2. 佛山科学技术学院生命科学与工程学院, 佛山 528231;
3. 广州中国科学院先进技术研究所, 广州 511458
2. College of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, China;
3. Guangzhou Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 511458, China
草鱼与鲢鱼、青鱼、鳙鱼并称我国四大家鱼，因其肉质鲜美和营养价值高等特点深受广大消费者的青睐并且被广泛养殖。随着我国水产养殖业的不断扩大, 高密度、集约化的养殖模式导致草鱼病害的发生以及流行[1]。在过去的20年里，大量的兽药作为预防性抗生素被投放到水环境中，这种滥用抗生素行为将导致水环境中耐药细菌的出现和鱼类病原菌耐药性增强，导致土壤细菌、动物病原菌和人体病原菌间的耐药基因转移，导致沉积物和水层细菌群落的改变[2]，这使得提高草鱼免疫力、减少抗生素的使用成为主要的研究方向。近些年的研究表明，中药多糖作为饲料添加剂，具有毒副作用小、无残留等优点，在鱼类的生长、免疫以及消化性能等方面有着广阔的应用前景[3]。
玉屏风是由黄芪、白术、防风这3味中药组成[4]。其作用有益气固表、补脾实卫、止汗的功效。玉屏风多糖是将黄芪、白术、防风按一定比例混合后通过浸泡、水煮、加热浓缩、冷却离心以及醇沉法提取得到[5]。玉屏风散各组成药物的多糖成分均已被证实对机体免疫系统产生影响[6-9]。Yuan等[10]给鲤鱼注射不同剂量的黄芪多糖，结果发现头肾中的白介素(ILs)随着黄芪多糖注射量的增加其表达量也增加；毛俊浩的试验表明白术多糖可以促进小鼠淋巴细胞分泌白介素-2(IL-2)[11]；朱南山等[12]发现白术多糖可以提高猪血淋巴细胞干扰素γ(INF-γ)的分泌水平，纠正T细胞亚群分泌紊乱的状态；高鸿霞等[13]推测防风多糖提高自然杀伤(NK)细胞活性作用机制与促进IL-2活性、诱导淋巴细胞高表达IL-2有关。以上研究表明玉屏风多糖对机体的免疫性能有一定的改善作用。本试验在前人研究的基础上探讨不同比例玉屏风多糖对草鱼肠道绒毛形态及头肾中免疫相关基因IL-2、INF-γ和肠道中吸收相关钠葡萄糖转运蛋白1(SGLT-1)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2) mRNA相对表达量的影响，从而为玉屏风多糖在水产养殖中的应用提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与饲料草鱼：由佛山市南海百容水产良种有限公司提供。
玉屏风多糖：购自佛山德众药业有限公司，经实验室测定其总还原糖、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、水分和粗纤维的含量分别为34.20%、18.52%、0.71%、8.86%、8.21%和0.67%。
基础饲料组成及营养水平见表 1。
|
表 1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
试验选择750尾健康、平均体重为(74.50±2.50) g的草鱼，随机分为5组, 每组6个重复，每个重复25尾。对照组(Ⅰ组)投喂基础饲料，试验组(Ⅱ~Ⅴ组)投喂在基础饲料基础上分别添加0.8、1.2、1.6、2.0 g/kg玉屏风多糖的试验饲料。养殖试验统一选用200 L容积的养殖桶(桶体直径51 cm、口径40 cm、高度98 cm)，24 h通氧，3 d换1次水(每次为总水量的1/3)。预试期7 d，正试期28 d，按照日常生产方法投喂，每日09:00和17:00各投喂1次饲料，每次投食量为鱼群总重量的4%。
