2. 长沙绿叶生物科技有限公司, 长沙 410125;
3. 弗罗兹瓦夫环境与生命科学大学兽医学院, 弗罗兹瓦夫 50-375, 波兰;
4. 湖南畜禽安全生产协同创新中心, 长沙 410128
, YI Xianglian1, ZHAO Jing1, WANG Xihong1, POZNIAK Blazej3, WEN Lixin1,4, WU Jing1
, YI Jin1,4
2. Changsha Lvye Bio-Technology Co., Ltd., Changsha 410125 China;
3. Department of Biochemistry, Pharmacology and Toxicology, Faculty of Veterinary Medicine, Wroclaw University of Environmental and Life Sciences, Wroclaw 50-375, Poland;
4. Hunan Co-Innovation Center Production Safety, Changsha 410128, China
氧化应激是指机体内氧化系统和抗氧化系统的平衡失调从而引起的一系列适应性反应。在畜牧生产过程中，氧化应激对动物的健康产生一系列的影响，例如，畜产品品质下降、种畜繁殖障碍、幼畜成活率低和发病率高、神经毒性等[1-3]。研究发现，一些抗氧化剂能清除自由基和减少自由基产生的危害，提高动物的生产和繁殖性能，增强机体的免疫力和提高幼畜的成活率，延长寿命及改善畜产品质量[3]。天然抗氧化剂由于其安全和低毒副作用成为了研究的热点。
桦木酸(betulinic acid, BA)是植物源性五环三萜类物质，具有抗氧化应激、免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗微生物和抗寄生虫等多种生物活性[4-6]。本课题组前期研究发现，BA对地塞米松(dexamethasone, Dex)诱导的氧化应激具有预防性的保护作用，该保护作用与BA增强机体超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，抑制自由基和脂质过氧化物产生，从而提高抗氧化能力有关；进一步研究发现，BA阻断活性氧(ROS)对线粒体膜通透性的影响，有效清除ROS对细胞的损伤，通过抗氧化应激从线粒体信号转导通路减少淋巴细胞凋亡，从细胞内源性途径对淋巴细胞起到保护作用[7-10]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路与氧化应激有着极其密切的关系，因此，根据前期的研究基础[10]，本试验采用Dex诱导小鼠氧化应激模型，旨在研究BA是否能通过调控c-Jun氨基末端激酶(JNK)-P38 MAPK信号通路缓解氧化应激，从而进一步探讨BA抗氧化应激的分子机制。
1 材料与方法 1.1 试验试剂BA，来源参照参考文献[10]，具体制备方法按参考文献[11]，高效液相色谱(HPLC)测定BA纯度为96.53%；Dex磷酸钠注射液购自濮阳市汇元药业有限公司；总抗氧化能力(T-AOC)、抑制羟自由基能力和过氧化物酶(POD)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Trizol提取试剂盒购自Life公司；反转录(RT)-PCR试剂盒、实时定量(qRT)-PCR引物和荧光染料SYBR green均购自Takara公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid disodium, BCA)法蛋白浓度检测试剂盒购自联科生物技术有限公司；Western及IP细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所；凋亡信号调节激酶1(ASK1)、JNK和P38抗体购自Cell Signaling Technology；辣根酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)购自美国KPL公司；ECL检测试剂盒购自凯基生物技术股份有限公司；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)标准蛋白购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 试验动物与饲料试验动物为40只健康雄性昆明小鼠，4周龄，无特定病原体(SPF)级，体重为(20±2)g。饲料为小鼠普通育成料，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，其主要原料是小麦、玉米、豆油、麸皮、豆粕、鱼粉、麦芽糊精、酵母、草粉和预混料；主要营养水平(风干基础)如下：粗蛋白质(CP)20.50%、粗脂肪(EE)4.62%、钙(Ca)1.23%、磷(P)0.91%、赖氨酸(Lys)1.30%、蛋氨酸+半胱氨酸(Met+Cys)0.68%。
