乳蛋白和乳脂是牛奶质量的关键指标。乙酸和β-羟丁酸来源于瘤胃发酵，它们是奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, BMECs)脂肪酸从头合成的主要前体物，约50%的C16脂肪酸和长链脂肪酸(long chain fatty acids, LCFA)来源于饲料和体脂分解[1]。孔庆洋[2]在BMECs中添加乙酸和β-羟丁酸，结果表明提高了乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FASN)基因的表达量及甘油三酯(triglyceride，TAG)的合成量，同时也提高了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2) 基因的表达量。梁梦瑶等[3]研究结果表明，低浓度的油酸促进BMECs ACC和FASN基因的表达，进而促进乳脂的合成。李红磊[4]研究表明，当油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度比例为2.0(22.20 μmol/L):13.3(147.70 μmol/L): 1.0(11.10 μmol/L)时，上调了BMECs αS1-酪蛋白(CSN1S1)、κ-酪蛋白(CSN3) 和mTOR基因的表达量。由此可见，在泌乳过程中，脂肪酸起到重要的调控作用，对乳蛋白和乳脂的合成具有重要影响。Mach等[5]研究表明，饲粮中添加油菜籽、大豆、亚麻籽后，乳脂和乳蛋白的含量下降，产奶量增加。因此，可以假设乳脂合成前体物(MFP)中不饱和脂肪酸的比例可以调乳成分合成。综观国内外文献报道，在牛奶的分泌机制和营养调控乳成分含量方面取得了一些进展，但是营养素调控乳蛋白、乳脂合成分子生物学机制和信号转导途径仍然不清楚。单一脂肪酸的添加对BMECs乳蛋白和乳脂合成影响的研究最多，而短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)和LCFA的混合添加对BMECs乳成分合成影响的研究较少。因此，本试验混合添加不同比例的乙酸、β-羟丁酸、油酸、亚油酸、亚麻酸，研究其对BMECs乳蛋白和乳脂合成相关基因表达量的影响，旨在探寻促进乳蛋白和乳脂合成的脂肪酸组合添加模式，为调控乳成分合成提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 BMECs的分离与纯化选取体况良好、处于泌乳高峰期的中国荷斯坦奶牛进行乳腺组织取样，剪取含有大量腺泡的乳腺组织约55 g放于含有双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)中，通过Ⅱ型胶原酶消化获得原代BMECs。放于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养原代细胞，大约1周细胞长满培养瓶底部的80%左右时，利用胰酶对成纤维上皮细胞和乳腺上皮细胞的消化时间不同来纯化BMECs并传代。以第2代的BMECs为试验对象。
1.2 试验培养基试验培养基为添加氢化可的松、谷氨酰胺、胰岛素-转铁蛋白硒钠、催乳素的DMEM/F12的培养基，试剂均购自GIBCO公司。
1.3 试验设计本试验采用单因素完全随机试验设计。脂肪酸添加浓度比例参考李红磊[4]和塔娜等[6]的研究结果设置，当乙酸:β-羟丁酸的浓度比例为2.0:1.0、油酸:亚油酸:亚麻酸的浓度比例为2.0:13.3: 1.0时，对乳脂合成相关基因的表达有较好的促进作用；当乙酸:β-羟丁酸的浓度比例为1.0:1.0、油酸:亚油酸:亚麻酸的浓度比例为9.6:7.4: 1.0时，对乳蛋白合成相关基因的表达有较好的促进作用。因此，依据SCFA(乙酸、β-羟丁酸，总添加量为14.4 mmol/L)和LCFA(油酸、亚油酸、亚麻酸，总添加量为141 μmol/L)的总添加量相同，各脂肪酸间的比例不同的原则，交叉设计了5组，试验设计见表 1。
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表 1 试验设计 Table 1 Experimental design |
采用四甲基偶氮唑盐(thiazoly blue tetrazolium bramide, MTT)比色法检测BMECs的细胞活力。每孔接种细胞悬浮液的密度为1×104个，将96孔板置于培养箱中培养，待细胞生长至培养瓶底部的80%左右时，添加不同浓度比例的乙酸、β-羟丁酸、油酸、亚油酸、亚麻酸的诱导培养基，放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，每组均设3个重复；培养结束前4 h，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL；4 h后弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL，振荡10 min后，用全自动酶标仪检测490 nm下吸光度值(OD490 nm)。
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接种第2代BMECs悬浮液于75 cm2培养瓶中，每瓶吸取10 mL细胞悬浮液，每瓶细胞约为8×105个，放置在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至培养瓶底部的80%左右时，添加不同乙酸、β-羟丁酸、油酸、亚油酸、亚麻酸浓度比例的诱导培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h，每组均设3个重复，用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)将细胞消化后离心8 min，弃上清，用PBS清洗1次，采用TAG试剂盒检测BMECs内TAG的合成量。
