金银花是忍冬科忍冬属多种植物的干燥花蕾，是我国的传统中药之一[1]。金银花主要化学成分为酚酸、黄酮、挥发类油和三萜皂苷类等[2-3]。金银花提取物主要的活性成分是绿原酸(chlorogenic acid, CGA)。研究表明，CGA具有抗氧化、抗菌、抗病毒等功能，可以增强机体免疫力[4]；最新研究表明，CGA在调控机体的糖脂代谢方面有显著作用[5]。目前关于金银花提取物对蛋鸡蛋黄胆固醇含量和脂质代谢的影响鲜有报道。因此，本研究以34周龄京粉2号蛋鸡为试验动物，在饲粮中添加不同水平的金银花提取物，分别测定蛋鸡的生产性能、蛋品质、脂质代谢和蛋黄胆固醇含量，并探讨通过添加金银花提取物来降低鸡蛋胆固醇含量的可能性，为金银花提取物在蛋鸡生产中的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料金银花提取物购于湖南绿蔓生物科技股份有限公司，有效成分CGA含量为25%。
1.2 试验设计及饲养管理试验选用同一鸡舍内产蛋率相近、体重相近、健康状态良好的34周龄京粉2号蛋鸡600只，随机分成4组，每组5个重复，每个重复30只鸡。对照组饲喂基础饲粮(不含金银花提取物)，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加100、200和300 mg/kg金银花提取物(有效成分CGA含量分别为25、50和75 mg/kg)的试验饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验期间，每天06:30和14:30各喂饲料1次。采用3层阶梯式笼养方式，自由采食、饮水。每天光照16 h，并清粪1次。试验分为预试期7 d和正试期28 d，共35 d。
1.3 测定指标及方法 1.3.1 生产性能以重复为单位每天记录蛋重、产蛋数、投料量、剩余料量、鸡只存栏数、破软蛋数，并计算平均蛋重、产蛋率、平均日采食量、破软蛋率、料蛋比。
1.3.2 蛋品质试验的最后1天，分别从每组中随机采取20个鸡蛋(每重复4个)用于测定鸡蛋物理品质指标，测定指标包括蛋形指数、蛋壳强度、蛋黄颜色、蛋壳厚度、哈夫单位。测定仪器包括蛋质检测仪(沈阳富士平工业有限公司)、蛋壳强度测定仪(沈阳富士平工业有限公司)、罗氏比色扇(美国罗氏公司)。
1.3.3 蛋黄胆固醇含量从每组中随机采取10个鸡蛋(每重复2个)测定蛋黄胆固醇含量。煮熟鸡蛋，研磨均匀，称取蛋黄1 g，用甲醇-氯仿溶液(1 : 2)研磨至无明显颗粒，混合8 min，过滤至10 mL容量瓶，并补充甲醇-氯仿溶液定容，待用。分别取0.02 mL蛋黄滤液、胆固醇标准液、甲醇-氯仿溶液加入样品管、标准管和空白管。在上述3支试管中加入邻苯二甲醛试剂3 mL，浓硫酸2 mL，混匀，冷却。用T-6紫外可见分光光度计(北京普析)以空白管调零，在560 nm处比色，计算蛋黄胆固醇含量[6]。
1.3.4 脂质代谢试验结束时，每个重复中随机选取1只鸡，翅静脉采血，以3 000 r/min离心10 min，分离血清，于-20 ℃保存。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。
1.4 统计分析试验数据差异采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示。
2 结果 2.1 金银花提取物对蛋鸡生产性能的影响由表 2可知，各试验组的产蛋率、料蛋比和破软蛋率与对照组相比无显著差异(P>0.05)。平均蛋重随着金银花提取物水平的增加呈先降低后升高的趋势，100和200 mg/kg组的平均蛋重与对照组相比无显著差异(P>0.05)，300 mg/kg组的平均蛋重与对照组相比显著增加(P < 0.05)。300 mg/kg组的平均日采食量与对照组相比显著增加(P < 0.05)。
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表 2 金银花提取物对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of honeysuckle extract on performance of laying hens |
由表 3可知，与对照组相比，各试验组的蛋形指数、蛋黄颜色、蛋壳厚度、蛋壳强度均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，各试验组的哈氏单位均显著提高(P < 0.05)，100、200和300 mg/kg组分别提高了8.2%、6.2%和9.2%。
