2. 广西壮族自治区兽药监察所, 南宁 530001;
3. 广西富凤集团, 南宁 530001
2. Institute of Veterinary Drug Control of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530001, China;
3. Guangxi Fufeng Group, Nanning 530001, China
动物在受到环境不良因素刺激时，生理状态会发生改变而引起神经、内分泌及免疫系统等一系列应答反应，造成免疫力和抵抗力低下，最终对其生长发育、生产性能产生不同程度的影响，严重时甚至引起死亡[1]。故而在不可避免的环境应激下，提高畜禽免疫功能有利于畜禽的健康生长，降低死亡率。已有研究表明，维生素E在动物体内发挥着多样作用，可作为免疫调节制调节动物体内的大部分组织正常执行功能[2]，故而在畜禽饲粮适当添加维生素E有利于其免疫功能的改善。α-生育酚是维生素E中活性最高一种形式，探索α-生育酚在机体内沉积量是否会随着摄入的维生素E量的增加而增加具有重要的意义。肝脏是鸡进行脂质代谢的主要场所，而这些过程得以正常进行有赖于许多参与脂质代谢的相关因子，这其中就有脂蛋白脂酶(LPL)与脂肪酸结合蛋白(FABPs)的作用。LPL是参与鸡肝脏内脂质代谢的重要因子，可以使极低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯脂解生成甘油和脂肪酸，而FABPs具有运输长链脂肪酸的作用，参与脂肪转运活动，可调节细胞内脂肪酸浓度从而调节脂肪酸代谢[3]。FABPs分布广泛，按被分离的组织来命名有9种类型，本研究选取其中与肝脏脂肪代谢联系相对更密切的脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)、心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)进行研究[4]。由于维生素E的脂溶和抗氧化的特性，在20世纪80年代它就被认定具有信号传导和基因调控作用[5]。本试验研究饲粮添加不同水平的维生素E对广西三黄肉鸡免疫功能、α-生育酚沉积的影响，并着重研究维生素E能否对动物的脂质代谢相关候选基因存在调控作用，为维生素E是否能通过影响相关基因表达来改善动物的脂质代谢提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计采用单因素完全随机设计，将256只80日龄健康、体重相近的广西三黄肉鸡(母鸡)作为试验动物，随机分为4组，每组4个重复，每个重复16只鸡。试验采用玉米-豆粕型的基础饲粮，对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别在基础饲粮中添加0、50、100、150 mg/kg的维生素E。预试期5 d，正试期35 d。采用笼养方式。试验添加的维生素E为DL-α-醋酸生育酚，有效成分含量为50%。
1.2 试验饲粮基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验鸡均在同一鸡舍内饲养，笼养方式饲养，采食粉料，不限制采食，自由饮水，自然光照、通风，管理与免疫程序按鸡场常规方法进行。
1.4 采样试鸡饲养至120日龄结束，每重复随机选2只试鸡，宰前禁食12 h, 只供饮水。屠宰时剖开体腔, 仔细分离出肝脏及左侧胸、腿肌，用双蒸水清洗血污杂质, 称重后取样至于液氮中冷冻保存, 后保存于-80 ℃超低温冰箱, 用于测定α-生育酚的含量和基因表达量。
1.5 测定指标及方法 1.5.1 免疫指标血清免疫指标：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素含量；采用全自动生化分析仪(ACA)测定血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)含量。
免疫器官指数：计算鸡的脾脏占体重的百分比得到脾脏指数。
1.5.2 α-生育酚的含量按照国标方法(GB/T 9695.30—2008)采用高效液相色谱法测定肝脏、胸肌及腿肌的α-生育酚的含量。
1.5.3 基因表达的测定总RNA提取采用Trizol法，结合实验室条件及按照GenStar公司的总RNA提取试剂盒说明操作。用酶标仪测定提取的总RNA浓度与纯度测定。
结合cDNA合成试剂盒的使用说明与本实验室的条件进行反转录操作将总RNA反转录为cDNA。
