肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis, SE)不仅能引起家禽患病，还能感染人类，引起食物中毒甚至死亡，是主要的食源性病原菌。鸡蛋是人感染沙门氏菌重要的媒介之一。2010年5月美国因食用沙门氏菌感染的鸡蛋制品爆发沙门氏菌感染疫情，召回5亿枚疑似沙门氏菌感染的鸡蛋。鸡蛋沙门氏菌感染的有效控制关系公众食品健康。
近年来的研究表明，乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌等益生菌可减少宿主沙门氏菌携带数量。Mountzouris等[1]与Chen等[2]研究了益生菌关于竞争性排除沙门氏菌的能力以及相关益生菌的特征。Higgins等[3]用乳酸杆菌饲喂沙门氏菌攻毒后的蛋鸡，显著降低了沙门氏菌阳性率。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)为革兰氏阳性菌，是一种高效的益生菌，能提高动物的免疫能力，调节肠道微生物平衡，具有通便、止泻、抗氧化等作用。凝结芽孢杆菌作为饲料添加剂已有较多研究，但其在蛋鸡上的研究鲜见报道。因此，本试验通过研究凝结芽孢杆菌对感染肠炎沙门氏菌蛋鸡生产性能、蛋品质和血浆生化指标的影响，旨在为其在蛋鸡生产中应用提供更多的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料肠炎沙门氏菌菌株，编号CVCC3377，购自国家兽医微生物菌种保藏中心。凝结芽孢杆菌ANCB161，课题组从鸡粪中分离得到，活菌数5.0×1010 CFU/g。
1.2 试验设计选择45周龄健康的京红商品蛋鸡，通过全血平板凝集试验和肛拭子法筛选沙门氏菌阴性蛋鸡400只，采用2×2双因子(凝结芽孢杆菌添加与否、肠炎沙门氏菌攻毒与否)试验设计，根据产蛋率无显著差异(P>0.05)原则随机分成4组(A、B、C、D组)，每组5个重复，每个重复20只蛋鸡，每2组分到2个环境条件相同、独立的生物安全隔离鸡舍。试验第1周，对照组(A组和C组)饲喂基础饲粮，凝结芽孢杆菌组(B组和D组)在基础饲粮中添加2.5×1010 CFU/kg凝结芽孢杆菌，研究凝结芽孢杆菌对感染沙门氏菌前蛋鸡生产性能和蛋品质的影响；饲喂1周后，C组和D组试验鸡连续2 d口服肠炎沙门氏菌悬浮液(1×108 CFU/mL)，A组和B组试验鸡口服等量无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，继续饲养3周，研究凝结芽孢杆菌对感染沙门氏菌后蛋鸡生产性能、蛋品质和血浆生化指标的影响。
1.3 饲养管理试验地点为中国农业大学涿州试验基地，采用封闭式鸡舍阶梯式笼养，每笼1只鸡，光照时间16 h，光照强度16 lx，鸡舍温度18~27 ℃，相对湿度50%~70%，纵向负压通风。干粉料自由采食，乳头式饮水器自由饮水。预试期2周，正试期4周。饲粮营养水平参考我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)和京红商品蛋鸡饲养手册确定，基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
以重复为单位，统计产蛋数、平均蛋重，计算产蛋率、日产蛋量，每周以重复为单位结料和称重，计算平均日采食量和料蛋比。
1.4.2 蛋品质每周末收集每个重复3枚鸡蛋。采用SONOVA蛋品质自动分析仪(Egg AnalyzerTM, Orka)测定鸡蛋蛋重、蛋白高度、哈夫单位和蛋黄颜色，采用蛋壳强度分析仪(Egg Force Reader, Orka)测定蛋壳强度，采用蛋壳厚度测定仪(Egg Shell Thickness Gauge, Orka)测定蛋壳厚度。称重分离蛋清后的蛋黄，蛋壳清洗、晾干，称重。
1.4.3 血浆生化指标饲养试验结束时，每个重复随机选择1只体重接近平均体重的蛋鸡，供水禁饲12 h后，肝素钠抗凝管翅静脉采血，3 500 r/min离心15 min制备血浆，分装后-80 ℃保存，用于血浆生化指标的测定。总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、钙(Ca)、磷(P)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)活性均采用日立全自动生化分析仪测定，检测试剂盒购于四川迈克生物科技股份有限公司。
