2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室, 湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心, 长沙 410125;
3. 仲恺农业工程学院动物科学技术学院, 广州 510225;
4. 宁乡县畜牧兽医水产局, 宁乡 410600
, XING Yueteng1,2, ZHANG Yang1, CHEN Yuguang1, SHU Xugang3, LIU Xingliang4, ZHANG Bin1
, WU Xin1,2,3
2. Research Center of Healthy Breeding of Livestock and Poultry, Hunan Engineering and Research Center of Animal and Poultry Science, Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. College of Animal Science and Technology, Zhongkai University of Agricultural and Engineering, Guangzhou 510225, China;
4. Ningxiang Animal Husbandry, Veterinary and Aquatic Products Bureau, Ningxiang 410600, China
半胱胺(cysteamine，CS)又名β-巯基乙胺，是乙酰辅酶A的组成部分，又是半胱胺酸盐的脱羧产物，因含有活性的巯基和氨基而在动物体内具有促进营养物质代谢、改善胴体品质等多种生物学功能[1-2]。CS改善三元猪胴体性状、肉质和血清生化指标的报道很多[3-6]，但在地方猪上研究较少。宁乡猪是我国四大名猪之一，具有适应性广、蓄脂力强等特点，是典型的脂肪型猪种，但目前却缺乏对其脂肪代谢的深入了解。有研究表明，在宁乡猪肥育后期饲粮中添加CS可影响其生产性能[7]。我们前期的研究结果表明，CS可提高宁乡猪屠宰率，且肉品质的改善可能是通过降低硬脂酸和提高亚油酸的含量实现的[8]。在前期研究基础上，本试验旨在进一步研究CS对宁乡猪血清生化指标、肝脏脂肪酸组成以及与脂肪代谢相关基因表达量的影响。
1 材料与方法 1.1 试验设计本试验采用单因素试验设计。试验前，选择肥育猪场同栋栏舍、同一批次、体重约43 kg的宁乡阉公猪30头，随机分为2组，分别设为对照组和试验组，每组5个重复，每个重复3头。
1.2 试验饲粮及饲养管理参照NRC(2012) 并结合宁乡猪的饲粮配方配制本试验基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。试验组在基础饲粮中添加80 mg/kg CS(纯度为64.5%，由广州天科生物科技有限公司提供)。试验在湖南宁乡大龙畜牧科技有限公司进行。试验期8周。试验期间，每日饲喂3次(08:00、12:00和18:00)，消毒和免疫管理按照猪场程序进行。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
血清收集：试验结束时，每个重复挑选1头猪进行前腔静脉采血10 mL于离心管中，室温静置1 h后4 ℃、3 000 r/min离心15 min，收集血清分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃保存。采用氧化酶法检测血清尿素氮(UN)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。
1.3.2 组织样品采集饲养试验结束时，禁食24 h，自由饮水。每个重复挑选1头猪进行屠宰，取肝中叶于锡箔纸包装好，放入液氮，速冻后转至-80 ℃冰箱中保存。
1.3.3 肝脏中长链脂肪酸含量测定将肝脏样品冷冻干燥后，称0.5 g左右，长链脂肪酸测定参照喻文娟等[9]用外标气相-色谱-质谱法于中国科学院亚热带农业生态研究所实验室进行。
1.3.4 肝脏中脂肪代谢相关基因表达量测定采用Trizol(Invitrogen公司，美国)法提取组织中总RNA，具体操作方法参照Simms等[10]，然后将RNA浓度调节一致，取1 000 ng进行反转录，反转录试剂盒购于TaKaRa公司，具体方法按说明书进行。再利用Real-Time PCR方法检测mRNA的表达量，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(引物序列见表 2)，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，以磷酸甘油脱氢酶(GDPH)、过氧化物酶增殖体激活受体α(PPARα)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、乙酰辅酶A羧化酶α(ACCα)、肝X受体α(LXRα)和脂肪酸合成酶(FASN)为目的基因进行相对定量分析其表达量。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
试验数据经Excel 2010初步整理后，运用SPSS 21.0统计软件中的独立样本t型检验进行各组间差异显著性比较，结果以“平均值±标准误”表示，以P < 0.01为差异极显著，P < 0.05为差异显著，以P < 0.10为差异显著性趋势。
2 结果 2.1 CS对宁乡猪血清生化指标的影响由表 3可知，与对照组相比，试验组血清中TC、GLU、HDL和LDL含量分别提高了9.75%(P < 0.10)、21.91%(P < 0.01)、23.53%(P>0.10) 和26.22%(P < 0.01)，UN含量降低了14.14%(P < 0.05)。
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表 3 CS对宁乡猪血清生化指标的影响 Table 3 Effects of CS on serum biochemical indices of Ningxiang pigs |
