沙葱(Allium mongolicum Regel)是百合科葱属植物，又名“蒙古韭”，主要分布于我国西北部和内蒙古中西部地区，是一种营养物质种类丰富和含量较高的优质牧草。沙葱及其提取物对动物机体具有良好的抗氧化活性和免疫调节功能。黄酮类化合物是沙葱脂溶性提取物的主要活性成分之一，对机体的免疫应答发挥着非常重要的作用。赵春艳等[1]报道，沙葱黄酮可通过提高小鼠的免疫器官指数、血液及肝脏的酸性磷酸酶和溶菌酶活性、碳廓清指数、吞噬系数，进而增强机体非特异性免疫机能。体外研究也表明，沙葱异黄酮具有一定的清除氧自由基的能力[2]。沙葱黄酮能够通过促进绵羊外周血淋巴细胞的增殖，上调白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFNγ)基因的表达，下调白细胞介素-4(IL-4)基因的表达，从而增强机体的免疫调节作用[3]。
抗菌肽是一类小分子肽，广泛分布在动植物体内，是哺乳动物抵抗外来抗原物质入侵而启动的第1道先天性免疫防线[4]。β-防御素是主要由上皮细胞产生的富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，由6~8个半胱氨酸残基组成，半胱氨酸之间由3~4个二硫键连接，其分子构象稳定，在动物呼吸道和消化道等上皮组织中发挥着重要的免疫调节作用[5-6]。β-防御素相比抗生素具有分子质量小、热稳定性高、水溶性好和不易产生耐药性等诸多优点[7-8]。通过提高β-防御素的表达来增强肠道免疫功能，是控制和预防肠道疾病的新策略，所以，对β-防御素进行研究对畜禽疾病预防和治疗、养殖业的健康发展和畜产品的安全生产都有重大意义。大量研究表明，在舍饲肉羊的饲粮中添加沙葱黄酮能够增强其非特异性免疫机能，降低发病率，加快生长速度[9-12]。目前已经阐明了沙葱黄酮的提取工艺、组成、结构及其相关免疫活性，但其对舍饲肉羊生产性能及其肠道组织中免疫因子β-防御素-1(sBD-1)和β-防御素-2(sBD-2)基因表达的影响却鲜见报道。因此，本试验在肉羊饲粮中添加不同水平的沙葱黄酮，探究沙葱黄酮对肉羊生产性能及肠道组织免疫因子β-防御素(sBD-1、sBD-2)基因表达的影响，以期为沙葱黄酮在肉羊饲养中的进一步应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料Elx800多功能酶标仪(BioTek H4，美国)、荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)、梯度PCR仪(Veriti Thermal Cycler 4375786，美国)、高压灭菌锅(Panasonic MLS-375，日本)、电热鼓风干燥箱(CiMo DHG-9073BS-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司)、-20 ℃冰箱(DW-40W255，青岛海尔股份有限公司)、-80 ℃超低温冰箱(Thermo Forma-8600，美国)、移液器(Eppendof Research Plus，德国)、低温高速离心机(Sigma 3K30，德国)、迷你离心机(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)、液氮罐(YDS-10B，东亚机电工贸有限公司)等。
1.2 试验设计选取60只健康、体重[(39.9±3.2) kg]相近的6月龄小尾寒羊羯羊，采用单因素完全随机试验设计，共分为4组，每组15只。对照组试验羊饲喂基础饲粮，试验组试验羊分别饲喂在基础饲粮中添加11(低浓度黄酮组)、22(中浓度黄酮组)和33 mg/kg沙葱黄酮(高浓度黄酮组)的试验饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
沙葱采自内蒙古自治区阿拉善盟阿拉善左旗，为大棚种植。试验所用沙葱黄酮由本实验室依据萨茹丽等[13]报道的方法制备。