1.3 试验分组与处理将40只健康雄性昆明小鼠置于室温为22~25 ℃，相对湿度为50%~70%的动物饲养室，饲养1周后，小鼠随机分为5组，即对照(normal control, NC)组、Dex组、0.25 mg/kg BA组、0.50 mg/kg BA组、1.00 mg/kg BA组，每组8只。将不同剂量的BA混悬于1%的可溶性淀粉中，每天09：00定时给药1次，按0.01 mL/g BW灌胃，NC组和Dex组小鼠灌服等量的1%可溶性淀粉，连续14 d。除NC组外，其余各组小鼠第14天17：00腹腔注射Dex(25 mg/kg BW)，诱导氧化应激模型，NC组小鼠腹腔注射等量的生理盐水。禁食15 h(自由饮水)后，眼眶采血收集血液，颈椎脱臼处死小鼠，收集肝脏、脾脏和胸腺。取适量肝脏、脾脏和胸腺，称重，生理盐水漂洗，用滤纸吸干水分后，按组织与预冷生理盐水按质量体积比1：9制成10%组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，收集上清液待测。
1.4 指标检测及方法 1.4.1 肝脏、脾脏和胸腺T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性的检测肝脏、脾脏和胸腺的T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性均按试剂盒进行操作检测。T-AOC采用化学比色法测定，抑制羟自由基能力采用Fenton反应法测定，POD活性采用比色法测定。
1.4.2 qRT-PCR检测脾脏和胸腺MAPK信号通路中相关基因的表达量 1.4.2.1 引物设计与合成根据GenBank登录号ASK1(NM_008580.4)、JNK(NM_001310452)、P38(NM_001168508.1)和β-肌动蛋白(β-actin)(NM_007393)的基因序列，按照qRT-PCR引物设计要求来设计引物。引物如下：ASK1上、下游引物分别为5′-CCTGTGTGCCACCTGAACTCTC-3′，5′-ACTAGCGTGTAATCCTCAGCCAGAA-3′；JNK上、下游引物分别为5′-TCTCCAGCACCC ATACATCAA-3′，5′-CCCTCTCATCTAACTGCTTGTCC-3′；P38上、下游引物分别为5′-CGTTCTGAGCCAGGCAAGTG-3′，5′-CAAACAGCTTGCTCCTGAAGTGA-3′；β-actin上、下游引物分别为5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，5′-ATGGAGCCACCGATCC ACA-3′。引物由广州瑞真生物技术有限公司合成。
1.4.2.2 总RNA提取、RT-PCR和qRT-PCR取0.05~0.10 g组织进行匀浆，使用Trizol法提取总RNA。用核酸紫外分析仪测定RNA样品的浓度与纯度，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量与完整性。用逆转录试剂盒合成RNA，使用SYBR Green Ⅰ荧光染色法和Rotor Gene 7300 Real-time PCR仪进行qRT-PCR。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃反应5 s与60 ℃反应30 s交替40个循环，仪器将目的基因和内参基因的溶解曲线和扩增曲线记录下来分析，保存样本的β-actin和目的基因的Ct值，采用2-△△Ct法计算mRNA表达量。
1.4.3 蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测脾脏MAPK信号通路中相关蛋白的表达量取适量组织加裂解液匀浆裂解，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品煮沸变性，用10%的SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳后将目的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用含0.2%的明胶和0.1%的TBST的封闭液封闭1 h，弃封闭液，再用封闭液稀释的ASK1、JNK、P38和β-actin抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后用稀释后的二抗37 ℃孵育1 h，洗膜后加ECL显影液在蛋白条带成像仪上进行显影，使用Bio-Rad仪器进行蛋白曝光读图，使用Image J软件测得各个条带的灰度值，将每一个目的条带的灰度值与β-actin的灰度值进行比较，以NC组蛋白的相对含量为1，试验组目的蛋白的相对含量与NC组目的蛋白的相对含量进行比较，计算出与NC组的比值。