1.3 试验样品的采集与测定方法 1.3.1 肠道切片样品的采集与处理分别在正式试验开始后的第13、27天08：00开始禁食，第14、28天08：00每个重复随机选取1尾(每个组6尾)草鱼，在冰面上进行解剖，快速取出肠道，剔除肠道周围多余的脂肪，切取长度为1 cm左右的草鱼前肠道，用pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液冲洗肠道，于卡诺固定液中(无水酒精60 mL，氯仿30 mL，冰醋酸10 mL)固定，用石蜡包埋、切片，采用苏木精-伊红(HE)染色。用显微镜显示各组肠黏膜形态结构，测定肌层厚度，并在每个组织切片上选取5根走向平直、伸展良好的绒毛，用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件测定绒毛高度、隐窝深度，计算绒腺比(V/C)，即绒毛高度/隐窝深度。
1.3.2 主要免疫吸收指标基因表达测定样品的采集与处理在正式试验的第7、14、21和28天时，08：00投喂，09：00每组分别随机选取5尾草鱼，在冰面上进行解剖，快速取出肠道，剔除肠道周围多余的脂肪，用pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液冲洗肠道后，快速称取0.2 g的前肠，于已装有RNAfix液的Ep管中保存，24 h后将管中RNAfix液弃掉，-80 ℃保存。草鱼头肾的取样方式同前肠。
1.3.3 目的基因mRNA相对表达量的检测总RNA的提取与反转录参照PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒的说明书进行。
根据NCBI上公布的草鱼β2微球蛋白(β2m)基因序列(GenBank登录号：AB190815.1) 设计相对定量内参基因引物，根据NCBI上公布的草鱼IL-2基因序列(GenBank登录号：AF486820.1)、草鱼IFN-γ基因序列(GenBank登录号：FJ695519.1)、鲤鱼SGLT-1基因序列(GenBank登录号：JN867793.1) 和斑马鱼GLUT-2基因序列(GenBank登录号：NM_001042721.1) 设计相应的荧光定量引物(表 2)。以上所有引物由上海生物工程有限公司引物合成部(广州分公司)进行合成。
|
|
表 2 实时荧光定量PCR引物 Table 2 Primer sequences for RT-qPCR |
采用SYBR® Premix Ex TapTM Ⅱ试剂盒进行实时定量PCR试验。反应程序为：第1步，95 ℃ 30 s；第2步，95 ℃ 5 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共40个循环；第3步，绘制熔解曲线。反应体系为20 μL，包括：2×SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，正向引物(10 μmol/L) 0.8 μL，反向引物(10μmol/L) 0.8 μL，50× ROX Peference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。
目的基因的mRNA的相对表达量采用2-△△Ct法计算。Ct值为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数，模板的起始拷贝数越多，Ct值越小。计算公式如下：
△Ct(试验组)=试验组目的基因Ct-试验组内参基因Ct; △Ct(对照组)=对照组目的基因Ct-对照组内参基因Ct; △△Ct=平均值△Ct(试验组)-平均值△Ct(对照组); 目的基因mRNA相对表达量(试验组/对照组)=2-△△Ct。
比较2-△△Ct值的大小，就可以知道目的基因相对表达量的高低，从而得出目的基因mRNA的相对表达量差异。