1.4 饲养管理试验开始前1周对羊舍进行统一消毒处理，试验期共75 d，其中预试期15 d、正试期60 d。试验羊分群饲养，自由饮水。正试期每天分别在07:00和18:00饲喂1次，每次采食时间持续1.5 h，在每天的08:30和19:30收集剩料。试验期间各组饲养方式、管理模式及环境条件一致。
1.5 生产性能指标的测定正试期内收集剩料称重并记录，计算每组试验羊每天的实际采食量，计算平均日采食量。在试验第1、15、30、45、60天晨饲前空腹称重，根据采食量和体重的变化来计算肉羊的平均日增重和料重比，计算公式如下：
平均日增重(g/d)=总增重(g)/试验天数(d)；
料重比=平均日采食量(g)/平均日增重(g)。
1.6 肠道组织样品采集及sBD-1、sBD-2基因相对表达量的测定在试验第60天，每组中随机选取3只羊，经检疫合格后进行屠宰，快速采集十二指肠、空肠、回肠组织样包入预先准备好的纱布中，迅速放入液氮，冷冻后将样品转移到-80 ℃超低温冰箱中保存待测。提取样品总RNA，用分光光度计和凝胶电泳测定提取的总RNA的纯度及完整性。cDNA的合成按照试剂盒(RR047A，TaKaRa)说明书进行操作。本试验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，引物由华大基因股份公司设计合成，扩增条件：第1步，95 ℃，30 s，共1个循环。第2步，95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，共40个循环。第3步，95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；95 ℃，30 s，共1个循环。引物序列及参数见表 2。
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表 2 引物序列及参数 Table 2 Primer sequences and parameters |
利用Excel 2007软件进行数据整理，采用SAS 9.0软件的one way-ANOVA程序进行单因素方差分析，以“平均值±标准误”表示试验结果，P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 沙葱黄酮对肉羊平均日采食量的影响从表 3可以看出，试验第1~15天，各组肉羊的平均日采食量与对照组相比无显著差异(P>0.05)；试验第15~30天，以黄酮高浓度组肉羊的平均日采食量最高，显著高于对照组和其他试验组(P < 0.05)，黄酮低浓度组肉羊的平均日采食量显著低于对照组和其他试验组(P < 0.05)；试验第30~45天以及第45~60天，各试验组肉羊的平均日采食量均显著高于对照组(P < 0.05)，其中以高浓度黄酮组肉羊的平均日采食量最高。
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表 3 沙葱黄酮对肉羊平均日采食量的影响 Table 3 Effects of Allium mongolicum Regel flavonoids on average daily feed intake of meat sheep |
从表 4可以看出，各组试验羊在的初始体重基本接近(P>0.05)，相差不超过1.06%。试验第1~15天，对照组与各试验组肉羊的平均日增重差异不显著(P>0.05)；试验第15~30天，各试验组肉羊的平均日增重显著高于对照组(P < 0.05)，其中中浓度黄酮组肉羊的平均日增重在数值上高于其他2个试验组，但差异不显著(P>0.05)；试验第30~45天，与对照组相比，饲粮中添加黄酮提高了肉羊的平均日增重，其中，高浓度黄酮组肉羊的平均日增重显著高于对照组(P < 0.05)，中浓度黄酮组和低浓度黄酮组有高于对照组的趋势，但差异不显著(P>0.05)；试验第45~60天，与对照组相比，各试验组肉羊的平均日增重显著提高(P < 0.05)，其中以中浓度黄酮组肉羊的平均日增重最高。
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表 4 沙葱黄酮对肉羊平均日增重的影响 Table 4 Effects of Allium mongolicum Regel flavonoids on average daily gain of meat sheep |
