2. 浙江维丰生物科技有限公司, 建德 311600
2. Zhejiang Weifeng Bio-Technology Co., Ltd., Jiande 311600, China
硒(selenium,Se)是人和动物机体必需的微量元素之一[1-2],在维持体内氧化还原状态[3]、保护机体免疫系统不受侵害[4]、提高繁殖性能[5]以及防治癌症[6]等许多关键的生理机能中都发挥着重要作用。而硒的摄入不足则会引起一系列病症的产生,例如,仔猪摄入硒不足会导致其行动不便、站立不稳以及白肌病等病症的产生[7];鸡缺硒会出现白肌病和渗出性素质等病症[8]。硒通过含硒蛋白作用于动物体内的抗氧化酶而发挥其抗氧化功能,而动物体内最为重要的抗氧化酶就是谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase, GSH-Px)。GSH-Px经过与硒蛋白的相互作用,特异地催化谷胱甘肽还原和清除机体内有毒的过氧化物,保护动物的细胞、组织和器官免受氧化损伤[9]。然而,硒在动物体内的含量达到较高水平后同样具有致毒作用,因而开发低毒、高效的硒源并探索硒的最适添加量一直是硒在动物营养领域的研究热点。纳米硒(nano-selenium)是一种纳米级单质硒,其粒径一般不超过100 nm。与无机硒相比,纳米硒具有生物活性高、毒性低、吸收利用高、沉积效果好等优势,有望逐步取代无机硒在饲料工业中的应用[10-11]。张乙山等[12]在肥育猪基础饲粮中分别添加纳米硒、有机硒和无机硒3种硒源,发现纳米硒无论是在抗氧化作用,还是在硒沉积上都有着最好的效果。已有研究分别验证了纳米硒对仔猪或肥育猪在生长发育[13-16]、肌肉品质[17]、硒含量[16]、免疫功能[14]、甲状腺功能[18]及抗氧化指标[13, 16]的积极作用。甘氨酸纳米硒(glycine nano-selenium,G-SeNPs)是一种以甘氨酸为纳米硒修饰载体的新型硒源,其理化性质稳定、流散性好、不产生团聚,然而还鲜有研究触及其对肥育猪在抗氧化作用及组织硒含量的影响。因此,本试验以杜大长肥育猪为试验动物,探讨不同添加水平的甘氨酸纳米硒对肥育猪血清和组织器官抗氧化能力及硒含量的影响,为甘氨酸纳米硒未来在肥育猪饲粮中的广泛应用提供一定的理论指导。
1 材料与方法 1.1 试验材料与基础饲粮甘氨酸纳米硒,饲料级,平均粒径60 nm,由浙江省建德市维丰饲料有限公司提供,硒含量为1%。甘氨酸纳米硒是以甘氨酸为修饰剂和分散剂,纳米硒为膜的复合物,外观呈红褐色,粉末状,无臭,有甘氨酸的特殊甜味,易吸潮和溶于水。作为饲料添加剂使用时,甘氨酸纳米硒为固体颗粒,当溶于水中时,甘氨酸被完全溶解,单质硒又恢复成纳米级并呈圆球状悬浮于溶液中。
试验动物的基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮,是参照NRC(2012)标准配合而成的粉状饲料,基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
挑选体重约70 kg的杜长大三元杂交肥育猪160头,随机分为4组,每组4个重复,每个重复10头,每个重复内公母各占1/2,公猪为去势公猪。第1组为对照组,饲喂基础饲粮(饲粮中不添加任何硒源),其余3组饲喂在基础饲粮基础上分别添加0.1、0.3、0.5 mg/kg(以硒计)甘氨酸纳米硒的试验饲粮。试验于2015年9—11月在浙江省湖州市正新牧业有限公司开展。预试期5 d,正试期60 d。
1.3 样品采集试验结束前24 h禁止喂食,自由饮水,按体重相近原则从每个重复中选取2头猪(公母各1头),共32头,前腔静脉采血,置于37 ℃水浴锅中静置30 min,然后3 000 r/min离心10 min,用移液枪移取上清液于1.5 mL离心管中,将血清转移至-70 ℃冰箱中保存待测。
将采血后的猪屠宰取肌肉、肝脏、心脏、肾脏、胰脏等样品,肌肉采集自左侧胴体最后肋骨,约100 g;肝脏采集自肝小叶中部,约20 g;肾脏采集自左肾脏,约20 g;心脏及胰脏的采集重量也均是20 g。将肌肉及脏器样品剪取后,锡纸包裹放入液氮罐中速冻,然后再小心取出转移至-70 ℃冰箱中保存待测。
1.4 检测指标与方法 1.4.1 血清和组织器官中抗氧化指标测定及方法血清和组织器官中总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC),GSH-Px、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)活力以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的检测方法和步骤均严格按试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)中说明书操作,采用的测定仪器为SpectraMax MS酶标仪或UV-2000紫外-可见光分光光度计。
