我国肉鸡业发展迅速且规模不断扩大，与此同时，鸡场排出的大量粪便所产生的臭气对环境的污染也不断加剧。通过营养学技术从根源上减少养鸡业的臭气污染，越来越引起人们的广泛关注[1]，对促进肉鸡业持续、健康发展和探索环境友好型畜牧业具有重要科学意义。粪臭素是微生物降解L-色氨酸(L-tryptophan，L-Try)的代谢产物，是引起猪鸡排泄物产生恶臭的主要物质之一[2-3]。研究表明，L-Try的可利用度和肠道微生物的组成和活力是影响动物肠道粪臭素浓度的主要因素[4]。肉仔鸡盲肠粪臭素浓度显著高于回肠和直肠，其浓度差异主要与肠道菌群多样性和丰富度有关[5]。大豆低聚糖(SBO)是以大豆及其加工副产品为原料生产的、含有一定量的水苏糖(STA)、棉籽糖(RAF)和蔗糖(SUC)等低聚糖的产品(GB/T 22491—2008)。一般75%的SBO中，含18%STA、6%RAF、24%SUC[6]。Coon等[7]报道，火鸡对RAF和STA的回肠消化率不足1%，但排泄物消化率高达84%~90%，进一步说明了SBO及其功能组分主要在禽类后肠道被微生物利用。Li等[8]研究了不同纤维源在猪直肠菌群作用下对L-Try体外代谢的影响，结果表明体外培养体系中粪臭素的产生受到直肠微生物组成的影响，而后者与纤维物质的来源密切相关。盛清凯等[9]研究表明，外源L-Try是猪粪体外发酵液中色氨酸和粪臭素的主要影响因素。本课题组前期研究表明，饲粮添加SBO显著降低了42日龄肉仔鸡排泄物吲哚和粪臭素的浓度[10]，显著降低了在肉仔鸡盲肠和直肠菌群作用下L-Try代谢生成粪臭素的浓度[11]，但何种单一聚合度(单体组分)的SBO在其中起主要作用还不完全清楚，其作用机制也有待于进一步阐明。
1 材料与方法 1.1 试验材料及样品采集试验用的SBO、SUC、RAF、STA均为市售商品低聚糖，由河南某生物科技有限公司生产。采用蒽酮比色法[12]，实测SBO、SUC、RAF、STA的总糖含量分别为76.10%、64.53%、68.21%和88.07%。爱拔益加(AA)肉仔鸡饲养至42日龄时，选取30只健康鸡只(饲喂玉米-豆粕型无抗生素饲粮，公母各占1/2)，平均体重为2.75 kg；宰杀，剖开腹腔，分离盲肠，用细线结扎，剪下，装入事先准备好的自封袋中，称重(每只鸡6~7 g盲肠内容物)，迅速置-80 ℃冰箱备用。
1.2 试验设计采用单因素完全随机试验设计，分别设SUC、STA、RAF、SBO和对照组，每组3个重复。对照组添加250 μmol/L的L-Try，SUC、STA、RAF和SBO组分别在对照组的基础上添加3.10 g SUC、2.27 g STA、2.93 g RAF、2.63 g SBO(以总糖含量计为1%)，体外培养液体积为200 mL。另外，考虑到不同底物原料蛋白质含量的差异，每组均设1个不加L-Try但其他成分都相同的空白对照，其结果用于对吲哚和粪臭素浓度的校正。
1.3 体外培养液的配制及发酵参照Yokoyama等[13]的方法，配制基础培养液。调整pH至5.7±0.3(鸡的盲肠内容物pH为5.7)；然后，在1个标准大气压、121 ℃条件下灭菌15 min[14]；将盲肠内容物从-80 ℃冰箱取出，置超净工作台解冻，按照公、母肉鸡盲肠内容物样品1:1混合后，称取30 g悬浮于3 L无菌厌氧培养液中。充分搅拌后用4层纱布过滤以除去粗微粒物质，并将滤液分装到ANKOM RFS无菌培养瓶中，每瓶198 mL，操作全程开通CO2以保证菌群的活性。在各组培养液中添加2 mL 5.1 mg/mL的L-Try(L-Try添加终浓度为250 μmol/L)，试验组再分别添加1%的SUC、STA、RAF和SBO，空白对照添加2 mL的无菌蒸馏水，充分振荡混匀。将培养瓶中通满CO2，盖上产气系统的密封盖并拧紧，放入39 ℃恒温培养箱中，厌氧培养24 h。用带盖离心管留取部分发酵液分别至-20和-80 ℃冻存备用。
1.4 发酵液产气量、粪臭素浓度和发酵参数测定 1.4.1 产气量ANKOM RFS体外产气系统能自动检测产气瓶中产生的气体，并且记录气压信息。根据公式，将气压信息换算成产生气体的体积(mL)。
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式中：Vxt为t(h)时刻产生气体的体积(mL)；Vj为模块瓶内液面上部空间的体积(mL)；Ppsit为t(h)时刻样本模块瓶GPM软件记录的累积压力(psi, 1 psi=6.895 kPa)；Ppsi0为t(h)时刻空白模块瓶GPM软件记录的累积压力(psi)。
1.4.2 pH厌氧培养结束后，用校正的pHS-3C型pH计测定发酵液的pH。
1.4.3 吲哚和粪臭素浓度参照文献[11]的方法，用Agilen-1100型高效液相色谱仪测定发酵液的吲哚和粪臭素浓度。
