青贮是指以新鲜青饲料为原料，在密闭条件下，利用植物表面自然附生的乳酸菌，通过厌氧发酵，将植物表面的可溶性碳水化合物转化为乳酸、乙酸等有机酸，降低饲料pH，抑制霉菌等腐败微生物生长繁殖，达到保持青饲料营养特性的目的[1]。全株玉米青贮在反刍动物饲料供应中占有非常重要的地位，其由于具有营养价值高、适口性好和易保存等优点得到广泛应用，对“节粮型”及“秸秆型”畜牧业生产的发展起到积极的推动作用[2]。但是，在很多地区由于青贮技术不过关，加之青贮原料表面附着的乳酸菌数量不足，不能有效缩短青贮过程中的有氧呼吸阶段，造成腐败微生物滋生，营养成分消耗严重，导致青贮品质下降和饲料资源浪费。如何生产高效、优质、安全的玉米青贮已成为行业内高度关注的问题。近年来，关于提高青贮发酵品质添加剂的研究主要集中在微生物制剂、酶制剂、有机酸类、糖类等。综合前人研究表明，以乳酸菌为主的微生物制剂因具有有效抑制腐败微生物繁殖、降低青贮营养物质损失、提高青贮品质且效果较稳定等优势而备受关注。乳酸菌根据其发酵产酸能力主要分为2类，一类是同型发酵乳酸菌，另一类是异型发酵乳酸菌。前者发酵葡萄糖产生乳酸，后者除产生乳酸外，还可产生乙酸、乙醇、二氧化碳等产物[2-3]。研究表明，同型发酵乳酸菌可有效提高发酵过程中青贮品质，而异型发酵乳酸菌在提高青贮有氧稳定性中具有重要作用[4-6]。目前，关于利用乳酸菌制剂改善青贮饲料品质的研究多集中于单一菌种的添加，且研究表明2种类型的乳酸菌在提高青贮饲料品质方面均表现出各自的优势，而利用同型和异型发酵乳酸菌协同作用于青贮饲料的研究还相对较少。另外，由于受使用环境[7]、添加剂量[8]等方面的影响，导致部分已有研究结果仍存在差异，需进一步探讨。因此，本研究以山东省2016年9月收获的全株玉米为研究对象，采用同型和异型发酵乳酸菌复合制剂，探讨不同剂量复合乳酸菌制剂对全株玉米青贮品质及营养成分的影响，以期为乳酸菌制剂的推广应用提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验材料为山东省2016年9月刈割新鲜全株玉米，营养成分含量[干物质(DM)基础]：有机物(OM)86.84%，粗蛋白质(CP)8.27%，中性洗涤纤维(NDF)55.95%，酸性洗涤纤维(ADF)26.03%。青贮袋(75 cm×40 cm×8 cm)分内外2层，外层为聚丙烯材料，内层为聚乙烯材料。乳酸菌制剂(11GFT, 加拿大Pioneer Hi-Bred公司)，每克产品含有1.1×1011 CFU乳酸菌，包括布氏乳杆菌和干酪乳杆菌2种。
1.2 试验设计选取籽粒处于蜡熟期的新鲜全株玉米720 kg，品种为登海605，外观呈绿色，含水量为73.67%，切短至1~4 cm，平均分为4组，每组12个重复，每个重复15 kg。对照组每个重复喷雾添加45 mL去离子水，试验组分别喷雾添加2、10和20 mg/kg的乳酸菌制剂(预先稀释于45 mL去离子水中)，分别混合均匀。然后将全株玉米青贮快速装填并压实于青贮袋中，置于室温条件下密封保存，试验期60 d。
1.3 样品采集及指标测定于第45和60天分别开袋取样，每组取样6个重复，进行相关指标的测定。
1.3.1 感官评价指标按照德国农业协会(DLG)青贮质量感官评分标准进行评定[9]，根据青贮的气味(14分)、结构(4分)、色泽(2分)进行评分。综合3项得分，评定为优(16~20分)、可(10~15分)、中(5~9分)、下(0~4分)4个等级。
1.3.2 微生物数量取新鲜样本30 g，加入到盛有270 mL生理盐水的塑料袋或样品瓶中，充分搅拌后将此溶液稀释10~107倍数。微生物数量测定采用平板计数法，乳酸菌用MRS琼脂培养基进行计数，称取64.25 g MRS培养基于1 L蒸馏水中，加热煮沸溶解后置于121 ℃高压灭菌15 min，倾注平板备用。取100 μL不同浓度的接种液分别接种于平板上，涂匀后置于厌氧培养箱中37 ℃培养2 d，分别对平板上的乳酸菌进行计数。霉菌采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行计数，称取40.1 g马铃薯葡萄糖琼脂培养基于1 L蒸馏水中，加热煮沸溶解后置于121 ℃高压灭菌20 min，倾注平板后备用。取100 μL不同浓度的接种液分别接种于平板上，涂匀后置于37 ℃恒温培养箱中培养2~4 d分别进行计数(每个平板上菌落数控制在30~300个之间为有效)。
1.3.3 pH测定取10 g新鲜样本，加入90 mL去离子水，4 ℃浸提24 h，采用pH计(HI9025, 意大利Hanna Instruments公司)测定滤液pH。
