抗生素作为饲料添加剂应用已经有几十年的历史，饲料中添加抗生素己成为提高养殖效益的“非常手段”。但随着抗生素的使用越来越广泛，问题也开始慢慢出现。滥用抗生素引发双重感染，细菌耐药性使得常见疾病的治愈越发困难；畜产品中抗生素残留引起消费者中毒或者过敏；残留物排放污染水体和土壤，破坏生态平衡。
为减少抗生素的使用，抗生素替代类添加剂开发与筛选成为研究热点。寡糖就是其中一类逐渐被人们重视的产品。研究证实，壳寡糖能减少畜禽腹泻发生，并缓解其他与感染有关的现象，对动物生长性能、干物质和氮表观消化率有积极影响[1-2]。本试验拟通过探讨壳寡糖对断奶仔猪细胞免疫、体液免疫以及抗体效价的影响，以了解壳寡糖对断奶仔猪理化指标及免疫力的影响，并获得壳寡糖在仔猪饲粮中的应用方案。
1 材料及方法 1.1 试验材料壳寡糖：由秦皇岛领先生物农业股份有限公司提供，有效成分含量75%，深褐色，平均分子质量≤2 500 u，脱乙酰基度≥90%。
1.2 试验设计与动物选择品种相同、体重相近、21日龄断奶、健康“杜长大”杂交断奶仔猪256头，按照遗传背景相同、性别比例一致的原则随机分为4个组，每组设4个重复，每个重复16头仔猪，各组之间初始体重差异不显著(P>0.05)。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加50、100和150 g/t壳寡糖的试验饲粮。预试期7 d，试验期28 d。
1.3 试验饲粮仔猪饲喂玉米-豆粕型饲粮，不含抗生素。饲粮参照NRC(2012) 和我国《猪饲养标准》(NY/T 65—2004) 配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验在河北汉唐牧业有限公司内的同一栋封闭式猪舍内进行，试验仔猪采用分栏饲养，猪舍内温湿度适合；试验猪自由采食和饮水，常规的消毒免疫，试验由专人负责。参照本品种仔猪的饲养规程进行管理。
1.5 样品采集与处理试验结束前3天，每个组随机取8头猪，颈静脉采血20 mL，其中10 mL加入肝素抗凝管中做抗凝处理，另10 mL于普通离心管中，低温静止30 min，3 000 r/min离心15 min，收集上清液即血清，-20 ℃保存待测。
1.6 测定指标及方法血清抗体：采用猪的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的含量以及猪瘟、伪狂犬、蓝耳抗体效价，所有指标检测严格按照试剂盒上的说明步骤进行。
细胞免疫：采用ELISA试剂盒按照说明书步骤测定血清中白细胞介素-6(IL-6) 和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。
全血常规生理指标：采用迈瑞医疗国际有限公司BC-2800Vet全自动血液分析仪测定白细胞数、红细胞数、血红蛋白含量、血小板数等。
血清生化指标：采用荷兰威图Microlab300半自动生化分析仪，按照试剂盒(购自中生北控生物科技股份有限公司)说明书测定谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、碱性磷酸酶(APK)活性以及总蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)和甘油三酯(TG)含量。用天门冬氨酸底物法测定血清GOT活性，用丙氨酸底物法测定血清GPT活性，用NPP底物-AMP缓冲液法测定APK活性；用双缩脲法测定血清TP含量，用溴甲酚绿法测定血清ALB含量。
1.7 数据统计与分析应用SPSS 19.0统计软件的ANOVA模型进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较，结果表示为平均值±标准差，以P＜0.05作为差异显著，以P＜0.01作为差异极显著。
2 结果与分析 2.1 饲粮中添加壳寡糖对断奶仔猪免疫力的影响由表 2可知，与对照组相比，试验1组、试验2组和试验3组血清IgA含量分别提高了45.40%(P < 0.05)、2.62%(P>0.05) 和137.26%(P < 0.01)；试验1组和试验2组血清IgG含量分别较对照组提高了4.47%和10.92%(P>0.05)，血清IgM含量分别比对照组提高了9.29%和5.69%(P>0.05)；与对照组相比，试验1组、试验2组和试验3组血清TNF-α含量分别提高了51.76%(P < 0.01)、29.42%(P>0.05) 和88.29%(P < 0.01)；试验2组血清IL-6含量较对照组提高了14.28%(P>0.05)。