1.4.4 乙酸、丙酸、丁酸和乳酸浓度参照文献[15]的方法，用Agilent-7890B气相色谱仪测定发酵液的乙酸、丙酸、丁酸和乳酸浓度。
1.5 发酵液菌群结构测定 1.5.1 基因组DNA的提取使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)环境微生物DNA提取试剂盒，提取发酵液中总细菌基因组DNA，并用DNA纯化试剂盒进行纯化，置-20 ℃保存备用。
1.5.2 细菌16S rDNA片段的PCR扩增细菌通用引物同文献[10]。PCR扩增体系(50 μL)：rTaq酶(5 U/μL)0.4 μL、10×PCR buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL、GC-338F(20 μmol/L)1 μL、518R(20 μmol/L)1 μL、模板DNA 50 ng，补ddH2O至50 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最终72 ℃延伸10 min。
1.5.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析采用Bio-Rad Dcode系统进行DGGE分析。采用变性梯度为35%~55%、浓度为7%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE、150 V、60 ℃下电泳5 h。采用硝酸银染色并用凝胶成像系统拍照记录。采用Poly-Gel DNA提取试剂盒(OMEGA)回收目的条带，并进行克隆测序。测定序列在GenBank数据库中进行比对分析，寻找亲缘关系最近的细菌或克隆。
1.5.4 PCR-DGGE图谱分析采用Quantity one软件对图谱条带数目、密度进行数字化分析，其计算公式如下所示：
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式中：H、S和E分别代表多样性指数[香农-威纳指数(Shannon-wiener index)]、丰富度和均匀度；pi为样品中单一条带的光密度值在该样品所有条带光密度总值中所占的比率；N为DGGE图谱单一泳道上条带的丰度；Ni为第i泳道条带的丰度；S是全部样品中所有条带数目总和；Hmax为H的最大值。
不同样品间菌群差异的两两比较，依据戴斯相似系数(Dice coefficient，Cs)，用MEGA 4.1软件进行聚类分析。Cs的计算公式为：
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式中:Nx为x泳道样本的条带数; Ny为y泳道样本的条带数; j为2个泳道共有的条带数。
1.6 数据统计与分析数据采用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较。粪臭素浓度、发酵参数、菌群结构之间采用双变量相关分析。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。
2 结果与分析 2.1 发酵液累积产气量由表 1可知，发酵至3 h，各组发酵液累积产气量差异显著(P < 0.05)，之后各阶段各组累积产气量差异极显著(P < 0.01)；发酵至6、9 h时，RAF组累积产气量极显著低于对照组(P < 0.01)；发酵至21 h之前，RAF组累积产气量均低于对照组，但差异不显著(P>0.05)；发酵至24 h时，SUC、STA、SBO组累积产气量极显著高于对照组和RAF组(P < 0.01)，对照组累积产气量最低。各阶段SUC、STA、SBO组之间累积产气量差异不显著(P>0.05)。由图 1可直观看出各阶段各组累积产气量的变化情况。
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表 1 大豆低聚糖及其功能组分在肉仔鸡盲肠菌群作用下对发酵液累积产气量的影响 Table 1 Effects of soybean oligosaccharide and its functional components on cumulative gas production in fermentation broth by cecal microbiota of broilers |