1.4.2 血清中硒含量测定及方法取100 μL血清样品于玻璃试管中,加入50%(体积分数)盐酸溶液和混酸(5%硫脲+5%抗坏血酸)溶液各1 mL,反应15 min后用超纯水定容,混匀。于AFS-3100型全自动双道原子荧光光度计(杭州德茂科技有限公司)上机测定。
1.4.3 组织器官中硒含量测定及方法滤纸拭干组织器官样品后,称取0.2 g样品于微波消解罐中,加入1 mL过氧化氢(H2O2),拧紧罐盖,使其消解至无色透明溶液后赶酸约30 min。用超纯水定容,混匀后取2 mL上述溶液于试管中,然后加入50%(体积分数)盐酸溶液和混酸(5%硫脲+5%抗坏血酸)溶液各1 mL,反应15 min后用超纯水定容,混匀。于AFS-3100型全自动双道原子荧光光度计(杭州德茂科技有限公司)上机测定。
1.5 统计分析所有测试指标均以平均值来表示,不考虑性别差异,每个组作为1个统计单元,共4个统计单元。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较不同纳米硒添加水平对各个指标的影响,事后检验(post hoc test)采用LSD检验,所有分析用SPSS 20.0(IBM)完成。显著性水平设为0.05,极显著性水平设为0.01。
2 结果 2.1 血清抗氧化指标由表 2可知,饲粮添加甘氨酸纳米硒对育肥猪血清T-AOC,GSH-Px、SOD和CAT活力以及MDA含量均产生了极显著影响(P < 0.01)。与对照组相比,饲粮添加0.1、0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使肥育猪血清T-AOC分别提高了7.07%(P < 0.05)、16.03%(P < 0.01)和20.25%(P < 0.01);饲粮添加0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使血清GSH-Px活力分别提高了15.02%(P < 0.01)和15.39%(P < 0.01),使血清SOD活力分别提高了7.89%(P < 0.01)和12.93%(P < 0.01),使血清CAT活力分别提高了23.24%(P < 0.01)和25.04%(P < 0.01),使血清MDA含量分别降低了9.06%(P < 0.01)和16.37%(P < 0.01)。线性分析表明,血清T-AOC以及GSH-Px、SOD和CAT活力与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著正相关(P < 0.01),而血清MDA含量与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著负相关(P < 0.01)。
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表 2 饲粮添加甘氨酸纳米硒对肥育猪血清抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of G-SeNPs supplementation on antioxidant indexes in serum of finishing pigs (n=4) |
由表 3可知,饲粮添加甘氨酸纳米硒仅对肌肉GSH-Px、SOD活力和MDA含量造成了极显著影响(P < 0.01)。与对照组相比,饲粮添加0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使肥育猪肌肉GSH-Px活力分别提高了13.35%(P < 0.01)和15.33%(P < 0.01),使肌肉SOD活力分别提高了8.97%(P < 0.05)和12.90%(P < 0.05),使肌肉MDA含量分别降低了40.75%(P < 0.01)和38.49%(P < 0.01)。线性分析表明,肌肉GSH-Px和SOD活力与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著正相关(P < 0.01),而肌肉MDA含量与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著负相关(P < 0.01)。