1.4 试验数据的处理与分析试验数据采用Excel 2010进行初步处理，采用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行显著性检验，并采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析 2.1 玉屏风多糖对草鱼肠黏膜形态结构的影响由表 3可知，在草鱼饲料中添加不同比例的玉屏风多糖对草鱼的绒毛高度无显著影响(P>0.05)。第14天时，各试验组的隐窝深度均低于对照组，其中Ⅴ组与对照组的差异达到显著水平(P < 0.05)，且显著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组(P < 0.05)。试验第14天时，各试验组的绒腺比均高于对照组，其中Ⅴ组与对照组的差异到达显著水平(P < 0.05)，且显著高于Ⅱ组(P < 0.05)；试验第28天时，各试验组的绒腺比稍低于对照组，但差异均不显著(P>0.05)。试验第14天和28天时，各试验组的肌层厚度均高于对照组，但差异均不显著(P>0.05)。
|
|
表 3 玉屏风多糖对草鱼肠黏膜形态结构的影响 Table 3 Effects of Yupingfeng polysaccharide on intestinal mucosal morphology of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) |
由表 4可知，玉屏风多糖对IL-2和IFN-γ基因在草鱼头肾中不同时期的mRNA相对表达量具有一定影响，以对照组为基础，通过计算试验组与对照组的差异倍数，可以看出玉屏风多糖对草鱼头肾中IL-2和IFN-γ这2种免疫基因的mRNA相对表达量均有提高作用。
|
|
表 4 IL-2和IFN-γ mRNA在草鱼头肾中的相对表达量 Table 4 The relative expression levels of IL-2 and IFN-γ mRNA in head-kidney of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) |
对于IL-2的mRNA相对表达量，在试验第7天时，Ⅲ组显著高于对照组(P < 0.05)，Ⅳ组极显著高于对照组(P < 0.01)，Ⅱ和Ⅴ组与对照组差异不显著(P>0.05)；在试验第14和28天时，Ⅳ、Ⅴ组与对照组差异均极显著(P < 0.01)，Ⅱ、Ⅲ组与对照组差异不显著(P>0.05)；在试验第21天时，Ⅳ组显著高于对照组(P < 0.05)，其余各组与对照组没有显著差异(P>0.05)。
对于IFN-γ的mRNA相对表达量，在试验第7和21天时，各试验组与对照组均差异极显著(P < 0.01)；在试验第14天时，Ⅱ、Ⅳ组与对照组差异极显著(P < 0.01)，Ⅲ、Ⅴ组与对照组差异显著(P < 0.05)；在试验第28天时，Ⅱ组与对照组差异不显著(P>0.05)，Ⅲ、Ⅳ组与对照组差异显著(P < 0.05)，Ⅴ组与对照组差异极显著(P < 0.01)。
2.3 玉屏风多糖对吸收相关基因SGLT-1和GLUT-2在草鱼肠道中不同时期的mRNA相对表达量的影响由表 5可知，玉屏风多糖对吸收相关基因SGLT-1和GLUT-2在草鱼肠道中不同时期的mRNA相对表达量具有一定的影响。
|
|
表 5 SGLT-1和GLUT-2在草鱼肠道中的mRNA相对表达量 Table 5 The relative expression levels of SGLT-1 and GLUT-2 mRNA in intestine of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) |
对于SGLT-1 mRNA相对表达量，在试验第7天时，各试验组均高于对照组，其中Ⅱ组与对照组差异不显著(P>0.05)，Ⅲ、Ⅴ组显著高于对照组(P < 0.05)，Ⅳ组极显著高于对照组(P < 0.01)；在试验第14天时，Ⅱ组与对照组差异不显著(P>0.05)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组均极显著高于对照组(P < 0.01)；在试验第21天时，各试验组均极显著高于对照组(P < 0.01)；在试验第28天时，Ⅱ、Ⅳ组显著高于对照组(P < 0.05)，Ⅲ、Ⅴ组极显著高于对照组(P < 0.01)。
