丁酸梭菌是一种肠道厌氧益生菌，具有良好的促进动物肠道发育及提高畜禽生产性能的效果，是一种能够广泛应用于畜禽生产的新型绿色饲料添加剂。对于活菌型饲料添加剂而言，其对制粒及消化道极端环境的耐受性高低也就决定了其开发利用的可行性及在畜禽生产中应用的有效性。丁酸梭菌生长代谢后期能够形成芽孢，芽孢具有新陈代谢缓慢、含水量低、抗逆性强的特点^[1]。目前有少量关于丁酸梭菌抗逆性的研究发现丁酸梭菌具有一定的耐高温、耐胃酸、耐胆盐特性^[2-6]。本试验通过模拟饲料制粒生产及肉仔鸡的消化道环境，对丁酸梭菌对温度、压力、人工胃液及肠道消化酶的耐受性进行评价，旨在探究丁酸梭菌在畜禽饲粮中应用的可能性及影响因素。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

试验用丁酸梭菌为粉剂，活菌数为2×10¹¹ CFU/g，购自北京博创生物科技公司。

试验用主要试剂如下：TSN琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、磷酸盐缓冲液(PBS)，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；禽胆盐，购自凯玛生化有限公司。

试验用仪器如下：超净工作台(上海博讯实业有限公司)、精密型pH计(德国德图)、恒温水浴振荡器(SHA-B，湖南力辰仪器科技有限公司)、恒温培养箱(MCO-15AC，日本三洋)、厌氧培养罐(C-32，日本三菱)、厌氧产气袋(C-35，日本三菱)、真空压力瓶(西贝实验)。

本试验采用玉米-豆粕型肉仔鸡基础饲粮，按中华人民共和国农业行业标准NY/T 33—2004并结合肉鸡养殖情况配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。将肉仔鸡基础饲粮在160 ℃条件下高温干热灭菌150 min，冷却后调整水分至17%~18%，将丁酸梭菌菌粉与基础饲粮混合制得含有丁酸梭菌活菌数约10⁹ CFU/kg的试验饲粮。

1.2 试验方法 1.2.1 丁酸梭菌的高温耐受性试验

采用水浴模拟制粒温度，取试验饲粮于85 ℃^[7]水浴中分别作用2.5、5.0、7.5 min，对照组试验饲粮不作处理，每组设3个重复。将各组试验饲粮进行梯度稀释平板计数，测出丁酸梭菌活菌数，计算存活率。

1.2.2 丁酸梭菌的高压耐受性试验

模拟制粒压力，取试验饲粮置于真空压力瓶中，分别向瓶中通入氮气(N₂)至瓶内压力分别达到0.20、0.30、0.40 MPa^[8]，在此压力下处理5 min，对照组试验饲粮不作处理，每组设3个重复。将各组试验饲粮进行梯度稀释平板计数，测出丁酸梭菌活菌数，计算存活率。

1.2.3 丁酸梭菌的人工胃液耐受性试验

人工胃液的配制：以pH 7.00 PBS为基础，再用37%的盐酸将pH分别调至2.00、3.00、4.00，按0.89 U/mL的比例添加胃蛋白酶^[8]，充分溶解后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。

模拟肉鸡胃内消化环境，评价丁酸梭菌的人工胃液耐受性。取试验饲粮1 g于250 mL灭菌三角瓶中，准确加入无菌的pH为2.00、3.00、4.00的人工胃液各9 mL，对照组加入pH为7.00的PBS 9 mL，每组设3个重复；充分混合后放入41 ℃恒温水浴振荡器，设定转速为120 r/min，5 min后开始计时，48 min后取出^[9]。将人工胃液处理后的试验饲粮4 000 r/min离心后弃去上清收集沉淀，用无菌PBS清洗3次后用9 mL PBS重悬沉淀，梯度稀释平板计数，测出丁酸梭菌活菌数，计算存活率。

1.2.4 丁酸梭菌的肠道消化酶耐受性试验

肠道消化酶混合液的配制：将配制好的PBS调pH至6.00，按每毫升PBS中含有淀粉酶780.76 U、胰蛋白酶1.09 U、糜蛋白酶0.04 U、脂肪酶80.36 U的比例^[10]配制肠道消化酶混合液。充分溶解后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，现用现配。

模拟肠道消化环境，评价丁酸梭菌的肠道消化酶耐受性。取pH为3.00的人工胃液处理48 min后的试验样品1 mL，离心后弃去上清收集沉淀，用无菌PBS清洗3次后加入9 mL肠道消化酶混合液，对照组加入pH为7.00的PBS 9 mL，每组设3个重复；充分混匀后放入41 ℃恒温水浴振荡器，设定转速为120 r/min，5 min后开始计时，198 min后取出^[10]。将肠道消化酶混合液处理后的试验饲粮4 000 r/min离心后弃去上清收集沉淀，用无菌PBS清洗3次后用9 mL PBS重悬沉淀，梯度稀释平板计数，测出丁酸梭菌活菌数，计算存活率。