1.5 数据分析与处理采用SPSS 17.0软件对试验结果进行数据分析，多组间平均值比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 BA对小鼠肝脏T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性的影响由表 1可见，与NC组相比，Dex组肝脏T-AOC和抑制羟自由基能力均极显著下降(P＜0.01)，肝脏POD活性有所下降，但差异不显著(P＞0.05)；与Dex组相比，0.25、0.50和1.00 mg/kg BA组肝脏T-AOC、抑制羟自由基能力以及POD活性(除0.25 mg/kg BA组POD活性)均显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。
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表 1 BA对小鼠肝脏T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性的影响 Table 1 Effects of BA on T-AOC, ability of inhibiting hydroxyl radical and POD activity in liver of mice |
由表 2可见，与NC组相比，Dex组脾脏T-AOC和抑制羟自由基能力有所下降，但差异不显著(P＞0.05)，脾脏POD活性极显著下降(P＜0.01)；与Dex组相比，0.50 mg/kg BA组脾脏T-AOC极显著升高(P＜0.01)，0.50和1.00 mg/kg BA组脾脏抑制羟自由基能力显著升高(P＜0.05)，0.25和1.00 mg/kg BA组脾脏POD活性显著升高(P＜0.05)。
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表 2 BA对小鼠脾脏T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性的影响 Table 2 Effects of BA on T-AOC, ability of inhibiting hydroxyl radical and POD activity in spleen of mice |
由表 3可见，与NC组相比，Dex组胸腺T-AOC和抑制羟自由基能力均极显著下降(P＜0.01)，胸腺POD活性显著下降(P＜0.05)；与Dex组相比，0.50和1.00 mg/kg BA组胸腺T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性均显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。
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表 3 BA对小鼠胸腺T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性的影响 Table 3 Effects of BA on T-AOC, ability of inhibiting hydroxyl radical and POD activity in thymus of mice |
由图 1可见，与NC组相比，Dex组脾脏ASK1、JNK和P38 mRNA表达量均极显著升高(P＜0.01)；与Dex组相比，0.25 mg/kg BA组脾脏ASK1 mRNA表达量显著降低(P＜0.05)，0.50和1.00 mg/kg BA组脾脏ASK1、JNK和P38 mRNA表达量均极显著降低(P＜0.01)。
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与对照组比较，#表示差异显著(P＜0.05)，##表示差异极显著(P＜0.01)；与Dex组比较，*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)。下图同。 Compared with control group, # indicated significant difference (P < 0.05), and ## indicated extremely significant difference (P < 0.01); compared with Dex group, * indicated significant difference (P < 0.05), and ** indicated extremely significant difference (P < 0.01). The same as below. 图 1 BA对小鼠脾脏ASK1、JNK和P38 mRNA表达量的影响 Figure 1 Effects of BA on mRNA expression of ASK1, JNK and P38 in spleen of mice |
由图 2可见，与NC相比，Dex组胸腺ASK1、JNK和P38 mRNA表达量均极显著升高(P＜0.01)；与Dex组相比，0.25、0.50和1.00 mg/kg BA组胸腺ASK1、JNK和P38 mRNA表达量均显著或极显著下降(P＜0.05或P＜0.01)。