参考GenBank的鸡的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、LPL、A-FABP、H-FABP、L-FABP基因的序列, 设计相应的特异性引物。GAPDH，上游:5′-GGGGAAAGTCATCCCTGAGC-3′, 下游:5′-TTGGCTGGTTTCTCCAGACG-3′; LPL，上游:5′-CCGATCCCGAAGCTGAGATG-3′, 下游:5′-ACATTCCTGTCACCGTCCAC-3′; A-FABP，上游:5′-ATATGAAAGAGCTGGGTGTGGG-3′，下游:5′-TTTCTGTCATCTGCTGTGGTCT-3′; H-FABP，上游:5′-ACGGTGAAGACCCATAGCAC-3′，下游:5′-TTGACCAAGGACTTGACATGC-3′; L-FABP，上游：5′-ACTGTGACTACTGGCTCCAAAG-3′，下游:5′-TCCCTTCGTCATTGTATGGGTG-3′。
实时定量PCR(RT-PCR)反应体系：cDNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×RealStar Green Fast Mixture with ROX Ⅱ 10 μL，RNase-free H2O 7 μL。按体系把各反应成分加入PCR管混匀，低速离心使反应液集中于底部且使管中无气泡，放入实时定量PCR仪按照设定好的程序进行目的基因片段的扩增。实时定量PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性0.5 min，56 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸0.5 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。采用2-ΔΔCt法对基因表达量进行相对定量。
1.6 数据处理与统计分析数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，再用Duncan氏法做多重比较，试验结果均以“平均值±标准差”表示。
2 结果 2.1 维生素E对广西三黄肉鸡血清免疫指标及免疫器官指数的影响由表 2可见，与对照组相比，饲粮添加50 mg/kg维生素E使鸡血清中IgA含量显著提高(P < 0.05)；饲粮添加150 mg/kg维生素E使鸡血清中IgM含量显著提高(P < 0.05)；饲粮添加不同水平的维生素E对鸡血清中IL-2、TNF-α、γ干扰素、IgG含量及脾脏指数均无显著影响(P>0.05)。
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表 2 饲粮不同水平维生素E对广西三黄肉鸡血清免疫指标及免疫器官指数的影响 Table 2 Effects of different levels of vitamin E on serum immune indexes and immune organ indexes of Guangxi Sanhuang chickens |
由表 3可见，与对照组相比，饲粮添加50、100及150 mg/kg维生素E均能显著提高鸡肝脏α-生育酚含量(P < 0.05)；饲粮添加150 mg/kg维生素E显著提高鸡胸肌α-生育酚含量(P < 0.05)；饲粮添加不同水平维生素E对鸡腿肌α-生育酚含量无显著影响(P>0.05)，但随着维生素E的增加，鸡腿肌α-生育酚含量有所提高。
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表 3 饲粮不同水平维生素E对广西三黄肉鸡肝脏α-生育酚沉积的影响 Table 3 Effects of different levels of vitamin E on α-tocopherol deposition in liver of Guangxi Sanhuang chickens |
由表 4可知，随着在饲粮维生素E添加水平的升高，鸡肝脏的LPL、H-FABP及L-FABP基因的表达量均呈升高趋势。与对照组相比，饲粮添加100和150 mg/kg维生素E显著提高鸡肝脏的LPL基因表达量(P < 0.05)；饲粮添加150 mg/kg维生素E显著提高鸡肝脏的H-FABP基因表达量(P < 0.05)；饲粮添加50、100及150 mg/kg维生素E均显著提高鸡肝脏的L-FABP基因表达量(P < 0.05)；饲粮添加不同水平维生素E对鸡肝脏的A-FABP基因表达量无显著的影响(P>0.05)。
