的危害[4]。关于ZEN影响母猪繁殖性能方面的研究报道较多，但对胎盘免疫相关基因表达量影响的研究尚属空白。Vlata等[5]发现高水平的ZEN(30 μg/mL)对人体的T细胞、B淋巴细胞的增殖具有抑制作用。ZEN在近几年玉米和配合饲料中的检出率和含量都很高[6-10]。因此，本试验旨在研究饲粮中低水平的ZEN对母猪繁殖性能及胎盘免疫相关基因表达量的影响，以期为ZEN引起的饲料安全问题提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验采用单因素试验设计，选择胎次相近、体重200 kg、妊娠30 d的长×大二元杂交母猪40头，随机分为2组(对照组和ZEN组)，每组20个重复，每个重复1头。试验期74 d。
1.2 试验饲粮及饲养管理参考NRC(2012) 猪营养需要标准配制基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。对照组饲喂基础饲粮，ZEN组饲粮在基础饲粮中添加1.5 mg/kg ZEN(购于Sigma公司)。试验在广州从化种猪场进行。试验期间每日饲喂2次(07:00和17:00)，消毒和免疫管理按照公司程序进行。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
在母猪分娩的12 h之内，记录试验组和对照组的每头母猪的每窝总产仔数、活产仔数、死胎数、木乃伊胎数，计算总产仔数、死胎数、弱仔猪数，并且在统计窝重的数据后再称重并计算仔猪初生重。
1.3.2 妊娠期母猪血清生殖激素及免疫指标测定在母猪妊娠第104天，晨饲前静脉采血10 mL，在室温下静置30 min，待血清析出后，3 000 r/min离心10 min，制成血清样品，-80 ℃条件下保存备用。血清生殖激素指标包括血清促卵泡素(FSHB)、孕酮(PG)、催乳素(PRL)含量，均采用《中国药典》2015年版紫外分光光度法吸收系数法或者酶联免疫法进行，试剂盒购自于北京奥科鼎盛生物科技有限公司。血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量通过紫外分光光度法测定，所有试剂盒、低分子质量标准蛋白Marker、酶标仪等均购自北京奥科鼎盛生物科技有限公司。
1.3.3 妊娠期母猪胎盘免疫相关基因表达量的测定母猪胎盘组织的提取参照产品说明书：取适量的试验期怀孕母猪胎儿胎盘组织放入研钵中，添加液氮后研磨到粉末状态，再移入匀浆器中后，然后再加入Trizol试剂2 mL左右，在常温状态下放置5 min；4 ℃、12 000 r/min离心10 min，用无菌移液器将上清移入另一离心管中。此时上清液由3部分组成：底层为苯酚-氯仿相层，以及中间层和上层水相层，RNA完全存在于水相层中。收集上清，用氯仿重复1次，离心15 min。按1 mL上清液加入75%乙醇，Trizol试剂4 mL左右加入75%乙醇，温和振荡离心管，经过悬浮沉淀后得到母猪胎儿胎盘组织总RNA。母猪胎儿胎盘组织特异性免疫、繁殖等相关基因及引物序列设计见表 2。
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表 2 基因及引物序列设计 Table 2 Gene and primer sequences design |
PCR反应体系为20 μL：引物各0.8 μL以及含200 ng DNA的蒸馏水溶液8 μL，加双蒸水(ddH2O)至20 μL。反转录PCR的反应步骤：先将提取的RNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。42 ℃预变性5 min，加入适量的ddH2O，使总体积达20 μL。轻轻混匀，设定PCR程序：95 ℃变性10 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火46 s。在适当的温度参数下扩增40~60循环：包括95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃反应15 s。PCR扩增试剂盒、DNA Marker，低分子质量标准蛋白Marker、焦碳酸二乙酯(DEPC)、RNA酶抑制剂、感受态制备试剂盒、质粒提取试剂盒、蛋白胨、DNA胶回收试剂盒均购自北京奥科鼎盛生物科技有限公司。具体操作按照说明书进行。
1.4 数据处理及统计分析采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，进行Duncan氏法多重比较，全部数据均采用平均值±标准误表示。P＜0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 ZEN对妊娠期母猪繁殖性能的影响由表 3可知，与对照组相比，饲粮中添加ZEN显著提高了妊娠期母猪死胎数和弱仔猪数(P＜0.05)，显著降低了母猪总产仔数(P＜0.05)；仔猪初生重虽有下降趋势，但差异不显著(P＞0.05)。
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表 3 ZEN对妊娠期母猪繁殖性能的影响 Table 3 Effects of dietary ZEN on reproductive performance of pregnant sows |
由表 4可知，与对照组相比，饲粮中添加ZEN显著提高了妊娠期母猪血清PG含量(P＜0.05)，但血清FSHB和PRL含量在2组间差异不显著(P＞0.05)。