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表 3 金银花提取物对蛋鸡蛋品质的影响 Table 3 Effects of honeysuckle extract on egg quality of laying hens |
由表 4可知，与对照组相比，各试验组的血清TG含量显著降低(P < 0.05)；各试验组的血清TC含量显著降低(P < 0.05)，300 mg/kg组下降最明显为27.56%。血清HDL-C含量随金银花提取物水平升高而升高，200、300 mg/kg组的血清HDL-C含量显著高于对照组(P < 0.05)。与对照组相比，各试验组血清LDL-C含量无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，200和300 mg/kg组的蛋黄胆固醇含量显著降低(P < 0.05)，分别下降了8.17%和18.06%。
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表 4 金银花提取物对蛋鸡脂质代谢和蛋黄胆固醇含量的影响 Table 4 Effects of honeysuckle extract on lipid metabolism and yolk cholesterol content of laying hens |
本试验结果表明，饲粮中添加300 mg/kg的金银花提取物可以显著提高蛋鸡平均日采食量和平均蛋重。金银花提取物中的主要活性成分是CGA，CGA具有抗氧化性、抗菌、抗毒、提高免疫力等多种功能[7]。张瑞仙[8]研究显示，在罗曼粉蛋鸡饲粮中分别添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%金银花，蛋鸡的平均日采食量均分别提高了5.46%、8.20%、9.53%和9.63%，1.0%、1.5%和2.0%的添加量均显著提高了产蛋率。黄涛等[9]在爱拔益加(AA)肉鸡饲粮中添加0(对照)、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的杜仲叶CGA，结果发现，0.15%试验组与对照组相比可以显著提高7~14日龄和28~35日龄肉鸡的平均日增重，0.05%和0.15%试验组可分别降低28~35日龄肉鸡料重比21.15%和19.34%。上述研究表明，CGA在改善动物生产性能方面具有积极作用。CGA改善动物生产性能可能是由于其具有较强的抗氧化能力，对脂质过氧化抑制有积极作用[10]。关炳烽等[11]试验表明，金银花提取物抗氧化能力与CGA含量相关，且其清除羟基自由基的能力优于维生素C。Zang等[12]研究发现，CGA清除羟基的清除速率常数为7.73×109，认为CGA的抗氧化性可能与直接清除羟基自由基有关。李文娜等[13]研究发现，CGA对超氧阴离子、羟基自由基、烷过氧自由基及1, 1-二苯基-2-苦肼基等自由基有较强的清除作用，对烷过氧自由基、超氧阴离子的清除能力超过了维生素C。此外，CGA具有抗菌、抗病毒的能力，有助于提高家禽免疫力，从而改善生产性能。研究表明，CGA可以增强流感病毒抗原引发的T细胞增殖[14]，并且在大鼠的研究中发现CGA可以显著提高其体内免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G(IgG)和白细胞介素-4(IL-4)含量[15]。马力等[16]研究表明，CGA可显著提高大鼠肠道固有层淋巴细胞中γ肿瘤坏死因子和α干扰素含量。
3.2 金银花提取物对蛋鸡蛋品质的影响本试验结果表明，试验组蛋形指数、蛋黄颜色、蛋壳厚度、蛋壳强度与对照组相比均无显著差异。各试验组均显著提高了鸡蛋哈氏单位，说明金银花提取物能够提高蛋白高度，一定程度上有助于增强蛋白分泌。张瑞仙[8]研究发现，在饲粮中添加0.5%和1.5%的金银花粉可适当提高鸡蛋哈氏单位，但差异并不显著。鸡蛋蛋白的分泌主要是在输卵管的膨大部分，金银花提取物可能在此对分泌产生影响，由于其活性物质CGA具有很好的抗氧化能力，有助于维持细胞膜的正常生理功能，这对分泌部位细胞膜可能具有积极作用，但其具体机制尚不完全清楚。邵洪等[17]认为，自由基会对氨基酸、多肽、蛋白质等进行修饰，促进蛋白质的降解，而金银花提取物中含有的CGA对自由基有良好的清除作用。