1.3 数据统计

采用Excel 2003对所有试验数据进行初步整理并计算存活率，使用SPSS 19.0中的单因素方差分析(one-way ANOVA)程序对活菌数进行差异显著性分析，当存在显著差异时用Duncan氏多重比较法检验组间差异显著性。P < 0.05表示差异显著。

2 结果与分析 2.1 丁酸梭菌的高温耐受性

如表 2所示，丁酸梭菌对高温具有一定的耐受性，但是对持续长时间的高温耐受性不佳。丁酸梭菌经85 ℃处理2.5、5.0、7.5 min后活菌数均与对照组差异显著(P < 0.05)。随着处理时间的增加，存活率逐渐下降，但下降的幅度逐渐减小。虽然在活菌数上各试验组与对照组均存在显著差异(P < 0.05)，但应考虑到丁酸梭菌的活菌数基础数值高，而高温并未使其活菌数在数量级上发生改变。

2.2 丁酸梭菌的高压耐受性

如表 3所示，0.20、0.30 MPa组丁酸梭菌的活菌数较对照组显著降低(P < 0.05)，0.30 MPa组丁酸梭菌的活菌数与对照组差异不显著(P < 0.05)。0.20 MPa组丁酸梭菌的存活率最低，为64.38%；0.30、0.40 MPa组丁酸梭菌的存活率逐渐升高，分别为87.14%、101.74%。

2.3 丁酸梭菌的人工胃液耐受性

如表 4所示，各试验组丁酸梭菌的活菌数均与对照组差异不显著(P>0.05)，但pH 2.00和3.00组丁酸梭菌的存活率略高于对照组。

2.4 丁酸梭菌的肠道消化酶耐受性

如表 5所示，丁酸梭菌经肠道消化酶处理后活菌数与对照组相比差异显著(P < 0.05)，肠道消化酶处理后丁酸梭菌的存活率仅为47.71%。

3 讨论 3.1 丁酸梭菌的高温耐受性

关于丁酸梭菌对高温耐受性的研究，研究者的方法不尽相同。王腾浩^[2]将丁酸梭菌菌液置于不同温度下水浴15 min，处理温度低于75 ℃时，其存活率能保持在84.23%以上，而当温度上升至80 ℃时存活率仅为27.41%；谢树贵^[3]的研究表明，丁酸梭菌菌液经80 ℃处理30 min后存活率为6.48%。但以上研究均为丁酸梭菌在液体环境下进行的温度耐受性试验，而本研究旨在讨论在饲料制粒工艺条件下，即丁酸梭菌菌粉混合肉仔鸡基础饲粮情况下对温度的耐受性。研究结果表明，在85 ℃环境下处理2.5 min后丁酸梭菌的存活率为70.43%，随着温度的升高，丁酸梭菌的存活率逐渐下降。因此可知，饲料调制及制粒时，高温会影响丁酸梭菌的活性，时间过长会造成丁酸梭菌的大量灭活，影响其使用效果。

3.2 丁酸梭菌的高压耐受性

关于丁酸梭菌对高压耐受性的研究未见报道，但是确有报道指出某些芽孢对高压环境有一定的抗性^[11]。本试验结果表明，0.20、0.30 MPa压力下处理丁酸梭菌5 min后活菌数显著低于对照组，而0.40 MPa压力下处理丁酸梭菌5 min后，其活菌数与对照组相比差异不显著。由此可知，丁酸梭菌能够耐受一定范围的制粒压力。

3.3 丁酸梭菌的人工胃液耐受性

益生菌对消化道酸性环境的胁迫具有一定的应激反应，以保证其在消化道酸性环境的作用下得以存活^[12]。王腾浩^[2]、廖秀冬^[4]的试验报道，丁酸梭菌在胃酸处理后其存活率均有不同程度的下降，但差异不显著。在本试验中，pH为2.00、3.00、4.00的人工胃液处理48 min后，各试验组丁酸梭菌的活菌数与对照组相比均差异不显著，说明丁酸梭菌具有一定耐受胃酸的能力。

3.4 丁酸梭菌的肠道消化酶耐受性

经过肠道消化酶处理后丁酸梭菌的活菌数显著低于对照组，这一结果与王腾浩^[2]、欧阳志周等^[5]的研究结果不一致，可能原因是本试验中试验饲粮提前在人工胃液中处理过，在这个过程中有部分芽孢被激活而转变为营养体，其抗逆性能减弱，继续接受肠道消化酶处理后，导致大量营养体被人工肠液中的消化酶破坏。将试验饲粮提前在人工胃液中处理能够最大限度地模拟试验饲粮在肉仔鸡体内的情况，因此可以推断丁酸梭菌在肉仔鸡肠道中对肠道消化酶的耐受性较低。

4 结论

① 在模拟饲料制粒高温条件下处理丁酸梭菌，其存活率随着处理时间延长而下降。

② 在不同压力条件下处理丁酸梭菌，其存活率随压力上升而呈现降低趋势。

③ 丁酸梭菌对人工胃液有一定的耐受性。

④ 丁酸梭菌对肠道消化酶的耐受性较低。