1.4.3 乳蛋白和乳脂合成相关基因表达量将第2代的BMECs置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，待细胞长满约70%时，添加不同浓度比例的乙酸、β-羟丁酸、油酸、亚油酸、亚麻酸的诱导培养基，每组设3个重复，培养24 h后，收集细胞，提取RNA(试剂盒为RNA isoplus，TaKaRa公司)，反转录(试剂盒为prime scriptTM RT reagent kit，TaKaRa公司)，应用RT-qPCR法(试剂盒购自TaKaRa公司)，检测乳蛋白合成的相关基因(CSN1S1、CSN3)、信号通路相关基因[mTOR、转录激活因子5(STAT5)、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、蛋白激酶B(AKT)]、乳脂合成的相关基因(ACC、FASN、DGAT2)、乳脂合成相关转录调控因子[过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节原件结合蛋白1(SREBP1)]的表达量。试验重复3次。本试验内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。引物序列及参数见表 2。各基因表达量用2-△△Ct值表示[6]。
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表 2 引物序列及参数 Table 2 Primer sequences and parameters |
采用Excel 2007进行计算和整理试验数据，实时定量PCR试验结果采用2-△△Ct法进行相对定量数据分析。利用SAS 9.0软件的ANOVA程序对数据进行方差分析，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 不同浓度比例脂肪酸对BMECs RAG和TAG合成量的影响由表 3可知，试验组BMECs的RGR和TAG合成量都显著高于对照组(P < 0.05)。Ⅰ组RGR和TAG合成量显著高于其他试验组(P < 0.05)，Ⅱ组和Ⅳ组显著低于Ⅲ组(P < 0.05)，Ⅱ组和Ⅳ组之间无显著差异(P>0.05)。
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表 3 不同浓度比例脂肪酸对BMECs RAG和TAG合成量的影响 Table 3 Effects of different concentrations of fatty acids on RAG and TAG synthesis amount in BMECs |
由表 4可知，与对照组相比，Ⅰ组显著降低了BMECs CSN1S1、CSN3和STAT5基因的表达量(P < 0.05)，而mTOR和4EBP1基因表达量显著提高(P < 0.05)；Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组显著上调了CSN3和S6K1基因的表达量(P < 0.05)，而STAT5基因表达量显著降低(P < 0.05)；Ⅲ组和Ⅳ组AKT和4EBP1基因的表达量显著提高(P < 0.05)；Ⅳ组CSN1S1基因表达量显著高于Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组(P < 0.05)；Ⅱ组mTOR和4EBP1基因的表达量显著降低(P < 0.05)。
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表 4 不同浓度比例的脂肪酸对BMECs乳蛋白合成相关基因表达量的影响 Table 4 Effects of different concentrations of fatty acids on expression levels of genes involved in milk protein synthesis in BMECs |
由表 5可知，与对照组相比，Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组ACC和试验组DGAT2基因的表达量显著高于对照组(P < 0.05)，Ⅲ组和Ⅳ组ACC基因的表达量显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P < 0.05)，Ⅱ组显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，Ⅱ组和Ⅳ组DGAT2基因的表达量显著高于Ⅰ组和Ⅲ组(P < 0.05)，Ⅲ组显著高于Ⅰ组(P < 0.05)；试验组FASN和SREBP1基因的表达量显著下降(P < 0.05)；Ⅰ组PPARγ基因的表达量显著上升(P < 0.05)，而其他试验组则显著降低(P < 0.05)。
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表 5 不同浓度比例的脂肪酸对BMECs乳脂合成相关基因表达量的影响 Table 5 Effects of different concentrations of fatty acids on expression levels of genes involved in milk fat synthesis in BMECs |
脂肪酸是乳腺组织中的一种重要的营养素，对BMECs的生长增殖具有一定的作用。齐利枝等[7]研究表明, 低浓度的乙酸对BMECs的增殖有较好的促进作用，而高浓度则抑制BMECs的增殖。孙晓菊[8]研究表明，当油酸的浓度为50~400 μmo/L、亚油酸的浓度为25~100 μmol/L时，对BMECs的增殖有促进作用，但是当油酸和亚油酸的浓度分别达到800和200 μmol/L时，BMECs的增殖受到抑制；低浓度的亚油酸促进BMECs的增殖，而高浓度则表现出抑制作用。Yonezawa等[9]研究表明，当油酸和亚油酸的浓度均为100 μmol/L时，促进BMECs的增殖。有研究表明，当油酸浓度高于0.20 mmol/L时，细胞增殖受到了抑制[10-11]。AKT有助于细胞的存活和增殖[12]。本试验中，AKT基因的表达量与RGR的变化一致, 相关作用机理有待进一步研究。