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表 4 ZEN对妊娠期母猪血清生殖激素含量的影响 Table 4 Effects of dietary ZEN on serum reproductive hormone content of pregnant sows |
由表 5可知，对照组和ZEN组之间妊娠期母猪血清IgA、IgG、IgM含量无显著差异(P＞0.05)。
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表 5 ZEN对妊娠期母猪血清IgA、IgG、IgM含量的影响 Table 5 Effects of ZEN on serum IgA, IgG and IgM contents of pregnant sows |
由表 6可知，与对照组相比，饲粮中添加ZEN显著提高了妊娠期母猪胎盘中Toll样受体-2(TLR-2) 和孕酮受体(PGR)基因表达量(P＜0.05)，但2组间其他基因表达量差异均不显著(P＞0.05)
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表 6 对妊娠期母猪胎盘免疫相关基因表达量的影响 Table 6 Effects of dietary ZEN on expression of immunity related gene in placenta of pregnant sows |
ZEN是一种2, 4二羟基苯甲酸内酯，猪对其最为敏感[11]。Glavits等[12]发现ZEN可引起母猪阴门红肿，导致繁殖率低下、阴户肿胀、流产、乳房肿大，有时会导致新生仔猪死亡。Minervini等[13]研究发现，从妊娠第32天开始给母猪以及乳仔猪饲喂含9 mg/kg ZEN的饲粮，可导致后备母猪假发情，主要原因是ZEN交互作用，导致卵母细胞的染色体出现异常现象。Jadamus等[14]给母猪饲喂含ZEN的饲粮(180 mg/kg)，结果表明正在发情期的母猪出现一定比例的返情及正常怀孕母猪的流产率升高，表明生殖系统受到ZEN的破坏，初配母猪所产乳猪部分表现雌激素亢进症。本试验中，妊娠期母猪饲喂含1.5 mg/kg ZEN饲粮，不仅降低了母猪总产仔数和仔猪初生重，且显著提高了死胎率和弱仔猪数。
ZEN具有类似雌激素作用，可以竞争性地与动物体内雌激素受体结合，促进母猪体内雌激素反应信号通路激活，造成雌激素受体二聚化，进而引发一系列类似雌激素反应，导致母猪等产生雌性激素亢进症[15-16]。研究表明，饲粮中添加ZEN，母猪会出现卵巢萎缩、假发情、发情间隔延长、母猪流产、生产时出现畸形和死胎等症状[17-19]。在新生雌性大鼠注射ZEN的试验和小猪饲喂ZEN试验证实了ZEN的生殖毒性和致畸作用[13, 20]。说明ZEN及其生物转化产物会造成母猪产生雌激素过多综合征。本试验表明，饲喂添加ZEN饲粮的母猪血清PG含量显著高于对照组。说明饲喂低水平ZEN污染的饲粮能引起动物性早熟、发情周期延长、流产、返情等生殖机能异常，还可以导致胎儿生长下降、不育、胎儿畸形等。此外，摄入体内的ZEN主要在动物肝脏、肾脏中代谢，可引发肝脏、肾脏组织发生退行性变化。
研究表明，ZEN不仅造成正常细胞的凋亡，对于特定肿瘤细胞，如乳腺癌细胞，却具有刺激增殖的影响，是一种有丝分裂促进因子[21-25]。ZEN对细胞生长的影响同样呈现于免疫系统上，Vlata等[5]发现高水平的ZEN(30 μg/mL)对人体T细胞及B淋巴细胞的增殖具有抑制的现象。本试验饲粮中添加ZEN未显著影响妊娠期母猪血清免疫球蛋白含量。
妊娠期母猪胎盘是胚胎生长和发育所有的营养和废物排出的重要器官，也是抵抗子宫外界有毒有害重金属等物质侵袭胎儿的免疫屏障。本试验结果表明，饲粮中添加ZEN影响了胎盘先天性免疫相关基因Toll样受体信号途径的表达，从而影响妊娠期母猪胎盘的先天性免疫反应。胎盘先天性免疫基因Toll样受体是固有免疫中重要的识别受体，在先天性免疫反应中和病原体模式发挥重要作用，可识别1种或多种影响胎盘发育的的微生物病原体或病毒[26]。Toll样受体既是参与天然免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接天然性免疫和非天然性免疫的桥梁。在本试验中，ZEN组TLR-2、Toll样受体-4(TLR-4) 基因的低表达量，证明了ZEN具有抑制母猪胎盘的先天性免疫反应的能力，因此，胎盘免疫力较低会不利于胎儿正常的生长发育，从而显著提高了死胎数和弱仔猪数。
本试验中，ZEN组FSHB基因的高表达量，说明卵巢的储备功能差，不利于保护卵巢内的激素受体；PG的主要功能是促进子宫内膜加厚，腺体增大，为受精卵附着做准备。从PG含量的高低，可以判断卵巢滤泡与黄体的分泌。本试验中ZEN组PGR基因的高表达量，说明ZEN及其代谢产物扰乱内分泌系统，影响动物的排卵与胚胎附植。PRL在体内为腺垂体分泌的一种催乳激素，主要是功能促进泌乳，使已成熟的乳腺小叶向腺腔内泌乳。对乳腺的生长发育有决定性的作用。在妊娠中期由于PRL与雌激素、孕激素、糖皮质激素等一起协同作用，对卵巢性激素的合成、黄体生成及溶解有重要的作用。本试验中ZEN组催乳素受体(PRL-R)基因的高表达量，说明ZEN及其代谢产物有造成母猪不发情、假发情、假妊娠的症状产生。所以低水平的ZEN仍产生使母猪胚胎发育停止、死胎、流产、繁殖系统发育失常等现象。
4 结论妊娠期母猪饲粮中添加1.5 mg/kg ZEN可显著降低母猪总产仔数，并显著提高死胎数和弱仔猪数。饲粮中低水平的ZEN对母猪繁殖性能仍产生不利影响。
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