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表 3 饲粮添加甘氨酸纳米硒对肥育猪肌肉抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of G-SeNPs supplementation on antioxidant indexes in muscle of finishing pigs (n=4) |
由表 4可知,饲粮添加甘氨酸纳米硒对肝脏GSH-Px、SOD、CAT活力以及MDA含量造成了极显著影响(P < 0.01)。与对照组相比,饲粮添加0.1、0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使肥育猪肝脏GSH-Px活力分别提高了8.51%(P < 0.01)、22.10%(P < 0.01)和29.38%(P < 0.01),肝脏MDA含量分别降低了7.49%(P < 0.01)、14.15%(P < 0.01)和15.36%(P < 0.01);饲粮添加0.3 mg/kg甘氨酸纳米硒使肝脏SOD活力提高了5.35%(P < 0.01);饲粮添加0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使肝脏CAT活力提高了15.57%(P < 0.05)。线性分析表明,肝脏GSH-Px、SOD和CAT活力与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著正相关(P < 0.01),而肝脏MDA含量与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著负相关(P < 0.01)。
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表 4 饲粮添加甘氨酸纳米硒对肥育猪肝脏抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of G-SeNPs supplementation on antioxidant indexes in liver of finishing pigs (n=4) |
由表 5可知,饲粮添加甘氨酸纳米硒对肾脏T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量造成了极显著影响(P < 0.01)。与对照组相比,饲粮添加0.1、0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使肥育猪肾脏GSH-Px活力分别提高了5.34%(P < 0.05)、12.47%(P < 0.01)和16.98%(P < 0.01);饲粮添加0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使肾脏T-AOC分别提高了10.16%(P < 0.01)和11.32%(P < 0.01),使肾脏SOD活力分别提高了3.95%(P < 0.05)和4.59%(P < 0.05),使肾脏MDA含量分别降低了8.91%(P < 0.01)和10.04%(P < 0.01);饲粮添加0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使肾脏CAT活力提高了8.80%(P < 0.05)。线性分析表明,肾脏T-AOC和GSH-Px活力与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著正相关(P < 0.01),而肾脏MDA含量与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著负相关(P < 0.01)。
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表 5 饲粮添加甘氨酸纳米硒对肥育猪肾脏抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of G-SeNPs supplementation on antioxidant indexes in kidney of finishing pigs (n=4) |