对于GLUT-2 mRNA相对表达量，在试验第7天时，Ⅱ组与对照组差异不显著(P>0.05)，Ⅲ组显著高于对照组(P < 0.05)，Ⅳ、Ⅴ组极显著高于对照组(P < 0.01)；在试验第14天时，Ⅱ组与对照组差异不显著(P>0.05)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组极显著高于对照组(P < 0.01)；在试验第21天时，Ⅱ、Ⅲ组显著高于对照组(P < 0.05)，Ⅳ、Ⅴ组极显著高于对照组(P < 0.01)；在试验第28天时，各试验组均高于对照组，但差异均不显著(P>0.05)。
3 讨论 3.1 玉屏风多糖对草鱼肠黏膜形态结构的影响从试验结果可以看出，投喂14 d后，玉屏风多糖可以降低草鱼肠黏膜隐窝深度，提高绒腺比，从而可以提高动物肠道的消化吸收能力。肠道不仅是动物机体消化吸收营养物质的重要场所，同时还具有免疫的功能，肠黏膜绒毛高度、隐窝深度、绒腺比和肌层厚度等都与肠道的消化吸收和免疫功能有密切的联系。研究表明，肠黏膜绒毛高度越高，肠道与营养物质接触的面积就越大，对营养物质的利用率就越高。通过隐窝深度可以看出隐窝细胞的增殖速度和细胞的发育程度，绒腺比是指黏膜绒毛高度与隐窝深度的比值，是肠道对营养物质吸收能力的综合反映[14]。向壔[15]指出肠道肌层厚度与肠道营养物质的消化率呈正相关关系，即肠道肌层厚度越厚，肠道对营养物质的吸收能力就越强。陶浩[16]研究发现黄芪多糖可以提高肉仔鸡十二指肠的绒毛高度、绒腺比及肌层厚度，并且可以降低隐窝深度。黄玉章等[17]研究发现黄芪多糖可以提高罗非鱼肠黏膜绒毛高度、肌层厚度，降低隐窝深度。赵燕飞等[18]研究得出白术多糖可不同程度提高断奶仔猪十二指肠和空肠的绒毛高度，加深十二指肠和空肠的隐窝深度。黄芪多糖、白术多糖为玉屏风多糖的重要组成成分，因此，可推测玉屏风多糖同样具有促进肠道隐窝细胞的成熟、加快肠绒毛上细胞的更新速度、促进细胞对营养物质的消化利用的功能。
3.2 玉屏风多糖对头肾中IL-2和IFN-γ mRNA相对表达量的影响荧光定量PCR结果发现，饲料中添加1.6 g/kg的玉屏风多糖能显著提高草鱼头肾中IL-2 mRNA相对表达量，添加1.2、1.6、2.0 g/kg玉屏风多糖能显著提高草鱼头肾中IFN-γ mRNA相对表达量。Li等[19]研究表明，给患有肾炎的小鼠注射黄芪多糖可以显著降低血液中IL-2的相对表达量，但是与正常小鼠没有显著差异，这可能是由于小鼠患病后血液中IL-2的含量升高，通过黄芪多糖的作用，使含量过高的IL-2恢复到正常水平。Chen等[20]研究发现黄芪多糖可以提高白罗曼公鸡血清中新城疫疫苗的抗体浓度和IL-2的含量，并且发现黄芪多糖和苦参碱共同作用可以显著提高血清中新城疫疫苗的抗体浓度及IL-2的含量。Yuan等[21]研究发现饲粮中添加不同比例的黄芪多糖可以促进断奶仔猪血清中IL-2及IFN-γ基因的表达。卢一松等[22]研究发现从中药白术提取的多糖成分可显著提高小鼠血清中IFN-γ的含量。邓桦等[23]试验表明玉屏风多糖可促进小鼠红细胞免疫功能的恢复，同时可显著提高IL-2和IFN-γ含量。由此可见，在饲料中添加适宜比例的玉屏风多糖能促进草鱼头肾中IL-2及IFN-γ的生成，进而发挥免疫增强作用。
3.3 玉屏风多糖对肠道中SGLT-1和GLUT-2 mRNA相对表达量的影响荧光定量PCR结果发现，饲料中添加1.2、1.6、2.0 g/kg玉屏风多糖均能提高草鱼肠道中SGLT-1和GLUT-2 mRNA相对表达量。葡萄糖是动物体内重要的能源物质，是新陈代谢的中间产物。葡萄糖主要在小肠中通过主动运输的方式被动物机体吸收，这个过程需要载体的参与才能完成[24]。肠道中，与葡萄糖转运相关的载体蛋白主要有SGLT-1和GLUT-2[25]。已有研究表明可以通过调节SGLT-1和GLUT-2的表达来影响机体对葡萄糖的吸收[26]。相关研究表明，SGLT-1和GLUT-2与葡萄糖具有相互促进的作用，肠道中的葡萄糖和类葡萄糖结构物质的增加可以提高转运蛋白的表达量[27]，SGLT-1和GLUT-2表达量的提高会促进肠道对葡萄糖的吸收利用[28-29]。玉屏风多糖中含有较多的葡萄糖和阿拉伯糖、半乳糖等类葡萄糖结构物质[30]，因此可以推测肠道中玉屏风多糖能通过提高草鱼肠道中SGLT-1和GLUT-2基因的表达来加快营养物质的吸收。