1.3.4 有机酸及氨态氮含量测定取35 g新鲜样本，放入100 mL的广口三角瓶中，加入70 mL去离子水，4 ℃浸提24 h，然后通过2层纱布和定性滤纸过滤，所得的液体为青贮浸提液，置于-20 ℃条件下保存待测。滤液用来测定乳酸(LA)、挥发性脂肪酸(VFA)和氨态氮(NH3-N)含量。乳酸含量采用对羟基联苯法测定[10]，以乳酸钙为标准品做标准曲线，计算乳酸含量，结果以g/kg DM计。挥发性脂肪酸(VFA)含量采用高效气相色谱仪(GC-2010，日本岛津公司)进行测定[11]，包括乙酸、丙酸和丁酸含量，结果以g/kg DM计。氨态氮含量采用苯酚-次氯酸钠比色法进行测定[12]，以氯化铵为标准品做标准曲线，计算氨态氮含量，结果以g/kg TN(总氮)计。
1.3.5 化学成分测定取新鲜全株玉米青贮制备风干样本，按照AOAC(2015)[13]中的方法测定OM、CP、NDF及ADF含量。水溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate, WSC)含量采用蒽酮硫酸比色法测定[14]，以葡萄糖为标准品做标准曲线，计算WSC含量，结果以g/kg DM计。
1.4 数据统计与分析数据经Excel 2007初步整理后，采用SPSS 16.0软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计分析，多重比较采用Duncan氏多重比较检验，结果以平均值(mean)和均方根误差(SEM)表示，P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 乳酸菌制剂对全株玉米青贮感官评价指标的影响由表 1可见，各组全株玉米青贮气味、结构、色泽及综合评分均无显著差异(P>0.05)。
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表 1 乳酸菌制剂对全株玉米青贮感官评价指标的影响 Table 1 Effects of lactic acid bacteria preparation on sensory evaluation indices of whole corn silage |
由表 2可见，与对照组相比，2、10和20 mg/kg组45 d的乳酸菌数量分别提高了24.54%、25.96%和25.11%，差异均显著(P < 0.05)，霉菌数量分别降低了10.09%(P>0.05)、20.00%(P < 0.05)和14.13%(P>0.05)；2、10和20 mg/kg组60 d的乳酸菌数量分别提高17.44%、20.93%和20.54%，差异均显著(P < 0.05)，霉菌数量分别降低31.01%、29.65%和28.29%，差异均显著(P < 0.05)。
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表 2 乳酸菌制剂对全株玉米青贮微生物数量的影响 Table 2 Effects of lactic acid bacteria preparation on bacteria contents of whole corn silage |
由表 3可见，45和60 d，各组的pH均无显著差异(P>0.05)。45 d，2、10和20 mg/kg组的乳酸含量较对照组分别提高10.63%、7.90%和8.05%，差异均显著(P < 0.05)，乙酸含量分别提高了364.10%、288.76%和285.40%，差异均显著(P < 0.05)，而丁酸含量分别降低17.72%、15.19%和11.39%，差异均显著(P < 0.05)。60 d，与对照组相比，2及10 mg/kg组乙酸含量分别提高767.17%和171.73%，差异显著(P < 0.05)，各组其他指标无显著差异(P>0.05)。
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表 3 乳酸菌制剂对全株玉米青贮pH及有机酸含量的影响 Table 3 Effects of lactic acid bacteria preparation on pH and organic acid contents of whole corn silage |
由表 4可见，45 d，与对照组相比，2和20 mg/kg组CP含量提高了7.70%和11.85%，差异显著(P < 0.05)，2 mg/kg组NDF含量提高了15.90%，差异显著(P < 0.05)，2、10和20 mg/kg组氨态氮含量分别显著降低了15.44%、21.87%和18.60%(P < 0.05)。60 d，20 mg/kg组WSC含量较对照组降低了33.14%，差异显著(P < 0.05)，其他指标间无显著差异(P>0.05)。
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表 4 乳酸菌制剂对全株玉米青贮化学成分的影响 Table 4 Effects of lactic acid bacteria preparation on chemical composition of whole corn silage |