由表 6可知,饲粮添加甘氨酸纳米硒对胰脏T-AOC,GSH-Px、CAT活力和MDA含量造成了极显著影响(P < 0.01)。与对照组相比,饲粮添加0.1、0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使肥育猪胰脏T-AOC分别提高了13.70%(P < 0.01)、15.25%(P < 0.01)和18.86%(P < 0.01);使胰脏GSH-Px活力分别提高了6.79%(P < 0.05)、13.84%(P < 0.01)和23.01%(P < 0.01);饲粮添加0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使胰脏CAT活力分别提高了10.52%(P < 0.01)和10.98%(P < 0.01),使胰脏MDA含量分别降低了13.68%(P < 0.01)和18.87%(P < 0.01)。线性分析表明,胰脏T-AOC,GSH-Px、CAT活力与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著正相关(P < 0.01),而胰脏MDA含量与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著负相关(P < 0.01)。
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表 6 饲粮添加甘氨酸纳米硒对肥育猪胰脏抗氧化指标的影响 Table 6 Effects of G-SeNPs supplementation on antioxidant indexes in pancreas of finishing pigs (n=4) |
由表 7可知,饲粮添加甘氨酸纳米硒对心脏T-AOC,GSH-Px、SOD、CAT活力和MDA含量造成了极显著影响(P < 0.01)。与对照组相比,饲粮添加0.1、0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使肥育猪心脏T-AOC分别提高了5.48%(P < 0.05)、6.62%(P < 0.01)和10.73%(P < 0.01),使心脏GSH-Px活力分别提高了12.17%(P < 0.01)、39.77%(P < 0.01)和49.49%(P < 0.01),使心脏CAT活力分别提高了7.59%(P < 0.01)、10.09%(P < 0.01)和18.05%(P < 0.01),使心脏MDA含量分别降低了15.34%(P < 0.01)、28.01%(P < 0.01)和45.82%(P < 0.01);饲粮添加0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使心脏SOD活力分别提高了7.54%(P < 0.05)和11.62%(P < 0.01)。线性分析表明,心脏T-AOC,GSH-Px、SOD和CAT活力与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著正相关(P < 0.01),而心脏MDA含量与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著负相关(P < 0.01)。
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表 7 饲粮添加甘氨酸纳米硒对肥育猪心脏抗氧化指标的影响 Table 7 Effects of G-SeNPs supplementation on antioxidant indexes in heart of finishing pigs (n=4) |
由表 8可知,饲粮添加甘氨酸纳米硒血清及组织中硒含量造成了极显著影响(P < 0.01)。与对照组相比,饲粮添加0.1、0.3和0.5 mg/kg甘氨酸纳米硒使血清硒含量分别提高了79.23%(P < 0.01)、169.97%(P < 0.01)和210.97%(P < 0.01),使肌肉硒含量分别提高了3.30%(P < 0.05)、5.61%(P < 0.01)和16.50%(P < 0.01),使心脏硒含量分别提高了6.92%(P < 0.01)、22.68%(P < 0.01)和36.69%(P < 0.01),使肝脏硒含量分别提高了15.31%(P < 0.01)、31.82%(P < 0.01)和46.62%(P < 0.01),使胰脏硒含量分别提高了9.27%(P < 0.01)、15.23%(P < 0.01)和24.69%(P < 0.01),使肾脏硒含量分别提高了18.8%(P < 0.01)、31.35%(P < 0.01)和37.4%(P < 0.01)。血清及各器官(心脏、肝脏、胰脏、肾脏)硒含量在不同添加水平甘氨酸纳米硒组间也存在极显著差异(P < 0.01)。线性分析表明,血清及组织器官中硒含量与甘氨酸纳米硒添加水平呈极显著正相关(P < 0.01)。
