在仔猪生产中，为了防病治病，抗生素作用功不可没。但抗生素在仔猪养殖中的大量和广泛使用，甚至滥用，给人类带来了严重的不良后果。抗生素的不科学应用会使病原菌产生耐药性，并造成药物残留及污染环境等问题，甚至诱发人和动物的癌症和畸变，危害人类的健康和安全[1-2]。因此，研究或寻找新的抗生素替代品、发展绿色畜牧业、生产绿色动物食品已成为国内外动物营养领域的研究热点之一。益生菌是一类含有活菌的生物制剂，因其具有安全可靠、无残留、无抗药性、不污染环境等优点而倍受关注[3]。益生菌可以通过分泌的有机酸、细菌素、维生素、消化酶等代谢产物来降低肠道的pH，抑制有害菌生长，优化肠道的菌群结构，刺激动物肠道黏膜免疫，提高动物机体对疾病的抵抗能力，从而达到提高动物生长性能的目的。屎肠球菌(Enterococcus faecium)属于乳酸杆菌属，是哺乳动物胃肠内正常的有益菌，具有在动物肠道内产生有机酸、细菌素和过氧化氢(H2O2)等[4]优良的生物学特性；屎肠球菌还可促进消化酶的分泌[5]，改善蛋白质、脂肪和能量的代谢，提高饲料转化率[6]；并且能与致病菌竞争，抑制有害菌的繁殖[7]；改善肠道内环境，调整胃肠道菌群平衡[8]；增强抗氧化能力[9]；提高机体免疫力[10]。屎肠球菌在断奶仔猪上的应用研究还较少，对抗氧化的研究也主要集中在对血清和体外培养的细胞抗氧化水平的研究上[11-13]。因此，本试验主要在断奶仔猪的基础饲粮中添加不同水平的屎肠球菌SF68，探讨屎肠球菌SF68对断奶仔猪生长性能、血常规和血清生化指标及抗氧化性能的影响，为其在仔猪生产中科学应用提供部分参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料屎肠球菌SF68(NCMIB10415)由滨海普润生物科技有限公司提供，有效含量为1.0×1010 CFU/g。
1.2 试验设计与饲养管理试验选用21日龄体重[(6.57±0.08) kg]相近的“杜洛克×长白猪×大约克”三元杂交断奶仔猪，随机分为5个组，每组3个重复，每个重复6头猪，公母各占1/2。对照组(CON组)饲喂基础饲粮，抗生素组(ANT组)在基础饲粮中添加0.007 5%的金霉素和0.02%的抗敌素(金霉素有效含量为15%，抗敌素有效含量为10%)，抗生素+低剂量屎肠球菌组(ALEF组)在基础饲粮中添加0.007 5%的金霉素、0.02%的抗敌素和0.01%屎肠球菌SF68，低剂量屎肠球菌组(LEF组)和高剂量屎肠球菌组(HEF组)分别在基础饲粮中添加0.01%和0.05%的屎肠球菌SF68。基础饲粮为参照NRC(2012)猪营养需要配制的粉状配合饲料，基础饲粮组成及营养水平见表 1。试验期21 d。试验在苏州市太仓金诸种猪场进行，试验过程中猪自由采食和饮水，防疫消毒程序按猪场管理规定执行。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
分别在试验开始日(21日龄)、试验结束日(42日龄)空腹12 h情况下对仔猪逐只称重，记录初重、末重，计算平均日增重(ADG)；每天以重复为单位记录饲料消耗量，计算平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)。
1.3.2 腹泻指数每天14:00逐只观察仔猪腹泻情况，按干、软、稀、水样分成0、1、2、3级来记录粪便情况，腹泻指数评分标准见表 2。同时结合精神状态、圏内粪便情况、肛门情况(肛门处有无粪便污染或红肿)判断记录腹泻仔猪头数和持续时间，计算腹泻指数：
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表 2 腹泻指数评分标准 Table 2 Scoring standard of diarrhea index |
腹泻指数=腹泻评分之和/试验猪总头数。
1.3.3 血常规、血清生化及血清、肝脏、空肠和回肠抗氧化指标试验结束时从每组的每个重复中随机选取2头猪共30头进行屠宰，前腔静脉采血，分离血清，测定血常规、血清生化、抗氧化指标。仔猪屠宰后迅速剪取肝脏样品，刮取空肠和回肠黏膜，液氮临时冻存，然后-80 ℃保存，待测抗氧化指标。
血常规指标使用全自动五分类血液细胞分析仪进行测定，血清生化指标使用全自动生化分析仪进行测定。血清、肝脏、空肠、回肠中的还原型谷胱甘肽(GSH)、H2O2、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及总抗氧化能力(T-AOC)，均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定；并采用上海碧云天生物技术有限公司提供的试剂盒测定血清、肝脏、空肠和回肠中蛋白质浓度，以蛋白质浓度来标定上述抗氧化指标。
