厌氧真菌是草食动物消化道内一类重要降解植物细胞壁的功能菌，在植物纤维组织消化中起着重要作用。它不仅能够利用假根生长穿透植物细胞壁的角质层和木质素，同时能够产生降解植物细胞壁的高活性纤维素酶、半纤维素酶、酯酶和纤维小体等[1-2]。厌氧真菌分泌的植物细胞壁降解酶活性高于目前市场上应用的菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)和曲霉(Aspergillus nidulans)[3]，在生物能源、饲料工业、沼气发酵等领域具有广阔的应用前景。目前，高植物细胞壁降解酶活性厌氧真菌的筛选成为研究热点，同时利用厌氧真菌及其植物细胞壁降解酶来提高生物质资源的利用率具有重要的现实意义。因此，本文在相关研究的基础上，概述厌氧真菌的分类地位、研究方法及其植物细胞壁降解酶的应用价值。
1 厌氧真菌简介由于长期对瘤胃厌氧真菌形态学和生理生化特征的认知比较欠缺，所以一直无法对厌氧真菌的生物学地位进行准确分类，厌氧真菌曾被错误认为是瘤胃原虫。直到1975年，英国科学家Orpin发现绵羊瘤胃中Neocallimastix frontalis等3类游动孢子的形态学特征和水生藻类真菌相似，而且其细胞壁含有真菌细胞壁所特有的几丁质，首次证实瘤胃中存在厌氧真菌[4-5]，随后将其归于真菌界鞭毛菌亚门壶菌纲(Chytridiomycetes)[6]。近年来大量的研究发现，厌氧真菌在多鞭毛游动孢子、超显微结构和氢化酶体等方面有着不同于其他壶菌的形态学和生理生化特征[7]。随着核糖体DNA(nrDNA)(18S、5.8S和28S)系统发育分析的发展，厌氧真菌被重新划分为Neocallimastigomycota(门)，Neocallimastigomycetes(纲)，Neocallimastigales(目)[8-9]。
经过40多年的研究，国内外学者已从草食动物消化道及粪样中分离获得20种以上的厌氧真菌(表 1)[10]。目前一般根据厌氧真菌游动孢子的鞭毛数、假根形态以及菌体特征等形态学特征将其分为6个属，分别为新美鞭菌属(Neocallimastix)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、根囊鞭菌属(Orpinomyces)、厌氧鞭菌属(Anaeromyces)、瘤胃真菌属(Caecomyces)、枝梗鞭菌属(Cyllamyces)[11-12]。
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表 1 从草食动物分离获得的部分厌氧真菌 Table 1 Overview of anaerobic fungal isolates from ruminant and non-ruminant herbivores[10] |
目前，厌氧真菌的分离培养多采用亨盖特滚管技术。该技术是Hungate在1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧细菌研究。其基本原理是将厌氧微生物接种到充满CO2或N2并装有已除氧培养基的密封亨氏管(图 1)中进行筛选培养[10]。该方法随后得到不断的改进完善，至今已成为研究严格、专性厌氧微生物的一种有效技术。
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a.装有液体培养基的厌氧管；b.装有液体培养基和滤纸条的厌氧瓶；c.装有固体培养基的厌氧管。 a. Anaerobic tube with liquid culture medium; b. Anaerobic bottle with liquid culture medium and filter paper stripe; c. Anaerobic tube with solid culture medium. 图 1 Hungate氏厌氧管 Figure 1 Hungate's anaerobic tubes[10] |