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图 1 大豆低聚糖及其功能组分在肉仔鸡盲肠菌群作用下对发酵液累积产气量的影响 Figure 1 Effects of soybean oligosaccharide and its functional components on cumulative gas production in fermentation broth by cecal microbiota of broilers |
由表 2可知，SBO、SUC和STA组发酵液中的吲哚浓度分别比对照组降低了98.15%、97.72%和94.17%(P < 0.01)，但SUC、STA和SBO组的吲哚浓度差异不显著(P>0.05)，RAF组的吲哚浓度与对照组相比差异不显著(P>0.05)。各组发酵液中的粪臭素浓度显著低于对照组(P < 0.05)，其中，SBO、SUC、STA和RAF组的粪臭素浓度分别比对照组降低了79.04%、71.88%、70.28%和62.42%(P < 0.05)，但SBO、SUC、STA和RAF组的粪臭素浓度差异不显著(P>0.05)。各组发酵液中的乙酸浓度差异不显著(P>0.05)。SUC组发酵液中的乳酸浓度极显著高于其他各组(P < 0.01)，RAF、SBO组的乳酸浓度与对照组相比差异不显著(P>0.05)。对照组发酵液的pH极显著高于除RAF组之外的其他各组(P < 0.01)。
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表 2 大豆低聚糖及其功能组分在肉仔鸡盲肠菌群作用下对发酵液吲哚、粪臭素浓度及发酵参数的影响 Table 2 Effects of soybean oligosaccharide and its functional components on indole, skatole concentrations and fermentation parameters in fermentation broth by cecal microbiota of broilers |
由图 2可知，12、20、25、26号条带在各组中均存在。有部分条带只在某个组中存在，有部分条带只在某个组中未出现。由表 3可知，各组发酵液中菌群多样性指数差异不显著(P>0.05)；SBO组发酵液中菌群均匀度显著低于对照组(P < 0.05)；SUC、STA、RAF、SBO组发酵液中菌群丰富度均显著高于对照组(P < 0.05)。
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1-1，1-2，1-3为蔗糖组样品；2-1，2-2，2-3为水苏糖组样品；3-1，3-2，3-3为棉子糖组样品；4-1，4-2，4-3为大豆低聚糖组样品；5-1，5-2，5-3为对照组样品。图 3同。 1-1, 1-2 and 1-3 were samples in SUC group; 2-1, 2-2 and 2-3 were samples in STA group; 3-1, 3-2 and 3-3 were samples in RAF group; 4-1, 4-2 and 4-3 were samples in SBO group; 5-1, 5-2 and 5-3 were samples in control group. The same as Fig. 3. 图 2 发酵液菌群PCR-DGGE指纹图谱 Figure 2 PCR-DGGE fingerprints of microbiota in fermentation broth |
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表 3 大豆低聚糖及其功能组分对体外条件下肉仔鸡盲肠菌群多样性的影响 Table 3 Effects of soybean oligosaccharide and its functional components on the cecal microbiota diversity of broilers in vitro |
由图 3可知，图谱条带被明显分成两簇，两簇之间相似性系数为0.49。上方簇为2个对照组样品和1个RAF组样品，相似性系数为0.68，而2个对照组样品之间的相似性系数为0.76。下方簇中，与其他样品相似性系数最低的为SUC组样品1-2，仅为0.51；而对照组样品5-3与其他样品的相似性系数为0.64，明显低于其他3组；相似性高的有4簇，分别为SBO组样品4-1和样品4-3、STA组样品2-2和样品2-3、RAF组样品3-1和样品3-3、SUC组样品1-1和SBO组样品4-2，相似性系数依次为0.89、0.88、0.84、0.84，这些样品为添加了SBO、STA、RAF的组，相似性系数均高于对照组。