1.5 数据处理分析试验数据采用Excel 2007软件整理，试验结果以用平均值(mean)和集合标准误(SEM)表示，采用SPSS 18.0软件分析，蛋鸡感染沙门氏菌前生产性能与蛋品质采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，蛋鸡感染沙门氏菌后，采用一般线性模型(general linear model, GLM)多变量模块分析，两两比较检验采用Duncun氏法多重比较检验，以P < 0.05和P < 0.01分别作为差异显著和差异极显著判断标准，0.05≤P < 0.10表示具有显著趋势。
2 结果 2.1 凝结芽孢杆菌对沙门氏菌感染前后蛋鸡生产性能的影响由表 2可知，感染沙门氏菌前，与对照组相比，凝结芽孢杆菌组蛋鸡生产性能均无显著差异(P>0.05)，但有增加只产蛋量和降低料蛋比的趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 2 凝结芽孢杆菌对感染沙门氏菌前蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of Bacillus coagulans on performance of laying hens before Salmonella infection |
由表 3可知，感染沙门氏菌后，凝结芽孢杆菌与沙门氏菌对生产性能无显著交互作用(P>0.05)；沙门氏菌显著降低了蛋鸡平均日采食量(P < 0.05)，对其他生产性能指标无显著影响(P>0.05)，但有提高料蛋比趋势(0.05≤P < 0.10)；凝结芽孢杆菌显著降低了蛋鸡平均日采食量(P < 0.05)，极显著降低了料蛋比(P < 0.01)，对其他生产性能指标无显著影响(P>0.05)。
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表 3 凝结芽孢杆菌对感染沙门氏菌后蛋鸡生产性能的影响 Table 3 Effects of Bacillus coagulans on performance of laying hens after Salmonella infection |
由表 4可知，感染沙门氏菌前，与对照组相比，凝结芽孢杆菌组蛋壳重/蛋重极显著增加(P < 0.01)，其他指标无显著差异(P>0.05)，但有增加蛋壳强度的趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 4 凝结芽孢杆菌对感染沙门氏菌前蛋鸡蛋品质的影响 Table 4 Effects of Bacillus coagulans on egg quality of laying hens before Salmonella infection |
由表 5可知，感染沙门氏菌后，凝结芽孢杆菌与沙门氏菌对蛋鸡蛋品质无显著交互作用(P>0.05)；沙门氏菌对蛋品质无显著影响(P>0.05)，但有降低蛋黄重/蛋重的趋势(0.05≤P < 0.10)；凝结芽孢杆菌对蛋品质无显著影响(P>0.05)。
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表 5 凝结芽孢杆菌对感染沙门氏菌后蛋鸡蛋品质的影响 Table 5 Effects of Bacillus coagulans on egg quality of laying hens after Salmonella infection |
由表 6可知，感染沙门氏菌后，凝结芽孢杆菌与沙门氏菌对血浆总蛋白含量、钙/磷及谷草转氨酶活性有显著交互作用(P < 0.05)；沙门氏菌显著降低了血浆总胆固醇、甘油三酯和钙含量(P < 0.05)，显著提高了血浆谷草转氨酶活性(P < 0.05)，极显著提高了血浆碱性磷酸酶活性(P < 0.01)，对其他血浆生化指标无显著影响(P>0.05)，但有提高血浆总蛋白和球蛋白含量的趋势(0.05≤P < 0.10)，有降低血浆低密度脂蛋白含量和钙/磷的趋势(0.05≤P < 0.10)。凝结芽孢杆菌显著降低了血浆总胆固醇和甘油三酯含量(P < 0.05)，对其他血浆生化指标无显著影响(P>0.05)，但有提高血浆谷草转氨酶活性的趋势(0.05≤P < 0.10)，有降低血浆低密度脂蛋白含量的趋势(P < 0.10)。
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表 6 凝结芽孢杆菌对感染沙门氏菌后蛋鸡血浆生化指标的影响 Table 6 Effects of Bacillus coagulans on plasma biochemical indices of laying hens after Salmonella infection |