从表 5可以看出，试验第1~15天，各组肉羊的料重比相近，无显著差异(P>0.05)；试验第15~30天，与对照组相比，各试验组肉羊的料重比显著降低(P < 0.05)，且高浓度黄酮组肉羊的料重比显著高于低浓度黄酮组和中浓度黄酮组(P < 0.05)；试验第30~45天，以对照组肉羊的料重比最高，显著高于各试验组(P < 0.05)，且中浓度黄酮组肉羊的料重比显著低于低浓度黄酮组和高浓度黄酮组(P < 0.05)；试验第45~60天，与对照组相比，各试验组肉羊的料重比显著降低(P < 0.05)，且高浓度黄酮组肉羊的料重比显著低于低浓度黄酮组(P < 0.05)，并有低于中浓度黄酮组的趋势，但差异不显著(P>0.05)。
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表 5 沙葱黄酮对肉羊料重比的影响 Table 5 Effects of Allium mongolicum Regel flavonoids on feed to gain ratio of meat sheep |
由表 6可知，高浓度黄酮组空肠和回肠中sBD-1基因的相对表达量显著高于对照组及其他试验组(P < 0.05)，高浓度黄酮组十二指肠中sBD-1基因的相对表达量与对照组相比无显著差异(P>0.05)；中浓度黄酮组空肠、回肠和十二指肠中和低浓度黄酮组十二指肠和回肠中sBD-1基因的相对表达量显著低于对照组(P < 0.05)，低浓度黄酮组空肠中sBD-1基因的相对表达量与对照组相比无显著差异(P>0.05)。
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表 6 沙葱黄酮对肉羊不同肠道组织中sBD-1、sBD-2基因相对表达量的影响 Table 6 Effects of Allium mongolicum Regel flavonoids on relative expression levels of sBD-1 and sBD-2 genes in different intestinal tissues of meat sheep |
由表 6可知，中浓度黄酮组十二指肠中sBD-2基因的相对表达量较对照组显著提高(P < 0.05)。低浓度黄酮组十二指肠中sBD-2基因的相对表达量在数值上高于对照组，但差异不显著(P>0.05)，高浓度黄酮组十二指肠中sBD-2基因的相对表达量显著低于对照组(P < 0.05)；高浓度黄酮组和中浓度黄酮组空肠中sBD-2基因的相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)，且高浓度黄酮组空肠中sBD-2基因的相对表达量还显著高于中浓度黄酮组(P < 0.05)；低浓度黄酮组空肠中以及各试验组回肠中sBD-2基因的相对表达量与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
3 讨论 3.1 沙葱黄酮对肉羊生产性能的影响饲料成本是决定动物养殖经济效益的一个重要因素。如何提高畜禽的日增重以及降低料重比是养殖领域面临的重大挑战。本试验的结果表明，饲粮中添加沙葱黄酮后，在试验第1~15天，对照组肉羊的平均日增重与各试验组间无显著差异，从第15天开始，沙葱黄酮的促生长作用开始明显增强，且到试验第45~60天时，沙葱黄酮的促生长作用达到最佳，各试验组肉羊的平均日增重均较对照组显著增加，这说明沙葱黄酮对肉羊促生长效应的发挥需要一定的时间，即具有一定的时间依赖性。本试验结果显示舍饲肉羊饲粮中沙葱黄酮的添加量在22~33 mg/kg时平均日增重较高，说明在该添加范量围内，沙葱黄酮对肉羊的生产性能有显著的促进作用。本试验还结果显示，沙葱黄酮的添加量在22~33 mg/kg时，在试验第45~60天时肉羊的料重比最低，说明饲料报酬达到最高。