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图 3 15个发酵液样品的未加权配对组法聚类分析 Figure 3 Unweighted pair group method clustering analysis of 15 fermentation broth samples |
本试验对PCR-DGGE指纹图谱中11条具有共性、特异性的条带进行了回收、克隆和测序。由表 4可知，在11个测序结果中，与GenBank数据库中细菌的相似度都在99%~100%。其中12、20、25、26号条带为15个发酵液样品的共有条带，其相似菌分别为鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、菊花迪克氏菌(Dickeya chrysanthemi)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)。4号条带仅在RAF组样品3-1中出现，其相似菌为延长布劳特氏菌(Blautia producta)。9号条带在SUC组样品1-1、1-2，STA组样品2-1、2-3，RAF组所有样品和SBO组样品4-1、4-2中出现，其相似菌为迪氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)。28号条带在SUC、STA、RAF和SBO组中出现，相似菌为路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。可见，4、9、28号条带仅在试验组中出现。
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表 4 PCR-DGGE凝胶条带回收序列分析结果 Table 4 Analysis results of PCR-DGGE gel bands recovery sequence |
由表 5可知，发酵液乙酸浓度与菌群多样性指数、丰富度均呈正相关，其中乙酸浓度与菌群多样性指数呈极显著正相关(r=0.964，P < 0.01)，乙酸浓度与菌群丰富度呈显著正相关(r=0.954，P < 0.05)；pH与菌群均匀度呈显著正相关(r=0.909，P < 0.05)。
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表 5 发酵液粪臭素浓度、发酵参数与肉仔鸡盲肠菌群多样性间的相关关系 Table 5 Correlation of skatole concentration, fermentation parameters and diversity of cecal microbiota in fermentation broth of broilers |
发酵底物和微生物种类对发酵过程中产气量、产气速率及代谢产物都有一定的影响[16]。Lan等[17]以81日龄肉仔鸡盲肠菌群为接种物，体外发酵试验结果表明，与SBO和RAF相比，STA具有较大的产气量和产气速率。本试验结果表明，SUC、STA、SBO组发酵液24 h累积产气量极显著高于对照组，但3组间差异不显著。说明肉仔鸡盲肠微生物能够很好地利用SBO及其功能组分(RAF除外)进行发酵，SUC、STA、SBO均为肉仔鸡盲肠微生物很好的碳源。易中华等[18]以42日龄肉仔鸡盲肠内容物为菌源，体外发酵RAF、STA、果寡糖和甘露寡糖，结果表明它们的可发酵性依次降低，且RAF发酵产气量最大、产气速率最快。本试验结果表明，RAF产气量最小，这可能与本试验中添加了L-Try有关，由于蛋白质源的存在影响了碳水化合物的发酵。本试验中，在发酵21 h之前，RAF组的累积产气量低于对照组，至发酵24 h累积产气量才超过对照组，说明RAF的发酵速度较慢，造成前期微生物依赖L-Try为发酵底物，使L-Try降解增加，进一步使吲哚和粪臭素产生量增加，尤其RAF组吲哚的产量比SUC、STA和SBO组分别高出220.51、212.39和221.50 ng/mL。
Li等[8]报道，添加甜菜粕和果寡糖显著降低了猪直肠菌群作用下L-Try培养液中粪臭素的浓度和相对产率。本试验表明，添加SBO及其功能组分显著降低了发酵液粪臭素浓度，其降低效果由高到低依次为SBO、SUC、STA、RAF，添加RAF对发酵液吲哚浓度无显著影响。说明无论是SBO，还是其功能组分都具有较好的降低发酵液粪臭素产量的效果，但RAF效果最差。主要是由于RAF发酵速度慢，导致微生物首先利用L-Try，进而导致其分解产物的增加。研究表明，肠道微生物的生长代谢活动需要碳水化合物和蛋白质参与，在肉仔鸡肠道远端，细菌糖化发酵优先，只有当碳水化合物用尽时，腐败作用才会出现[19]。SBO及其功能组分降低粪臭素浓度的效果，主要是源于其作为微生物的能源物质优先发酵，进而减少了细菌对L-Try的发酵，因此减少了粪臭素的产生量。