1.4 数据处理与统计分析试验数据用Excel 2013进行整理，用平均值±标准误(mean±SE)表示，采用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用one-way ANOVA程序进行方差分析，LSD法进行多重比较，以P < 0.05作为差异显著标准，以P < 0.01作为差异极显著标准。
2 结果 2.1 屎肠球菌SF68对断奶仔猪生长性能和腹泻指数的影响由表 3可知，各组之间断奶仔猪的ADG、ADFI、F/G和腹泻指数均无显著差异(P>0.05)。ALEF组、LEF组、HEF组断奶仔猪的ADG相比于CON组分别提高了18.40%、4.59%、10.12%，ALEF组、LEF组断奶仔猪的ADFI相比于CON组分别提高了8.74%、0.55%，ALEF组、LEF组、HEF组断奶仔猪的F/G相比于CON组分别降低了12.29%、7.82%、14.52%。ALEF组腹泻指数相比CON组降低了65%，LEF组腹泻指数相比于CON组降低了67%。
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表 3 屎肠球菌SF68对断奶仔猪生长性能和腹泻指数的影响 Table 3 Effects of Enterococcus faecium SF68 on growth performance and diarrhea index of weaned piglets |
由表 4可知，LEF组血液中平均血红蛋白含量最高，显著高于其他各组(P < 0.05)。LEF组血液中平均红细胞体积最高，显著高于CON组、ANT组和ALEF组(P < 0.05)。LEF组血液中淋巴细胞百分比最高，极显著高于CON组(P < 0.01)。各组之间其他血常规指标无显著差异(P>0.05)。
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表 4 屎肠球菌SF68对断奶仔猪血常规指标的影响 Table 4 Effects of Enterococcus faecium SF68 on blood routine indexes of weaned piglets |
由表 5可知，ALEF组血清中总胆汁酸含量最低，显著低于HEF组(P < 0.05)；ALEF组血清中乳酸脱氢酶(LDH)活性最高，显著高于HEF组(P < 0.05)；LEF组血清中胆碱酯酶(CHE)活性最高，显著高于CON组和HEF组(P < 0.05)。各组之间其他血清生化指标无显著差异(P>0.05)。
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表 5 屎肠球菌SF68对断奶仔猪血清生化指标的影响 Table 5 Effects of Enterococcus faecium SF68 on serum biochemical indexes of weaned piglets |
由表 6可知，ALEF组、LEF组血清中H2O2含量显著或极显著高于CON组、ANT组和HEF组(P < 0.05或P < 0.01)，HEF组血清中CAT活性极显著低于CON组、ANT组、ALEF组和LEF组(P < 0.01)。各组之间其他血清抗氧化指标无显著差异(P>0.05)。
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表 6 屎肠球菌SF68对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响 Table 6 Effects of Enterococcus faecium SF68 on serum antioxidant indexes of weaned piglets |
由表 7可知，LEF组肝脏中H2O2含量显著低于ANT组、ALEF组和HEF组(P < 0.05)，LEF组肝脏中H2O2含量极显著低于CON组(P < 0.01)；ANT组肝脏中CAT活性极显著高于其他各组(P < 0.01)；ANT组、ALEF组和HEF组肝脏中SOD活性显著高于CON组(P < 0.05)；ALEF组和LEF组肝脏中T-AOC显著高于CON组(P < 0.05)，HEF组肝脏中T-AOC极显著高于其他各组(P < 0.01)。各组之间其他肝脏抗氧化指标无显著差异(P>0.05)。