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表 4 饲粮不同水平维生素E对广西三黄肉鸡肝脏的LPL及FABPs基因的表达量的影响 Table 4 Effects of different levels of vitamin E on expression levels of LPL and FABPs genes in liver of Guangxi Sanhuang chickens |
由表 5可知，在三黄肉鸡中，维生素E添加水平与腿肌α-生育酚含量及肝脏LPL、H-FABP、L-FABP基因表达量均呈显著正相关(P < 0.05)。
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表 5 饲粮维生素E添加水平与广西三黄肉鸡组织α-生育酚含量及LPL、FABPs基因表达量的相关关系 Table 5 Correlation relationships between dietary vitamin E level and α-tocopherol content, expression levels of LPL and FABPs genes in tissues of Guangxi Sanhuang chickens |
在雏鸭饲粮中添加维生素E，可显著提高血清IgA含量，IgG和IgM含量也有升高趋势[6]。国外研究还表明，在给胚蛋注射维生素E后，其孵化率显著升高，鸡42日龄时，血清IgM和IgA含量显著提高，血清IgG含量也有所提高[7]。本试验中，与对照组相比，各试验组肉鸡血清IgG、IgA、IgM含量均有不同程度的提高，血清IL-2含量在试验组呈升高的趋势。这说明在饲粮中添加适宜水平的维生素E能增加肉鸡血清免疫球蛋白合成及促进IL-2的分泌，进而增强机体免疫力和对外界不良环境的抵抗力。蒋守群等[8]研究认为，维生素E缺乏会使家禽的免疫器官生长发育受到抑制甚至损伤，维生素E能显著降低其血清中TNF-α含量。而本试验结果在一定程度上支持了以上观点，维生素E对TNF-α的分泌有抑制作用，减轻因其引起的炎症反应，促进免疫系统的正常应答。综上，广西三黄肉鸡饲粮中增加适当水平的维生素E有利于机体内免疫应答因子的良好发展，进而一定程度上改善机体的免疫功能。
3.2 维生素E对广西三黄肉鸡组织α-生育酚含量的影响α-生育酚是维生素E的最主要活性成分，也是存在最多的一种异构体，故其在机体的含量基本可以代表维生素E的沉积情况。张宏馨等[9]研究表明提高维生素E添加水平，能显著提高蛋鸡肝脏α-生育酚含量。而在肉鸡饲粮添加α-生育酚醋酸酯，也可显著增加其血清中α-生育酚醋酸酯的含量[10]。更早的研究也表明，随着蛋鸡饲粮维生素E水平的升高，蛋黄、肝脏及肌肉的α-生育酚含量显著提高[11]。本试验的结果类似，这都表明了维生素E添加量与α-生育酚沉积正相关性较高，在允许范围内，机体摄入的维生素E越多其各组织沉积量也会越多。在3种组织中，可看出肝脏的α-生育酚沉积是胸肌、腿肌的几倍到十倍，这一定程度上表明了肝脏可能是调节机体内α-生育酚发挥作用的重要场所。
3.3 维生素E对广西三黄肉鸡LPL及FABPs基因表达的影响LPL基因表达水平与机体脂质代谢密切相关，不仅与肌内脂肪沉积有积极关系[12]，还是影响血浆脂质水平的关键因素[13]，本试验探讨维生素E是否能影响其向积极方面表达。结果表明，添加高水平的维生素E可显著提高肝脏LPL基因表达量，且两者呈显著正相关，说明维生素E可能影响LPL基因的表达而间接影响机体的脂质代谢。A-FABP由脂肪细胞和巨噬细胞释放，参与细胞间的脂质转运，是代谢和血管风险生物标志物[14]。本试验中，维生素E对肉鸡肝脏A-FABP基因表达量有不显著的微调作用，不会过高而对脂质代谢产生不利影响。H-FABP基因与脂肪组织的发育和功能密切相关, 被认为是脂质代谢的候选基因，能影响脂肪沉积[15]。本试验中，高水平的维生素E可显著提高试鸡肝脏H-FABP基因表达量，且两者呈显著正相关，说明维生素E可能可以通过影响H-FABP基因表达量来调节机体组织脂肪的沉积。肝脏中L-FABP基因的表达量受许多因素的影响，如高脂饲粮会使大鼠肝脏的L-FABP基因的表达量升高[16]，增加饲粮中的维生素E水平也能显著提高骡鸭肝脏中L-FABP基因表达量[17]。本试验结果与以上结论基本一致。综上表明，维生素E可一定程度影响与机体脂质代谢相关的LPL、H-FABP、L-FABP基因的表达，进而证明了维生素E可能存在影响相关基因的表达来间接对机体脂质代谢产生影响，但具体的影响机制还有待一步研究。
4 结论饲粮添加高水平(150 mg/kg)的维生素E可以改善广西三黄肉鸡的免疫功能，提高组织中α-生育酚的沉积，调节肝脏LPL、H-FABP、L-FABP基因表达量，从而影响机体的脂质代谢。
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