4 结论① 在草鱼饲料中添加一定量的玉屏风多糖能改善肠黏膜形态结构，促进肠道中SGLT-1和GLUT-2基因的表达，进而提高肠道吸收功能；同时，玉屏风多糖还能通过调控头肾中IL-2和IFN-γ基因的表达，增强机体免疫力，从而提高机体免疫能力。
② 从节约饲养成本出发，草鱼饲料中玉屏风多糖最适添加量为1.6 g/kg。
| [1] |
王清芳, 杨英, 周志敏, 等. 不同益生菌对草鱼生产性能的影响[J]. 养殖与饲料, 2016(5): 44-46. |
| [2] |
CABELLOF C, 张红林, 何力. 水产养殖业预防性抗生素的大量使用:一个日益严重的人与动物健康以及环境问题[J]. 淡水渔业, 2016, 46(6): 109-112. |
| [3] |
焦世璋. 中草药在水产养殖中的应用[J]. 中兽医学杂志, 2016(4): 73. |
| [4] |
高建, 李俊, 童成亮, 等. 玉屏风散中总苷的制备及含量测定[J]. 中国中药杂志, 2006, 31(6): 515-516. |
| [5] |
孙文静. 玉屏风多糖的制备及体内外增强免疫活性研究[D]. 硕士学位论文. 泰安: 山东农业大学, 2015.
|
| [6] |
周春权, 姚欣, 林静瑜, 等. 玉屏风粗多糖的提取及药理实验[J]. 海峡药学, 2004, 16(2): 38-40. |
| [7] |
杨震, 孙黎, 王炜佳. 防风成分的药理活性研究概况[J]. 黑龙江医药, 2005, 18(1): 36-37. |
| [8] |
崔彬, 李苑松. 黄芪多糖的药理研究进展[J]. 黑龙江科技信息, 2012(15): 29. DOI:10.3969/j.issn.1673-1328.2012.15.041 |
| [9] |
龙全江, 徐雪琴, 胡昀. 白术的化学、药理与炮制研究进展[J]. 中国中医药信息杂志, 2004, 11(11): 1033-1034. DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2004.11.058 |
| [10] |
YUAN C T, PAN X P, GONG Y, et al. Effects of Astragalus polysaccharides (APS) on the expression of immune response genes in head kidney, gill and spleen of the common carp, Cyprinus carpio L[J]. International Immunopharmacol, 2008, 8(1): 51-58. DOI:10.1016/j.intimp.2007.10.009 |
| [11] |
田允波, 许丹宁, 黄运茂, 等. 白术多糖免疫调控作用的研究进展[J]. 畜牧与兽医, 2010, 42(9): 98-100. |
| [12] |
朱南山, 张彬, 李丽立, 等. 白术多糖对仔猪血淋巴细胞转化及信号转导相关分子的影响[J]. 华北农学报, 2007, 22(2): 18-21. |
| [13] |
高鸿霞, 邵世和, 王国庆. 中药防风的研究进展[J]. 井冈山医专学报, 2004, 11(4): 12-14. |
| [14] |
黄玉章. 黄芪多糖对奥尼罗非鱼生长性能和免疫功能的影响[D]. 硕士学位论文. 福州: 福建农林大学, 2009. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10389-2009170349.htm
|
| [15] |
向壔. 家畜生理学原理[M]. 北京: 农业出版社, 1990.