3.2 沙葱黄酮对肉羊肠道免疫的影响肠道屏障是先天免疫系统的重要组成部分，是机体面对外源抗原和毒素的第1道屏障[14]。为抵抗外源微生物入侵，淋巴细胞迁移到上皮表面，与此同时，肠道细胞还会产生免疫球蛋白和细胞因子等至黏膜表面以保护和修复小肠屏障[15]。研究表明，动物肠道细胞能够产生内源免疫防御因子，它们具有广泛的抑菌和杀菌作用，能够抵抗细菌、真菌甚至病毒的入侵；另外，它们还能够通过趋化并活化免疫细胞来调控哺乳动物的免疫机能[16]，因此本试验选取十二指肠、回肠和空肠3个部位来研究沙葱黄酮对肉羊肠道组织免疫因子(sBD-1、sBD-2)基因表达的影响。黄酮类化合物是沙葱的主要的活性物质之一，对机体的免疫应答发挥着非常重要的作用。前人研究以小鼠为试验对象，发现饲粮中添加0~80 μg/mL的竹叶黄酮可促进脾细胞IFNγ基因的表达，促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖与分化，进而显著提高小鼠的免疫功能[17]。尹香花等[18]以患有子宫内膜癌的小鼠模型为研究对象，发现大豆苷原和染料木黄酮能够通过调控肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-α(IL-1α)及白细胞介素-6(IL-6)基因的表达，进而提高机体的免疫功能。研究表明，在肉羊饲粮中添加11~33 mg/kg沙葱黄酮后可上调白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-4(IL-4)、IL-6及TNF-α基因的表达[11]。本试验结果表明，饲喂添加适量沙葱黄酮的饲粮后，肉羊空肠和回肠中sBD-1基因以及在空肠和十二指肠中sBD-2基因的相对表达量显著提高，这与前人研究结果相吻合。β-防御素作为肠道细胞产生的内源小分子抗菌肽，发挥着重要的抗菌和免疫调节作用，沙葱黄酮能够通过上调β-防御素基因的表达来增强肉羊非特异性免疫机能，促进机体生长，但其具体机制有待进一步研究。
沙葱作为一种营养物质种类丰富和含量较高的优质牧草，对机体维持最佳免疫状态发挥着重要的作用，在免疫器官和分子水平上以基因转录和蛋白质翻译等多种方式对免疫功能进行调节[19]。动物自身的营养水平、所处环境、内分泌系统及应激等因素都会影响其免疫功能。饲粮中蛋白质、脂肪、维生素等营养素的水平对动物免疫功能及状态起着非常重要的作用，营养素缺乏或营养水平降低时容易引起免疫疾病或病菌入侵[20]。免疫系统也可以通过中枢神经系统来调控动物的采食量及其行为，进而影响动物的生长及营养代谢。这些影响动物生长的因素并不是单独影响动物机体，而是具有相互影响的关系，动物的平均日采食量影响平均日增重，平均日增重、平均日采食量共同影响料重比。动物机体免疫力影响动物的健康状态，也直接影响动物的生长性能。本试验结果表明，在肉羊饲粮中添加22~33 mg/kg的沙葱黄酮能够显著提高免疫因子β-防御素(sBD-1和sBD-2)基因的表达，能够更有效地改善肉羊回肠、空肠和十二指肠的免疫机能，进而提高肉羊的采食量和日增重，降低料重比。目前，大规模、高密度、集约化的养殖方式，以及强调发挥最大生产性能的遗传改良等过于追求提高动物生产效率的生产方式，使动物生产性能受饲养环境影响越发敏感，细微的环境变化都会使动物发生应激反应。如较差的卫生条件会直接影响动物的生产性能，无论动物是否表现出临床症状，生长发育都会受阻。免疫因子主要通过影响神经-内分泌系统及免疫系统改变营养物质代谢分配从而影响动物生产性能[21]。因此，能否通过营养调控的方式来减轻或消除免疫应激对动物的影响成为值得研究的一个方向，其具体机制仍有待进一步研究。
4 结论① 饲粮中添加11~33 mg/kg的沙葱黄酮均可显著提高肉羊的平均日采食量和平均日增重，并显著降低料重比，从而提高生产性能。
② 饲粮中添加22~33 mg/kg的沙葱黄酮可显著提高肉羊肠道免疫因子β-防御素(sBD-1、sBD-2)基因的相对表达量。
③ 综上所述，饲粮中添加22~33 mg/kg的沙葱黄酮可提高肉羊的生产性能，同时还可改善其十二指肠、空肠和回肠的免疫机能。
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