李国建[4]和刘磊等[5]研究表明，添加适量益生菌替代抗生素可以提升畜禽平均日增重与饲料转化效率。Hung等[6]研究表明，肉鸡饲粮中添加凝结芽孢杆菌可以提高肉鸡饲料转化效率。Zhou等[7]研究结果表明，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可以显著提高广西黄鸡的生产性能。与上述结果类似，本试验发现感染沙门氏菌蛋鸡饲喂凝结芽孢杆菌后，可以显著增加采食量和降低料蛋比，同时一定程度改善产蛋率、平均蛋重和只产蛋重等生产性能。
本试验发现，蛋鸡感染肠炎沙门氏菌后对生长性能具有不利影响，沙门氏菌感染显著降低蛋鸡采食量和提高料蛋比，蛋鸡感染肠炎沙门氏菌后，饲粮添加凝结芽孢杆菌对沙门氏菌感染导致的生长性能降低具有一定的缓解作用。王蔚淼等[8]研究表明，凝结芽孢杆菌对肠道细菌(如大肠杆菌、沙门氏菌等)引起的肠道感染有拮抗作用，综上，在沙门氏菌感染情况下，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可能具有保护机体健康和缓解病原菌应激等作用。
3.2 凝结芽孢杆菌对蛋鸡蛋品质的影响本试验研究发现，蛋鸡感染沙门氏菌前后，饲粮中添加凝结芽孢杆菌对试验鸡蛋品质无显著影响，但可一定程度上提高蛋壳厚度、蛋壳强度等。Xu等[9]研究指出，在饲粮中添加适量枯草芽孢杆菌可以增加蛋壳厚度、蛋黄颜色以及哈氏单位。李俊波等[10]发现饲粮中添加枯草芽孢杆菌可改善蛋重、蛋壳厚度以及哈氏单位等，并指出提高蛋壳厚度以及降低蛋的破损率可能与血钙的水平以及钙的利用率相关。Nahashon等[11]证明了益生菌可以使得蛋鸡矿物质盐类比如钙和磷吸收更加充分，提高血清中钙、磷水平，利于产蛋时钙的充分供应。
3.3 凝结芽孢杆菌对蛋鸡血浆生化指标的影响动物机体血浆生化指标与机体代谢、营养状况和疾病有密切关系，通过检测血浆生化指标可一定程度上反映动物机体在生理和病理上的变化。地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等益生菌能产生碱性、中性或酸性蛋白酶，从而促进饲粮中蛋白质的消化吸收[12]。滑静等[13]和陈家祥[14]等研究表明，在肉仔鸡中添加枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌能提高血浆总蛋白和白蛋白含量，本试验和上述报道基本一致，凝结芽孢杆菌与沙门氏菌对蛋鸡血浆总蛋白有显著的交互作用，凝结芽孢杆菌在蛋鸡感染沙门氏菌后血浆总蛋白显著升高，反映宿主在凝结芽孢杆菌与沙门氏菌相互作用下，机体产生相关应激反应。
血浆胆固醇、甘油三酯是反映机体脂质代谢的主要指标。吕尊周等[15]研究发现添加芽孢杆菌对血浆甘油三酯的含量显著降低影响。肠道微生物在脂类物质循环起着重要的作用，微生物能将游离脂肪酸转化成不同甘油三酯形式，从而阻碍了甘油三酯进入血液。血浆中胆固醇含量受到参与胆固醇合成的关键酶——羟甲基戊二酸单酰辅酶A活性的影响。益生菌可以抑制胆固醇合成过程中的关键酶，所以芽孢杆菌可能通过抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A活性来降低血清胆固醇的含量[16]。本试验添加凝结芽孢杆菌可以显著降低血浆总胆固醇和甘油三酯含量，与李福彬等[17]的报道结果相一致，李福彬等[17]研究发现添加地衣芽孢杆菌可以降低血清胆固醇。
血浆中碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等在临床上是评价肝、胰腺和肾脏等内脏功能正常与否的重要指标。本试验结果表明，蛋鸡感染沙门氏菌后可血浆中谷草转氨酶和碱性磷酸酶含量显著升高，但作用机制有待于进一步研究。
本试验结果表明，添加凝结芽孢杆菌可提高蛋鸡血浆中钙、磷含量，表明凝结芽孢杆菌可促进蛋鸡钙、磷的消化吸收，可能是凝结芽孢杆菌代谢产生了有机酸，促进了钙、磷的消化吸收。徐海燕等[18]研究发现，芽孢杆菌发酵液中含有一定量的乙酸、丙酸、丁酸等有机酸，这些物质可以降低肠道pH，促进矿物质吸收。
4 结论① 肠炎沙门氏菌使蛋鸡平均日采食量显著降低，料蛋比显著增加，但对其他生产性能指标、蛋品质无显著影响；血浆中总胆固醇和甘油三酯含量显著降低，谷草转氨酶和碱性磷酸酶含量显著升高，钙、磷含量具有降低的趋势。
② 饲粮中添加凝结芽孢杆菌使感染沙门氏菌后蛋鸡料蛋比显著降低，平均日采食量显著降低，其他生产性能指标得到改善，但对蛋品质无显著影响；显著降低血浆总胆固醇和甘油三酯的含量，同时改善血浆蛋白质代谢和脂质代谢。
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