|
| [16] |
陶浩. 黄芪多糖对肉仔鸡肠道发育及抗氧化能力的影响[D]. 硕士学位论文. 长春: 吉林农业大学, 2012. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10193-1013126759.htm
|
| [17] |
黄玉章, 林旋, 王全溪, 等. 黄芪多糖对罗非鱼肠绒毛形态结构及肠道免疫细胞的影响[J]. 动物营养学报, 2010, 22(1): 108-116. |
| [18] |
赵燕飞, 汪以真. 白术、微米白术和白术多糖对断奶仔猪生长性能和肠道形态及微生态区系的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2015, 51(1): 65-69. |
| [19] |
LI S G, ZHANG Y Q, ZHAO J X. Preparation and suppressive effect of astragalus polysaccharide in glomerulonephritis rats[J]. International Immunopharmacology, 2007, 7(1): 23-28. DOI:10.1016/j.intimp.2006.08.016 |
| [20] |
CHEN Y K, WANG D Y, HU Y L, et al. Astragalus polysaccharide and oxymatrine can synergistically improve the immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2010, 46(4): 425-428. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2010.02.004 |
| [21] |
YUAN S L, PIAO X S, LI D F, et al. Effects of dietary Astragalus polysaccharide on growth performance and immune function in weaned pigs[J]. Animalence, 2006, 82(4): 501-507. |
| [22] |
卢一松, 徐伟, 张岑容, 等. 含白术多糖油乳剂对口蹄疫疫苗免疫的增强作用[J]. 中国兽医学报, 2016, 36(6): 928-932. |
| [23] |
邓桦, 杨鸿, 仝锡瑶, 等. 玉屏风多糖对免疫抑制小鼠红细胞免疫功能的影响[J]. 中国兽医杂志, 2016, 53(2): 56-58. |
| [24] |
张敏, 孙权, 周嘉恒, 等. 维持机体糖稳态及葡萄糖的感受器:小肠葡萄糖转运体2研究进展[J]. 中国糖尿病杂志, 2016, 8(9): 571-573. |
| [25] |
ABBASI N N, PURSLOW P P, TOSH S M, et al. Oat β-glucan depresses SGLT1-and GLUT2-mediated glucose transport in intestinal epithelial cells (IEC-6)[J]. Nutrition Research, 2016, 36(6): 541-552. DOI:10.1016/j.nutres.2016.02.004 |
| [26] |
段娟慧, 巫冠中. SGLT1/SGLT2双重抑制剂——Sotagliflozin的研究概况[J]. 中南药学, 2015, 13(9): 947-950. DOI:10.7539/j.issn.1672-2981.2015.09.014 |
| [27] |
ENGELHARDT W V, LEONHARDMAREK S, BREVES G, et al.Ruminant physiology:digestion, metabolism, growth and reproduction[C]//Proceedings of the Eighth International Symposium on Ruminant Physiology.[S.l.]:[s.n.], 1995.
|
| [28] |
HUI D Y, HAYAKAWA K, OIZUMI J. Lipoamidase activity in normal and mutagenized pancreatic cholesterol esterase (bile salt-stimulated lipase)[J]. Biochemical Journal, 1993, 291(1): 65-69. DOI:10.1042/bj2910065 |
| [29] |
YASUTAKE H, GODA T, TAKASE S. Dietary regulation of sucrase-isomaltase gene expression in rat jejunum[J]. Biochimica et Biophysica Acta:General Subjects, 1995, 1243(2): 270-276. DOI:10.1016/0304-4165(94)00143-L |
| [30] |
黄樱华, 黄月纯, 张素中. 玉屏风汤剂多糖乙酰化物GC特征图谱研究[C]//2010年广东省药师周大会论文集. 广州: 广东省药学会, 2011.
|