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图 2 BA对小鼠胸腺ASK1、JNK和P38 mRNA表达量的影响 Figure 2 Effects of BA on mRNA expression of ASK1, JNK and P38 in thymus of mice |
由图 3可见，与NC组相比，Dex组脾脏ASK1蛋白表达量有所上升，但差异不显著(P＞0.05)，脾脏JNK和P38蛋白表达量极显著上升(P＜0.01)；与Dex组相比，0.50 mg/kg BA组脾脏ASK1蛋白表达量显著降低(P＜0.05)，0.25、0.50和1.00 mg/kg BA组脾脏JNK和P38蛋白表达量显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
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A：Western Blot检测脾脏中ASK1、JNK和P38蛋白表达量；B：脾脏中ASK1、JNK和P38蛋白条带密度柱状图。 A: the ASK1, JNK and P38 protein expression in spleen which detected by Western Blot; B: protein bands density histogram of ASK1, JNK and P38 in spleen. 图 3 Western Blot检测BA对小鼠脾脏ASK1、JNK和P38蛋白表达量的影响 Figure 3 Effects of BA on proteins expression of ASK1, JNK and P38 in spleen of mice detected by Western Blot |
T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性可以反映组织的氧化损伤程度。在本试验中，用Dex诱导氧化应激模型后，肝脏、脾脏和胸腺的T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性显著下降，说明Dex成功诱导了氧化应激模型并对小鼠造成了氧化损伤。BA是一种植物源性的抗氧化剂和免疫调节剂。前期体内试验发现，BA能有效增强小鼠免疫器官的SOD和GSH-Px活性，降低丙二醛含量，从而增强免疫器官的抗氧化能力[12]。此外BA能通过改善肝脏的氧化还原体系，增强抗氧化能力，降低脂质过氧化作用，对酒精诱导的肝损伤有预防性的保护作用[13]。在本试验研究中，BA预处理增强了肝脏和淋巴器官T-AOC、抑制羟自由基能力和POD活性，对Dex诱导的氧化损伤具有保护作用。
MAPK是所有真核生物和大部分原核生物所共有的，在细胞生物信号传导中起到非常重要的作用。MAPK通过三级激酶反应依次激活，来共同调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程。MAPK家族主要包括有JNK、P38和细胞外受体活化激酶(ERKs)等亚族，ASK1是MAPK激酶激酶(MAPKKK)家族成员之一，在生理状态下，ASK1与硫氧还蛋白(Trx)结合而不具有激活活性。在氧化应激状态下，ROS直接激活ASK1或者使Trx形成二聚体与ASK1分离而激活ASK1，激活的ASK1磷酸化活化MAPK激酶(MAPKK)中MKK4/MKK7-JNK和MKK3/MKK6-P38，JNK和P38被激活后由细胞质转移至细胞核，促进相关基因转录、表达，同时JNK与P38还磷酸化激活MAPK、PK2与PK3，活化低分子质量的热休克蛋白，最终激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)级联反应，从而导致细胞凋亡[14-17]。因此，在本研究中，我们通过检测JNK-P38 MAPK信号通路中相关基因和蛋白的表达来研究BA对Dex诱导的氧化损伤的分子机制。
有研究报道，Dex主要通过激活JNK或P38 MAPK信号通路来诱导肉仔鸡胸肌骨骼肌卫星细胞的氧化应激[18]。与本研究相似，Dex导致小鼠淋巴器官的ASK1、JNK和P38 mRNA和蛋白表达量上升。说明Dex能通过JNK或P38信号通路诱导淋巴细胞氧化应激。Zheng等[19]报道，BA对D-半乳糖胺/脂多糖(LPS)诱导的肝损伤有保护作用，其保护机制主要是提高谷胱甘肽的表达，抑制脂质过氧化，促进B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因的表达，通过线粒体依赖性机制抑制JNK和ERK的磷酸化。Szuster-Ciesielska等[16]报道，BA作为抗氧化剂，对酒精引起肝星状细胞ROS的产生具有明显的抑制作用，并通过下调JNK信号通路，减少氧化损伤，从而提高肝星状细胞的活性。在本试验中，BA预处理后，淋巴器官ASK1、JNK和P38 mRNA和蛋白表达量下降，说明BA可以通过抑制JNK-P38 MAPK信号通路缓解Dex对淋巴细胞的氧化损伤。
4 结论BA对Dex致淋巴细胞氧化损伤有保护作用，并且这种保护作用与JNK-P38 MAPK信号通路有关。
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