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表 2 饲粮中添加壳寡糖对断奶仔猪免疫力的影响 Table 2 Effects of dietary chitosan oligosaccharide on immunity of weaned piglets |
与对照组相比，各试验组血清伪狂犬抗体效价均有不同程度提高，其中试验3组提高了46.51%(P < 0.05)；与对照组相比，试验1组、试验2组和试验3组猪瘟抗体效价均高于对照组，分别提高了5.40%、5.40%和18.92%(P>0.05)；试验1组、试验2组和试验3组蓝耳抗体效价与对照组相比分别提高了17.65%(P>0.05)、29.41%(P>0.05) 和47.06%(P < 0.05)。
2.2 饲粮中添加壳寡糖对断奶仔猪血液指标的影响由表 3可知，饲粮中添加壳寡糖对断奶仔猪血液白细胞、红细胞、血小板数和血红蛋白含量没有显著影响(P>0.05)，且试验组间无显著差异(P>0.05)；与对照组相比，试验1组、试验2组和试验3组血液白细胞数分别降低了16.45%、16.71%和16.29%，但各组间差异不显著(P>0.05)；与对照组相比，试验2组、试验3组血液红细胞数提高了26.65%、1.74%，试验1组降低了8.04%；试验组血液血小板数均不同程度高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。
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表 3 饲粮中添加壳寡糖对断奶仔猪血液指标的影响 Table 3 Effects of dietary chitosan oligosaccharide on blood indices of weaned piglets |
与对照组相比，试验1组、试验2组和试验3组血清GOT活性分别降低了26.71%(P < 0.01)、7.56%(P>0.05) 和16.64%(P < 0.05)，血清GPT活性分别降低了47.26%(P < 0.05)、47.28%(P < 0.01) 和21.88(P>0.05)，血清APK活性分别提高了6.37%、16.78%和1.24%(P>0.05)；试验2组和试验3组血清CREA含量分别提高了12.25%和26.41%(P>0.05)；试验1组和试验3组血清TG含量分别提高了25.84%和5.62%(P>0.05)；与对照组相比，各试验组血清TP、ALB以及GLB含量均不同程度提高，但均差异不显著(P>0.05)。
3 讨论 3.1 饲粮中添加壳寡糖对断奶仔猪免疫力的影响免疫球蛋白是一类重要的免疫效应分子，IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，也是体内最主要的免疫球蛋白，它的含量反映生物体的免疫状况；IgM是分子量最大的免疫球蛋白，在机体的初次免疫应答中最早产生的免疫球蛋白；IL-6和TNF-α是被激活的巨噬细胞分泌的2种重要的细胞因子，IL-6可以促进淋巴细胞的增殖并参与T淋巴细胞、细胞毒T细胞(CTL)、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的活化。IL-6和TNF-α在提高机体免疫力的同时，可促进炎症反应，是具有抗炎和促炎双重作用的细胞因子，血清中IL-6和白细胞介素-1β(IL-1β)含量是应激时炎症反应最具代表性的指示物[3]。