3.2 不同浓度比例的脂肪酸对BMECs乳蛋白合成相关基因表达量的影响Janus激酶2(JAK2)/STAT5信号通路的主要调控机制是结合在受体上的STAT5被JAK磷酸化修饰，靶基因与以二聚体的形式进入细胞核的活化STAT5结合，从而调控基因的转录水平[13]。Bionaz等[14]的研究发现，泌乳阶段STAT5和Janus激酶(JAK)的基因表达量没有显著变化，表明JAK/STAT5对乳蛋白合成的调节作用较小。本试验中，试验组STAT5基因表达量均显著低于对照组，Ⅲ组和Ⅳ组4EBP1和S6K1基因表达量显著高于对照组，而且STAT5基因表达量的变化规律与CSN1S1和CSN3的基因表达量并不一致，这提示乳蛋白基因表达量的变化是mTOR信号通路和JAK2/STAT5信号通路综合作用的结果。CSN1S1、CSN3是2个主要的酪蛋白基因，其对BMECs乳蛋白的合成有很强的相关性[15]。Yonezawa等[16]研究发现，当油酸和亚油酸的浓度为400 μmol/L时，对CSN1S1的基因表达量有促进作用。Pauloin等[17]研究表明，在鼠的乳腺上皮细胞中添加不饱和脂肪酸降低CSN3基因的表达量。本试验研究得出，对于CSN1S1基因的表达量，Ⅳ组高于对照组，但差异不显著，Ⅱ组CSN3基因的表达量最高，表明油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度比例为9.6: 7.4: 1.0时，对CSN1S1、CSN3基因的表达有显著的促进作用。mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[18-19]，除了内分泌信号外，mTOR信号途径还能调节乳蛋白合成、细胞能量水平和乳腺氨基酸的利用[20]。此信号通路上游受到AKT磷酸化的正调节，下游可促进S6K1和4EBP1的磷酸化调节翻译起始，下游的这2条通路是2条平行的信号通路，各自控制特定亚基的mRNA翻译过程[21]；同时SREBP1作用的靶基因ACC和FASN的表达受到mTOR信号通路的抑制，表明mTOR参与了脂肪酸的从头合成[22]。本试验研究得出，Ⅰ组和Ⅲ组的mTOR和4EBP1基因表达量均显著高于对照组，说明油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度比例为2.0: 13.3: 1.0时，上调了mTOR、4EBP1和S6K1基因的表达量，乙酸、β-羟丁酸浓度比例为2.0: 1.0时，对S6K1基因的表达有抑制作用。混合脂肪酸调控BMECs乳蛋白和乳脂合成的机理有待进一步研究。
3.3 不同浓度比例的脂肪酸对BMECs乳脂合成相关基因表达量及TAG合成量的影响AKT与mTOR信号通路不仅调控乳蛋白合成相关基因的表达，同时促进固醇调节原件结合蛋白(SREBP)信号转导，并进一步调控其靶基因ACC、FASN的表达从而影响乳脂的合成，ACC和FASN是乳脂从头合成中2个重要的基因[23]。Ma等[24]研究表明，BMECs中添加100 nmol/L，SREBP1的siRNA、ACC和FASN的mRNA水平下降。本试验结果得出，试验组AKT和ACC基因的表达量均高于对照组，而FASN和SREBP1基因的表达量下降，这表明加入混合脂肪酸后，AKT信号通路负反馈调节SREBP1，SREBP1正反馈调节FASN, 可能会负反馈调节ACC。大量的研究表明，SREBP1和PPARγ是调节乳脂合成相关基因重要的核受体和转录调控因子，而且PPARγ可能参与调控SREBP1基因的表达。在脂肪合成细胞调控因子通路中PPARγ处于枢纽位置，可以通过影响脂肪酸的摄取、转运、从头合成和酯化过程从而调控基因的表达[25]。本试验得出，Ⅰ组PPARγ基因表达量显著高于对照组，其他组显著低于对照组，从而证明PPARγ可能参与了SREBP1的调控，同时受到AKT和mTOR的调控。在内质网中DGAT2是一种完整的细胞微粒体酶，在催化TAG合成的过程中发挥着重要作用，在TAG合成过程中，它是唯一的限速酶[26]。本试验得出，Ⅱ组和Ⅳ组DGAT2基因的表达量都高于对照组，且其TAG合成量也显著高于对照组，这表明DGAT2对TAG的合成具有调控作用。乳脂大部分由TAG组成，来源于BMECs的乳糜微粒，TAG的合成量可以直接反映BMECs乳脂的合成状况。脂肪酸通过上述信号通路的调节合成TAG。崔瑞莲[27]研究指出，BMECs的活力不受抑制的条件下(脂肪酸添加浓度为0~10 μmol/L)，TAG的合成与各十八碳脂肪酸添加浓度呈正相关。塔娜等[6]研究表明，适宜的乙酸和β-羟丁酸的浓度比例(2.0: 1.0和4.0: 1.0) 对BMECs中TAG的合成和乳脂合成相关基因的表达有较好的促进作用。Sheng等[28]研究指出，油酸、亚油酸和亚麻酸的添加浓度比例为2.0: 13.3:1.0时对BMECs的TAG合成有较好的促进作用。本试验结果表明，试验组TAG合成量显著高于对照组，表明添加适宜浓度比例的混合脂肪酸对BMECs内TAG的合成有促进作用。
4 结论乙酸、β-羟丁酸、油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度分别为7.20 mmol/L、7.20 mmol/L、75.20 μmol/L、58.00 μmol/L、7.80 μmol/L时，提高了CSN1S1、CSN3、AKT、4EBP1、S6K1、DGAT2基因的表达量，对BMECs乳蛋白和乳脂的合成有较好的促进作用。
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