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表 8 饲粮添加甘氨酸纳米硒对肥育猪血清和组织器官硒含量的影响 Table 8 Effects of G-SeNPs supplementation on Se content in serum, tissue and organs of finishing pigs (n=4) |
在动物机体内无时无刻都有自由基的产生,而氧自由基是机体内极为活跃且所占比例极高的一类自由基[19]。正常情况下氧自由基并不会给人和动物带来伤害,但过多的氧自由基能通过脂质过氧化作用对细胞产生损害作用,进而影响到机体各系统的正常运转、破坏机体稳态,从而对动物的健康造成损害。动物机体本身存在清除氧自由基的系统,这个系统主要由酶组分和非酶组分2个体系组成。酶组分主要包括SOD、CAT、GSH-Px;非酶组分主要包括维生素C、维生素A、维生素E等。动物体内SOD、CAT、GSH-Px等酶组分活力高低可以间接地反映机抗氧化能力的强弱。本试验通过测定血清中的抗氧化指标发现,饲粮添加甘氨酸纳米硒可使肥育猪血清抗氧化能力呈极显著线性增加,以添加水平为0.5 mg/kg时效果最优。
3.2 甘氨酸纳米硒对肥育猪肌肉抗氧化能力的影响经过人们长期对猪种的选育,猪的生产性能和瘦肉率已经有了很大的改善,但劣质肉的时常出现常导致额外的经济损失。肥育猪肉品质会受到内外多种因素,包括遗传、营养、运输和致死方式等因素的影响,除此之外,脂质过氧化对肉质的影响同样是不容忽视的[20]。研究表明肌肉细胞膜上的不饱和脂肪酸极易受到氧自由基的氧化,破坏肌肉细胞的完整性,致使肌肉中肌红蛋白的流失增多,从而使肉品质降低[21]。寇庆等[22]对肉鸡的研究表明,在饲粮中添加0.3 mg/kg的酵母硒可显著提高肌肉SOD活力,降低肌肉MDA含量。另有研究表明在生长肥育猪饲粮中补充0.3 mg/kg的酵母硒能增强肌肉中SOD和GSH-Px的活力,同时使肌肉中MDA含量得到下降[23]。本试验研究显示,饲粮添加甘氨酸纳米硒可在一定程度上可以提高肌肉CAT、GSH-Px、SOD活力及T-AOC,同时肌肉中MDA含量也有所降低,表明甘氨酸纳米硒可使肌肉的抗氧化能力增强,从而为防止肉品质下降过快起到促进作用。
3.3 甘氨酸纳米硒对肥育猪脏器抗氧化能力的影响硒是人和动物机体必需的微量元素之一,它能清除体内过多的自由基,从而提高机体抗氧化能力,防止细胞或组织因脂质化而受到损害,维护动物机体健康。研究表明肝脏和肾脏不仅是动物机体内的重要解毒器官,同时也是动物机体内代谢硒的重要场所。硒是动物机体内重要的抗氧化酶GSH-Px的活性成分,所以动物饲粮中硒的含量很大程度上影响组织器官中抗氧化酶的活力。研究表明,缺硒饲粮会导致机体本身抗氧化酶的活力下降,进而影响动物机体抗氧化能力[24]。另有报道指出给大鼠饲喂含0.2 mg/kg的纳米硒的饲粮可以提高大鼠肝脏、肾脏和心脏中SOD、GSH-Px以及CAT活力,降低其脏器内MDA含量[25]。本试验研究结果表明,3个添加水平的甘氨酸纳米硒添加组的心脏、肾脏、肝脏和胰脏中SOD、GSH-Px、CAT活力和T-AOC均较对照组有不同程度的上升,而心脏、肾脏、肝脏和胰脏中MDA含量则有不同程度的下降。综上所述,饲粮添加甘氨酸纳米硒对提高肥育猪各脏器抗氧化能力有促进作用,且以添加水平为0.5 mg/kg时效果最好。
3.4 纳米硒对育肥猪血清及组织器官硒含量的影响硒被动物代谢吸收后广泛存在于各组织中,在硒的安全添加剂量内,过多的硒会通过尿液等途径排出体外。各组织器官中硒含量的多少不仅与添加的硒源和添加水平有关,而且与动物种类有关。研究者分别以不同剂量的蛋氨酸硒、酵母硒、无机硒添加到基础饲粮中作为试验组,基础饲粮为对照组,通过饲喂肉仔鸡研究硒对其血浆和组织器官硒含量的影响。结果表明,补硒组较对照组显著提高了肉仔鸡肝脏、肾脏、胸肌和血浆中硒含量;相同添加水平下,蛋氨酸硒的添加效果优于酵母硒,无机硒的添加效果最差;补硒组中以最高添加水平0.7 mg/kg的效果最佳[26]。张磊等[27]研究富硒地区山羊体内硒含量的试验发现,富硒地区山羊的心脏、肝脏、脾脏、血清中硒含量显著或极显著高于正常硒水平地区的山羊。本试验中,在饲粮中添加不同水平的纳米硒均可极显著提高肥育猪血清和各组织器官中硒含量,且随添加水平的增加,血清和各组织器官中硒含量极显著升高。农业部1224号公告指出,含硒饲料添加剂在配合饲料或全混合日粮中的最高限量为0.5 mg/kg。在避免饲粮中硒含量超标的前提下,本试验的最高硒添加水平设为0.5 mg/kg,在此添加水平下肥育猪机体硒含量最高。
4 结论饲粮添加甘氨酸纳米硒能提高肥育猪血清及组织器官的抗氧化能力,并提高肥育猪血清及组织器官硒含量,综合考虑,以添加水平为0.5 mg/kg时效果最佳。
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