由表 4可知，与对照组相比，试验组饱和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)中肉豆蔻酸、棕榈酸和花生酸含量分别降低了72.09%(P < 0.01)、13.12%(P < 0.05) 和71.13%(P < 0.01)，十七烷酸含量提高了11.77%(P < 0.10)；单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)含量提高了40.37%(P < 0.01)，其中反油酸含量降低了85.90%(P < 0.01), 油酸含量提高了55.80%(P < 0.01)；多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)含量降低了7.56%(P < 0.05)，其中亚油酸含量降低了18.56%(P < 0.01)，二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳三烯酸含量分别提高了96.13%和37.99%(P < 0.01)。
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表 4 CS对宁乡猪肝脏中长链脂肪酸含量的影响 Table 4 Effects of CS on liver long-chain fatty acid contents of Ningxiang pigs |
由图 1可知，与对照组相比，试验组肝脏中GAPH、PPARα、ATGL和LXRα表达量分别提高了41.00%(P>0.05)、89.00%(P < 0.05)、25.00%(P>0.05) 和16.00%(P>0.05)，ACCα和FASN表达量分别降低了37.00%和25.00%(P>0.05)。
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柱形标注*表示与对照组相比差异显著(P < 0.05)。 Columns with * superscripts mean significantly different compared with the control group (P < 0.05). 图 1 CS对宁乡猪肝脏中脂肪代谢相关基因表达量的影响 Figure 1 Effects of CS on the expression levels of genes involved in lipid metabolism in liver of Ningxiang pigs |
血液中各种生化成分是动物体生命活动的物质基础，其含量变化是反映动物机体新陈代谢和营养物质沉积的重要指标，且主要受饲粮营养水平、动物生长发育阶段和内分泌状况等因素的影响[11]。血清TG、TC和HDL是反映血脂代谢常用的指标[12]。本试验研究结果显示，肥育猪饲粮中添加CS能提高血清TC的含量，这与前人的试验结果[13]一致。胆固醇的合成原料为乙酰辅酶A，其合成和降解受机体激素和其他因素的影响[14]。甲状腺素促进3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶和胆固醇的合成，而胰高血糖素、糖皮质类激素则抑制HMG-CoA还原酶的生成，减少TC的合成。CS一方面通过对生长抑素的耗竭，解除其对胰岛素和甲状腺素的抑制；另一方面通过增加乙酰辅酶A的合成影响机体对胆固醇的转化，从而使血清TC含量提高。血清UN含量间接反映动物机体对蛋白质的利用率，其含量与蛋白质利用率呈负相关[15-16]。本试验的结果发现试验组血清UN含量降低，表明饲粮添加CS促进了体内蛋白质代谢，进而增强其利用率，这与朱宇旌等[17]和雷胜辉等[18]的试验结果一致。有研究表明LDL在血液中起到运输脂类尤其是胆固醇的作用[19]，在饲粮中添加CS有降低血清TG和TC含量的趋势[20]。关于饲粮中添加CS对猪血清生化指标的作用差异较大，可能与猪的品种、体重和饲粮成分有关。本试验发现，饲粮中添加CS降低了血清中UN含量，提高了GLU和LDL含量，表明CS可能影响蛋白质的代谢。
3.2 CS对宁乡猪肝脏中长链脂肪酸含量的影响脂肪酸可分为SFA、MUFA和PUFA[21]。本试验结果表明，与对照组相比，试验组MUFA含量极显著提高，SFA含量无显著差异；但是，试验组SFA中肉豆蔻酸、棕榈酸和花生酸含量显著降低，十七烷酸含量有提高的趋势。有研究表明肉豆蔻酸可以提高血清中TC含量，棕榈酸能降低血清中TC的含量[22]。有关大鼠的研究发现，硬脂酸降低TC吸收的机理在于其降低了TC的溶解，同时对胆酸的生成进行调节[23]。油酸有降低花生四烯酸、血清TC和低密度脂蛋白含量及保护棕榈酸的作用[24]。PUFA中亚油酸可以降低血清TG和LDL含量，提高HDL含量[25]。DHA可降低血清TG、TC和LDL含量，提高HDL含量，从而改善血液循环，降低血液黏度[26-27]。这表明肝脏中SFA、MUFA中一些脂肪酸的降低可能是CS在肝脏中降低TC时，引起脂肪酸含量的变化，其具体的作用机制有待进一步深入研究。不过，试验组血清TC含量是提高的，这可能是负反馈调节的作用。
3.3 CS对宁乡猪肝脏脂肪代谢相关基因表达量的影响肝脏是脂肪代谢的主要场所，在脂肪代谢过程中，关键性的酶有GAPH、PPARα、ATGL、ACCα、FASN与LXRα等，其中ATGL、PPARα与LXRα是肝脏中脂肪分解代谢的关键酶，ACCα、FASN是脂肪酸合成的关键酶。本试验结果表明，与对照组相比，试验组肝脏中PPARα表达量显著增加。PPARα在肝细胞表达较高，通过对肝脏脂质代谢相关基因转录水平的调控，参与脂肪酸降解、合成、运输、储存等维持正常的脂质代谢[28-30]。另外，PPARα参与胆固醇代谢、糖代谢的调节及促进高密度脂蛋白的生成[31]。饲粮中添加CS可提高胰岛素的含量[32]，从而促进脂肪的合成，胰岛素还能通过细胞自制和脂肪细胞分解调节肝脏PPARα。有研究表明，PPARα基因表达上调可以促进脂肪酸的氧化过程，并参与DHA的合成[33]。此外，ATGL是TG水解的限速酶，GAPH是TG代谢中一个重要的酶[34]。本试结果表明，CS促进肝脏脂肪酸的氧化，改善了机体脂肪代谢。
4 结论在宁乡猪肥育猪饲粮中添加CS能提高肝脏中DHA的含量，可能是通过调控肝脏的脂肪代谢基因PPARα的表达，进而影响机体的脂肪代谢。
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