3.3 金银花提取物对蛋鸡脂质代谢和蛋黄胆固醇含量的影响蛋鸡体内的胆固醇来源主要有2个途径，第1个途径是外源性的胆固醇(饲粮中的胆固醇)，由于蛋鸡饲粮中通常不含胆固醇，所以这一途径可忽略不计；第2个途径是蛋鸡自身合成，合成的主要部位是肝脏，在肝脏中合成蛋黄胆固醇的前体物质是极低密度脂蛋白和卵黄蛋白原，合成的蛋黄胆固醇通过血液循环进入卵巢沉积于蛋黄中[18]。蛋鸡体内的胆固醇主要通过3种方式排出，其一是通过鸡蛋排出，这是最主要的方式，大概占胆固醇的2/3；其二是由肝脏和肠道产生中性固醇以粪便形式排出体外；其三是在肝脏中氧化的胆固醇形成胆汁酸通过粪便排出[19]。本试验研究发现，200和300 mg/kg组蛋黄胆固醇含量与对照组相比分别下降了8.17%和18.06%。金银花提取物中主要活性物质CGA影响蛋鸡脂肪代谢的原因可能有：1)通过影响胆固醇合成和分解的相关酶活性及相关基因表达来影响胆固醇水平。李文娜等[20]研究发现，杜仲叶CGA提取物抑制猪肝脏3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的效价强于辛伐他丁。HMG-CoA还原酶是胆固醇合成过程中的限速酶。Ong等[21]给口服葡萄糖耐量试验后的db/db小鼠饲喂含250 mg/kg CGA的饲粮，发现CGA可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)来改善葡萄糖和脂质代谢，从而影响AMPK-羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)通路。AMPK作用于HMGR肽链中Ser-871位点[22]。研究不同浓度5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核苷(AICAR)对肝细胞HMGR活性影响时发现，随着AICAR浓度增加，AMPK呈剂量依赖性活化的同时，HMGR呈剂量依赖性失活[23-24]。所以CGA可能通过激活AMPK，导致HMGR磷酸化失活，使胆固醇合成受到显著抑制。胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)是肝脏合成并促使胆固醇转化为胆汁酸的限速酶[25]。Wan等[26]通过对大鼠饲喂正常饲粮、高胆固醇饲粮以及在高胆固醇饲粮的基础上添加CGA(1和10 mg/kg)的饲粮的研究，发现与正常饲粮组相比，饲粮添加CGA后，CYP7A1表达有所增加，促使胆固醇转化为胆汁酸。2)通过调节胆固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)影响胆固醇合成。Murase等[27]发现，在Hepal-6细胞中添加5 μmol/L CGA可以下调乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶和SREBP-1c等mRNA表达。3)通过增强过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)来提高内源胆固醇的逆向转运，增强胆汁酸排泄。Li等[28]给雄性黄金仓鼠饲喂高脂饲粮(含脂肪15%)，之后对试验组每天按每千克体重80 mg的剂量在腹腔注射含CGA的溶剂，8周后CGA显著提高了仓鼠肝脏PPAR-α mRNA和蛋白质的表达水平。Fruchart等[29]认为，PPARs的活化作用于与高密度脂蛋白(HDL)相关的5种基因，包括载脂蛋白A(apo-A)、载脂蛋白B(apo-B)、脂蛋白酯酶(LPL)、B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BⅠ)和ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)，从而促进HDL形成，提高血清中HDL含量，促进胆固醇逆向转运的过程。本研究结果表明，金银花提取物能显著降低血清中TC和TG含量，且300 mg/kg组效果最好。200和300 mg/kg组均能提高血清HDL-C含量，促进胆固醇的逆向转运过程。
4 结论① 饲粮中添加300 mg/kg金银花提取物可以显著提高蛋鸡平均蛋重和平均日采食量，且对蛋鸡生产性能无不良影响。
② 饲粮中添加金银花提取物可以显著提高鸡蛋哈氏单位。
③ 饲粮中添加金银花提取物可通过提高血清HDL-C含量，促进胆固醇逆向转运，降低蛋黄胆固醇含量。
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