目前实验室使用较多的厌氧真菌培养基主要是以Hungate氏培养基[13]、M10培养基[14]、Lowe培养基[15]和Orpin培养基[16]为基础，根据各自研究目的对培养基进行一定的改良。这些培养基通常含有磷酸盐缓冲液、无细胞瘤胃液、L-半胱氨酸盐酸和刃天青指示剂等成分，不仅为厌氧真菌的生长提供稳定的pH(6.5~6.7)环境、丰富的营养物质，还能够检测并去除培养基中剩余的氧气。
2.2 分类鉴定由于不同种属厌氧真菌具有不同的形态学特征(表 2)[8]，在普通光学显微镜和扫描电子显微镜下可根据丝状假根(Neocallimastix、Piromyces、Orpinomyces、Anaeromyces)或球状假根(Caecomyces、Cyllamyces)，游动孢子鞭毛数量等特征对厌氧真菌进行初步的形态学种属鉴定。此外，应用DNA荧光染料对厌氧真菌细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察厌氧真菌细胞核分布情况，进而根据单中心类型(Neocallimastix、Piromyces、Caecomyces)或多中心类型(Orpinomyces、Anaeromyces、Cyllamyces)对菌株进行进一步分类鉴定。
但由于培养基成分、培养条件及传代次数等因素会对厌氧真菌的形态结构产生显著的影响，而且目前实验室条件下难以对游动孢子释放、孢子囊的生长等动态变化进行观察[11-12]。因此，厌氧真菌的分类鉴定需要形态学观察结合分子生物学手段进行。目前已应用于厌氧真菌鉴定的分子生物学技术主要有18S rDNA基因序列分析技术、核糖体内转录间隔区(ITS)序列分析技术和核糖体大亚基DNA(nrDNA-LSU)序列分析技术。但由于厌氧真菌18S rDNA序列高度保守(相似性>97%)，不能有效地分析厌氧真菌之间的关系[17]。与18S rDNA相比，厌氧真菌的ITS序列在进化过程中相对稳定而又相对变化，其位于nrDNA上的高度可变异区，能够显示真菌属间和属内的遗传变异，目前ITS1和ITS2序列已成为厌氧真菌分子鉴定、系统发育和遗传多样性分析的重要分子标记[18]。nrDNA-LSU序列也是位于nrDNA上的高变区，能够反映一个属、亲缘关系较近的种或一个种及其种群之间的进化关系[19]。越来越多的研究以28S rDNA作为厌氧真菌分子鉴定和系统发育分析的DNA片段[20-21]。Tan等[22]研究发现结合18S rDNA、28S rDNA D1/D2区和ITS序列能够更准确的对厌氧真菌进行种属鉴定。
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表 2 不同种属厌氧真菌的形态学特征 Table 2 Morphological classification of different anaerobic fungal genera[8] |
厌氧真菌具有很强的降解不同植物细胞壁的能力，在农业生物质资源利用中发挥重要的作用。厌氧真菌通过其丰富的假根系统侵袭难以被降解的纤维组织，破坏植物细胞壁结构并使其变得疏松，从而易于被其他微生物和水解酶降解。同时，厌氧真菌分泌高活性的纤维素酶(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶)、半纤维素酶(木聚糖酶)、酯酶(阿魏酸酯酶、乙酰酯酶和p-香豆酸酯酶)、漆酶和纤维小体等[1-2]，协同分解利用结构复杂的纤维素、半纤维素和果胶等物质。在厌氧真菌及其降解酶的共同作用下植物细胞壁高效地分解为葡萄糖、木糖等可溶性糖，使其在饲料工业、生物能源等领域的应用成为可能。
厌氧真菌利用不同碳源作为底物进行混合酸发酵，代谢产物主要为甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、H2和CO2等[23-25]。甲烷菌能够利用厌氧真菌的代谢产物，同时消除代谢产物对厌氧真菌生长繁殖的反馈抑制作用，促进真菌ATP产生，进而提高酶的活性和产量[26-27]。厌氧真菌与甲烷菌共培养显著提高其对纤维素等底物的降解能力，同时产生大量甲烷和乙酸等发酵终产物[27-29]，这为厌氧真菌在沼气发酵工程中的应用提供了理论依据。