非可消化碳水化合物(NDC)在结肠中通过微生物的发酵，最终产生乙酸、丙酸和丁酸[20]。因此，单胃动物肠道中乙酸、丙酸和丁酸的含量和比例可间接反映肠道微生物菌群状况[21]。Lan等[22]以81日龄肉鸡盲肠内容物为菌源，体外发酵SBO、大豆水溶性多糖等4种NDC以及STA和RAF，结果表明SBO组发酵液具有最高的丁酸产量和最低的pH、氨氮浓度(199.3 mg/L)。本试验中SBO及其功能组分对发酵液乙酸浓度无显著影响，但对照组乙酸浓度最低(10.27 mmol/L)。Macfarlane等[23]报道，细菌发酵时所使用的底物会影响到短链脂肪酸(SCFA)的产量，一般以蛋白质为发酵底物所产生的SCFA量会比以碳水化合物为基质的少。本试验中，添加SBO极显著降低了发酵液乳酸浓度和pH，对照组的pH最高，对照组和RAF组pH差异不显著。由于低pH环境有利于乳酸菌的增长，减少了腐败菌的滋生，进而达到减少粪臭素产生的效果。
本试验采用气相色谱法，未检测到发酵液中的丙酸和丁酸，易中华等[18]以肉仔鸡盲肠内容物为菌源，体外发酵STA和RAF，测得24 h发酵液乙酸、丙酸和丁酸的摩尔比例分别为5.6:2.5:1.9和5.6:2.3:2.1。说明肉仔鸡肠道微生物发酵碳水化合物主要产生乙酸和乳酸，而产生的丙酸和丁酸极少。
3.2 大豆低聚糖及其功能组分对体外条件下肉仔鸡盲肠菌群组成的影响近年来，PCR-DGGE、qPCR、宏蛋白质组学等技术被广泛应用于动物肠道菌群生态学研究，已成为研究肉仔鸡肠道微生物的主要技术手段，并用于解释与恶臭化合物生成有关的新菌落[10-11]。本试验中，添加SBO及其功能组分后，对发酵液菌群多样性指数无显著影响，与侯瑞[11]报道的结果一致。但本试验中，添加SBO及其功能组分后显著提高了发酵液菌群的丰富度，SBO组显著降低了发酵液菌群的均匀度。在体外培养体系中，菌群PCR-DGGE指纹图谱的差异，以及STA、RAF、SBO组与对照组相似性的差异，可能解释了SBO及其功能组分降低粪臭素产生的原因。另外，试验组有3条特异性条带，相似菌分别为延长布劳特氏菌、迪氏副拟杆菌、路氏乳杆菌，说明添加SBO及其功能组分能够通过促进以上细菌的增殖降低吲哚、粪臭素的产生。
3.3 发酵液粪臭素浓度、发酵参数与盲肠菌群组成的相关关系分析已往的研究大多注重SBO(或其部分组分)对人或动物肠道微生物菌群的影响，少量文献涉及对粪臭素产量、pH和有机酸等的影响，有关它们之间相关关系的研究仅见零星报道[24-25]。通过研究粪臭素、吲哚等浓度与肠道菌群间的相关关系，将有助于揭示SBO及其功能组分降低肉仔鸡粪臭素、吲哚等产生的微生物学机制，对探究降低粪臭素污染的营养调控措施具有重要科学意义。胡彩虹等[26]以猪粪为菌源体外发酵L-Try，结果表明，pH较高的环境有利于粪臭素的产生，而pH较低的环境有利于吲哚的产生。说明环境酸度与吲哚和粪臭素的产生量存在一定关系。王琪等[25]报道，42日龄肉仔鸡排泄物pH与盲肠乳酸浓度呈显著负相关关系(r=-0.927)。本研究表明，添加SBO及其功能组分极显著影响肉仔鸡体外发酵液的乳酸浓度和pH，其中SBO组pH最低，而对照组的pH最高。结合吲哚浓度、粪臭素浓度数据分析，与以上报道基本一致。另外产气量越高，菌群的发酵特性越好，越不利于L-Try降解产生吲哚。张沛[5]研究表明，肉仔鸡肠道菌群多样性指数、丰富度和总菌数量与粪臭素产量呈极显著正相关，r分别为0.748、0.783和0.700。本研究表明，发酵液的乙酸浓度与菌群多样性指数呈极显著正相关，乙酸浓度与菌群丰富度呈显著正相关，pH与菌群均匀度呈显著正相关，而吲哚和粪臭素浓度与菌群结构无显著相关性。因此，本试验中也可能是由于SBO及其功能组分通过增加或降低某些菌群的数量来降低粪臭素的产生，待后续试验报道。另外，此结果是否与肉仔鸡肠道内菌群的变化一致，还需动物试验进一步验证。
4 结论① 添加1%的SBO、SUC和STA极显著降低了肉仔鸡体外盲肠发酵液吲哚浓度，降低幅度分别为98.15%、97.72%和94.17%；添加1%的SBO、SUC、STA和RAF显著降低了发酵液粪臭素浓度，降低幅度分别为79.04%、71.88%、70.28%和62.42%。
② 添加1%的SBO显著降低了发酵液菌群均匀度，添加1%的SBO及其功能组分显著提高了发酵液菌群丰富度。SBO及其功能组分促进了延长布劳特氏菌、迪氏副拟杆菌、路氏乳杆菌细菌的增殖。
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