青贮的基本原理是利用好气性微生物和植物细胞本身的呼吸作用使青贮窖内尽快形成厌氧环境，然后在密闭厌氧条件下利用乳酸菌的活动，产生乳酸，抑制其他腐败微生物的活动，达到饲料长期保存及使用的目的[15]，一般包括好氧细菌活动阶段，乳酸菌发酵阶段和发酵稳定阶段等[16]。本研究表明，各组全株玉米青贮感官评价综合评分均在16~20分，达到优级标准，说明各组青贮效果均较好。微生物数量方面，添加乳酸菌制剂组的乳酸菌数量显著提高，霉菌数量均有不同程度降低，这与前人研究结果类似[17-18]，说明添加乳酸菌制剂可以促使乳酸菌成为青贮过程中的优势菌群，缩短好氧细菌活动阶段，对霉菌等有害微生物产生抑制作用[17]。有机酸含量分析结果表明，添加乳酸菌制剂可提高发酵45 d乳酸含量，表明添加乳酸菌制剂可以提高青贮早期乳酸生成量，改善青贮品质。但各组发酵60 d乳酸含量无显著差异，且60 d乳酸含量较45 d降低。分析原因为本试验采用的乳酸菌制剂为布氏乳杆菌和干酪乳杆菌混合剂，其中布氏乳杆菌属异型发酵乳酸菌，能分解乳酸产生挥发性脂肪酸如乙酸等。Kung等[19]将3种剂量(1×105、5×105、1×106 CFU/g)布氏乳杆菌接种于紫花苜蓿中发酵56 d，结果表明乳酸含量不同程度降低，乙酸含量升高。吕文龙等[20]将布氏乳杆菌接种于青玉米秸进行发酵，发现低剂量布氏乳杆菌可以一定程度上提高乳酸生成量，但随着储存时间的延长及剂量的提高，乳酸含量显著降低，乙酸含量显著升高。干酪乳杆菌属乳杆菌属，兼性异型发酵乳糖。Nishino等[4]报道，将干酪乳杆菌接种于全株玉米(2×106 CFU/g)和全混合日粮(3×106 CFU/g)发酵60 d后，乳酸含量提高，乙酸含量显著降低。随后，Nishino等[5]在羊茅草、全株玉米及全混合日粮中分别接种干酪乳杆菌，发酵60 d，结果也发现乳酸含量提高，乙酸含量降低。表明干酪乳杆菌可以提高青贮乳酸生成量、降低乙酸生成量。因此，本研究观测到的45 d试验组乳酸含量的升高可能与干酪乳杆菌的早期定植并发酵产生乳酸有关。但随着发酵时间的延长，布氏乳杆菌可在后期大量繁殖[21]，可能利用了干酪乳杆菌发酵产生的乳酸，导致60 d乳酸含量较45 d降低。另外，本研究还发现试验组乙酸含量较对照组有不同程度提高，且随着发酵时间的延长，乙酸含量继续升高。据报道，布氏乳杆菌在发酵过程中能将乳酸分解成乙酸和丙二醇，而相对乳酸而言，乙酸等挥发性脂肪酸是一种更有效的抗真菌及霉菌的酸类物质，因此更有利于提高青贮的有氧稳定性。综上，本研究发现的乳酸、乙酸含量的变化可能是布氏乳杆菌和干酪乳杆菌共同作用的结果。丁酸是由腐败菌和酪酸菌分别分解蛋白质、葡萄糖和乳酸而生成的产物，其含量的高低反映青贮饲料品质的优劣，丁酸含量越多，青贮品质越差[7, 22]。本研究发现添加乳酸菌制剂可以降低45 d青贮的丁酸含量，这与霉菌等腐败菌数量的降低相符合。
3.2 乳酸菌制剂对全株玉米青贮营养成分的影响全株玉米青贮的营养成分是评价青贮质量好坏的另一项重要指标。本研究发现，添加乳酸菌制剂可以一定程度上提高全株玉米青贮的CP含量，降低其中氨态氮的比例。青贮饲料中氨态氮主要由植物酶对蛋白质的降解和微生物分解利用蛋白质和氨基酸产生，总氮中氨态氮含量反映了青贮饲料蛋白质降解的程度[23-24]。Nishino等[5]将布氏乳杆菌、干酪乳杆菌分别接种于羊茅草和全混合日粮中进行发酵，结果表明氨态氮含量均显著降低。Li等[25]报道，在玉米秸秆中接种复合乳酸菌制剂发酵150 d后，总氮中氨态氮含量较对照组显著降低，CP含量显著提高。上述试验结果均与本研究类似，推测乳酸菌可能通过降低全株玉米在储存过程中蛋白质的降解作用或抑制腐败微生物的分解作用，从而降低总氮中氨态氮含量，间接提高CP含量，提高了其营养价值。此外，研究还发现试验组NDF含量不同程度升高，WSC含量降低，这与Addah等[22]的研究结果类似。玉米秸秆中含有较为丰富的WSC，为乳酸菌的定植提供了丰富的营养物质，因此乳酸菌的加入可能利用了秸秆中的WSC，使得细胞壁中难以降解的碳水化合物如NDF等组分有所升高[2]。综合各营养成分指标结果发现，尽管试验组CP含量较对照组提高，但各组OM含量差异并不显著，说明试验组全株玉米青贮的无氮化合物含量存在一定程度降低，这可能与乳酸菌利用了全株玉米青贮的可溶性碳水化合物等营养成分进行生长繁殖有关，乳酸菌的生长抑制了因腐败微生物作用引起的蛋白质的降解，从而使青贮品质维持在较高水平。这也与本研究观测到的发酵60 d全株玉米青贮的OM和WSC含量较45 d降低，而CP含量基本不变的结果相吻合。
4 结论在本试验条件下，添加乳酸菌制剂可以改善全株玉米青贮品质，提高营养价值。以青贮发酵过程中霉菌数量最低为依据，推荐乳酸菌制剂的添加量为10 mg/kg。
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