3.1 在饲料工业和养殖业中的应用秸秆类粗饲料含有大量难以被降解且结构复杂的植物性多糖，单胃动物一般无法利用，反刍动物的消化率也仅有20%~30%[30]。而纤维素酶、半纤维素酶等植物细胞壁降解酶能够破坏植物细胞壁，将难以降解的多糖水解成易于被动物利用的单糖，同时消除木质素、纤维素和木聚糖的抗营养作用，从而改善秸秆类饲料的营养品质，提高粗饲料的利用率。Cao等[31]以燕麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆和小麦秸秆为饲料底物，连续10 d纯培养牦牛瘤胃真菌Neocallimastix sp. YAK11，发现牦牛真菌生长在富含纤维素的饲料细胞壁底物上能够分泌高活性的纤维素酶，并可促进对农作物秸秆的降解。Paul等[32]以小麦秸秆为底物进行体外发酵试验，发现野牛厌氧真菌和瘤胃微生物混合发酵24 h后可增加小麦秸秆的体外降解率。Nagpal等[33]从大象、山羊、绵羊等草食动物肠道内筛选获得的厌氧真菌表现出较高的木聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶和滤纸纤维素酶活性，同时体外发酵试验表明厌氧真菌能够提高饲料的干物质消化率。厌氧真菌能够高效的降解玉米秸秆、小麦秸秆等农业生物质资源，使得厌氧真菌及其植物细胞壁降解酶在缓解我国养殖业饲料短缺和提高动物粗饲料利用等方面具有广泛的应用前景。
同时，厌氧真菌直接作为添加剂也得到越来越多的应用。Thareja等[34]以小麦秸秆为底物的体外发酵试验表明，瘤胃厌氧真菌能够提高小麦秸秆干物质和中性洗涤纤维(NDF)的体外降解率。稻草黄贮时添加纯培养瘤胃真菌能够降低黄贮饲料NDF和酸性洗涤纤维(ADF)含量，提高黄贮饲料粗纤维的降解率[35]。王砀砀[36]在全株玉米青贮中接种厌氧真菌Piromyces sp. CN6，结果表明瘤胃真菌能够改善青贮饲料的发酵品质和营养成分，提高粗纤维的降解率。另外，在高粗料饲粮条件下，直接灌服瘤胃真菌能够提高育肥牛日增重、泌乳牛产奶量，同时能够提高瘤胃内挥发性脂肪酸浓度、游动孢子数量和饲料利用率[37-39]。
相较于常用的纤维素酶菌株，肠道真菌分泌的细胞壁降解酶活性高，酶系更完整，同时具有良好的酸碱稳定性和热稳定性。王砀砀等[40]研究发现，瘤胃厌氧真菌Piromyces sp. CN6分泌的木聚糖酶最适反应温度为50 ℃，最适pH为5.0，该酶在40 ℃和pH 5.0~8.0下较稳定；乙酰酯酶的最适反应温度为50 ℃，最适pH为9.0，该酶在40 ℃和pH 5.0~10.0下较稳定。Chen等[41]研究发现瘤胃真菌木聚糖酶在pH 3.0~11.0具有较高的活性，表现出较好的工业应用前景。曹阳春[42]研究发现Neocallimastix sp. YAK11分泌的阿魏酸酯酶活性在pH 4.0~9.0都比较稳定，乙酰酯酶活性在pH 5.0~10.0都比较稳定。而且粗酶液在50 ℃的水浴锅中保温24 h后，阿魏酸酯酶活性仍能剩余53%。厌氧真菌分泌的植物细胞壁降解酶具有较高的活性，其中部分水解酶的最适反应条件与动物消化道生理条件较接近，而且在较宽的温度和pH范围内均具有较高的活性，同时具有良好的热稳定性和酸碱稳定性，便于饲料制粒和储存，具有广阔的饲料工业生产潜力。
目前，主要是通过在饲料中添加纤维素酶、半纤维素酶等细胞壁降解酶来提高动物纤维饲料的消化率。真菌降解纤维试验存在效果不稳定，可重复性差，菌种差异性较大，真菌连续培养成本高、不可持续等问题。未来可通过利用厌氧真菌基因资源构建高效工程菌，优化培养和产酶条件达到工业生产的目的，使厌氧真菌降解酶基因资源以益生菌或酶制剂的形式大规模应用于饲料工业领域。