试验发现，寡糖的添加可以调节血清中的免疫球蛋白含量[4-5]。Huang等[6]研究了壳寡糖对肉鸡的影响，发现壳寡糖组肉鸡血液中的免疫球蛋白数量显著增加，壳寡糖对提高肉鸡的免疫力有一定的作用。Tang等[7]报道，饲粮中添加250 mg/kg壳寡糖，可提高血液中白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2) 和IL-6以及IgA、IgM和IgG含量。壳寡糖对仔猪血清免疫球蛋白也有影响，饲粮中添加0.01%~0.05%的壳聚糖可提高血清免疫球蛋白含量，并与添加剂量有关系[8-9]，Yin等[10]亦有类似报道。本试验结果显示，仔猪饲粮中添加壳寡糖显著提高了血清IgA和TNF-α含量，这与上述报道一致。而血清IgG、IgM以及IL-6的结果却与报道并不一致，可能是因为饲养环境不同、试验所选择动物种类不同以及壳寡糖的添加量不同而导致。
添加甘露聚糖酶可以提高机体的细胞免疫功能和体液免疫功能，当仔猪进行猪瘟、伪狂犬等免疫接种后，体内B淋巴细胞通过对抗原的识别、活化、增殖，最后分化成浆细胞并分泌抗体，产生的抗体进入血液。李学俭等[11]研究报道，甘露寡糖可以提高猪瘟抗体效价，这可能是由于寡糖可以竞争性吸附排除病原菌及特异性结合毒素，作为这些外源抗原的佐剂，减缓了抗原的吸收时间，从而增强了抗原的效价[12]。本试验中添加壳寡糖确实在不同程度上提高了断奶仔猪伪狂犬、猪瘟、蓝耳的抗体效价。
3.2 饲粮中添加壳寡糖对断奶仔猪全血生理指标的影响本试验中，各壳寡糖添加组的白细胞数与对照组相比有降低的趋势，白细胞能直接参与细胞介导的免疫反应和吞噬作用[13]。Lin等[14]在基础饲粮中添加2 000 mg/kg壳寡糖，饲养锦鲤后研究发现，血清中的总白细胞数显著增加。苏鹏等[15]在红鳍东方红鳟饲粮中添加壳寡糖，结果显示对红鳍东方纯血清中白细胞数量无显著影响。本试验研究发现饲粮中添加壳寡糖对断奶仔猪中白细胞数有降低的趋势，但不显著。这与其他人的研究有一定的差异，具体原因还需进一步的研究证明。
3.3 饲粮中添加壳寡糖对断奶仔猪血清生化指标的影响动物机体血清生化指标与机体代谢、营养状况和疾病有密切的关系，血清生化指标可在一定程度上反映动物机体在生理和病理上的变化[16]。霍圃宇等[17]试验中表明，饲料中添加壳寡糖后大菱鲆幼鱼血液GOT和GPT活性没有显著变化，其中添加量为200 mg/kg壳寡糖组这2种酶活性明显低于对照组。刘含亮等[18]在研究中发现壳寡糖降低了虹鳟血清GOT和GPT活性，但差异不显著。GOT和GPT主要存在心肌细胞和肝细胞中，只有当这些细胞受损时，才可使血清中这2种酶含量升高，试验证实，添加适量的壳寡糖对仔猪肝脏、心肌有一定的保护作用[19-20]。本试验中，GOT和GPT活性降低，与报道一致，说明壳寡糖对肝功能的调节有一定的作用。
血清TP含量也可以反映机体的营养和免疫状况[21]，其含量升高是蛋白质代谢旺盛的体现，有利于机体对蛋白质的吸收和利用，从而降低饲料消耗[22]。孙立威等[23]研究表明，饲粮中添加适量的壳寡糖可以显著降低吉富罗非鱼幼鱼血清中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量。Tang等[7]研究了壳寡糖对猪仔的影响，发现饲粮中添加寡糖可以降低血清总胆固醇和TG含量，减少断奶时血清中抗体水平的负面影响。Li等[24]研究了壳寡糖对鸭的影响，发现作为膳食补充剂，壳寡糖有降低肉鸡血脂的作用，能降低肉鸡血清TG和总胆固醇含量。而血脂保持在较低水平时有助于防治高血脂疾病的发生，在一定程度上提高了机体的免疫力。本试验中，不同添加量壳寡糖能够提高血清TP含量，说明壳寡糖对断奶仔猪的蛋白质沉积和合成具有一定的促进作用。且本试验前期试验表明，试验2组和试验3组与对照组相比，生长速度分别显著提高了7.93%和14.02%，料重比显著降低了11.02%和12.27%[25]，更加验证了一致性。
血清中的APK与脂肪糖类和蛋白质的吸收与运输密切相关[22, 26]。李振达等[27]研究发现，添加壳寡糖对三疣梭子蟹APK活性无显著影响。本试验结果显示，不同壳寡糖添加量对仔猪血清APK活性影响不显著，这与上述研究结果一致。
4 结论① 壳寡糖可以显著降低断奶仔猪血清GOT和GPT活性，提高血清TP含量。
② 壳寡糖可以提高断奶仔猪体液免疫和细胞免疫能力。饲粮中添加50和150 g/t壳寡糖可以显著提高断奶仔猪血清IgA含量，显著提高断奶仔猪血清TNF-α含量。
③ 壳寡糖可以显著提高仔猪血清抗体效价，改善机体健康水平。饲粮中添加150 g/t壳寡糖可以显著提高断奶仔猪血清伪狂犬抗体效价和蓝耳抗体效价。
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