3.2 在生物能源领域中的应用生物质资源是自然界广泛存在的可再生、低成本、来源丰富的天然能源。利用生物质资源生产燃料乙醇成为可持续能源发展研究领域的热点。然而，生物质资源利用率低、生产成本高、发酵液中乙醇浓度低等问题限制生物能源的持续发展。Ranganathan等[43]研究发现，利用厌氧真菌Orpinomyces C1A及其分泌的植物细胞壁降解酶能够将预处理后的木质纤维素生物质更直接、更有效的转化为可溶性糖和生物燃料。该试验分为真菌定殖、多糖水解、微生物发酵等阶段，首先厌氧真菌利用生物质大量繁殖，并借助假根的生长破坏植物细胞壁表层，同时分泌降解植物细胞壁的纤维素酶、半纤维素酶和酯酶等。然后发酵罐中注入空气或者添加环己酰亚胺抑制真菌的繁殖和生长，植物细胞壁降解酶继续将生物质转成葡萄糖和木糖，该阶段发酵罐积累大量的可溶性糖。随后利用重组大肠杆菌K011将发酵罐中的可溶性糖转化成乙醇等生物燃料。厌氧真菌利用强大的假根系统和分泌的高活性植物细胞壁降解酶将木质纤维素高效的降解成可溶性糖，进而被重组大肠杆菌K011转化为乙醇等生物燃料。本试验最终高达14.1%的玉米秸秆被转化为乙醇。
相比于工业生产技术，利用厌氧真菌进行乙醇生产时，其优点是不用额外添加细胞壁降解酶，成本较低。而部分生物质被用于真菌自身的生长、繁殖和产酶等，生物质资源转化为乙醇的效率较低。但是，此法效率显著高于Chung等[44]利用Caldicellulosiruptor bescii strain JWCB033、Jin等[45]Clostridium phytofermentans ATCC700394、Minty等[46]利用里氏木霉RUTC30和大肠杆菌NV3 pSA55/69共培养等利用微生物生产燃料乙醇。
另外，真菌定殖阶段需要严格控制厌氧环境和培养条件，这也在一定程度上限制了其工业化生产。未来可通过严格控制发酵罐无氧环境、优化生物质前处理方法、改变微生物添加量、补充限制性降解酶等技术获取更高的可溶性糖产量，并通过应用高效微生物(利用可溶性糖生成乙醇)或多种微生物协同作用获取更多的燃料乙醇，从而提高生物质转化效率。
3.3 在沼气发酵工程中的应用沼气发酵是厌氧微生物在厌氧条件下将秸秆和粪便等有机质转化成沼气的一种发酵方式，是利用生物质能源的有效途径。但秸秆类生物质富含纤维素和半纤维素等难以被降解的成分，成为沼气发酵的限速因素。研究发现利用秸秆进行沼气发酵时添加厌氧真菌可以改善发酵品质，提高生物质降解率和沼气产量[47-49]。厌氧真菌应用在沼气发酵时能够促进秸秆类生物质的水解，提高发酵过程中甲烷菌的数量，加速秸秆的降解，进而增加沼气的产量。因此，厌氧真菌在沼气发酵工程领域具有广阔的应用前景。
4 小结由于厌氧真菌具有严格厌氧的特性，因此在保存、运输和应用过程中需要严格控制无氧环境，同时厌氧真菌对培养条件(pH、温度等)要求严格，这对厌氧真菌的大规模应用提出了较大的挑战。未来应进一步研究完善厌氧真菌保存方法，使其在保存、运输等过程中保持较高的活性。同时，继续从长期饲喂高粗饲料反刍动物(牦牛、水牛等)瘤胃中筛选获得高细胞壁降解酶活性厌氧真菌，挖掘酶基因，构建高效工程菌并优化培养和产酶条件，以便进行大规模的植物细胞壁降解酶的工业化生产与应用。
厌氧真菌具有微生物发酵的优势和特点，其发酵速度快，分泌的细胞壁降解酶活性高、种类丰富，降解酶之间具有高效协同作用。高活性植物细胞壁降解酶作为添加剂在饲料工业、制浆造纸、食品工业等领域的应用具有广阔的前景。同时，实验室的理论研究已证明厌氧真菌及其植物细胞壁降解酶可提高生物质资源的利用率，以及利用廉价的木质纤维素底物生产高活性木聚糖酶、酯酶、甲烷、燃料乙醇和乙酸等。因此，厌氧真菌可直接、大规模应用于生物能源和沼气发酵等厌氧发酵领域，并具有广阔的工业发展前景和重大的社会意义。
随着全球范围内的人口、能源、环境问题的加剧，对生物质资源的有效开发和利用已成为共识的趋势和热点，而利用厌氧真菌及其植物细胞壁降解酶将生物质资源绿色高效的转化为具有高附加值的化合物是解决上述问题的重要途径，对社会和经济具有推动作用。
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