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表 7 屎肠球菌SF68对断奶仔猪肝脏抗氧化指标的影响 Table 7 Effects of Enterococcus faecium SF68 on liver antioxidant indexes of weaned piglets |
由表 8可知，ANT组、ALEF组、LEF组和HEF组空肠中H2O2含量显著或极显著低于CON组(P < 0.05或P < 0.01)，ANT组空肠中MDA含量显著低于其他各组(P < 0.05)，ALEF组空肠中SOD活性显著高于ANT组、LEF组和HEF组(P < 0.05)。各组之间其他空肠抗氧化指标无显著差异(P>0.05)。
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表 8 屎肠球菌SF68对断奶仔猪空肠抗氧化指标的影响 Table 8 Effects of Enterococcus faecium SF68 on jejunum antioxidant indexes of weaned piglets |
由表 9可知，HEF组回肠中GSH含量显著或极显著高于其他各组(P < 0.05或P < 0.01)，ANT组、LEF组回肠中GSH含量显著高于ALEF组(P < 0.05)；CON组回肠中MDA含量显著或极显著高于其他各组(P < 0.05或P < 0.01)；ANT组回肠中SOD活性显著高于CON组(P < 0.05)，ALEF组、LEF组、HEF组回肠中SOD活性极显著高于CON组(P < 0.01)，HEF组回肠中SOD活性极显著高于其他各组(P < 0.01)。各组之间其他回肠抗氧化指标无显著差异(P>0.05)。
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表 9 屎肠球菌SF68对断奶仔猪回肠抗氧化指标的影响 Table 9 Effect of Enterococcus faecium SF68 on ileum antioxidant indexes of weaned piglets |
断奶是仔猪生产环节中一个关键的过渡时期。由于饲料营养成分、形态及生理状态的改变，必然会给断奶仔猪生长发育造成一系列不良影响，主要表现在消化不良、生长缓慢、抵抗力下降，并引发仔猪腹泻。
屎肠球菌在畜禽上主要用来调节肠道微生物菌群平衡，从而减少腹泻和促进生长[14]。Zeyner等[15]研究发现，口服屎肠球菌SF68能够显著减少哺乳期仔猪的腹泻率，并增加ADG。Giang等[16]研究表明，添加含有屎肠球菌的复合乳酸菌制剂能够显著增加断奶仔猪断奶后1~2周生长阶段的ADG、ADFI和饲料转化率(FCR)，但对断奶后3~5周生长阶段的ADG、ADFI和FCR无显著影响。Huang等[17]的研究发现，复合乳酸杆菌能够降低仔猪腹泻率和腹泻指数。Mallo等[18]研究发现，屎肠球菌CECT4515可有效增加断奶仔猪回肠、盲肠中的乳酸杆菌数量，减少大肠杆菌数量，从而降低腹泻率。本研究也得到相似的结果，屎肠球菌SF68具有促进仔猪生长并减少断奶仔猪腹泻的作用。但屎肠球菌SF68的这种作用效果并不显著，可能是由于屎肠球菌SF68对仔猪的作用效果主要体现在断奶后前2周，从断奶后第3周开始这种作用效果开始减弱。这和Giang等[16]的研究结果相似。腹泻指数在LEF组降至最低，HEF组腹泻指数有所升高，这可能是由于屎肠球菌SF68添加水平太大，在一定程度上扰乱了肠道微生物区系的平衡；但HEF组F/G并未因此而升高，通过查看原始数据得知，HEF组屎肠球菌SF68导致的腹泻率升高的原因主要集中在2头仔猪上，而HEF组共18头仔猪，说明屎肠球菌SF68可能只是引起个别猪只的腹泻，但从整体水平来看，饲粮添加屎肠球菌SF68对断奶仔猪腹泻是有缓解作用的。ALEF组相比于CON组能够有效降低断奶仔猪的腹泻指数，且效果优于ANT组，而促生长效果和ANT组相近，可能是由于饲粮添加屎肠球菌SF68能够减轻抗生素对断奶仔猪的不利影响。
3.2 屎肠球菌SF68对断奶仔猪血常规指标的影响血液是动物体内环境重要的组成部分，血液中生理生化指标的改变可以反映动物机体或器官的代谢和健康状况。血液中血红蛋白含量与机体抵抗力相关，且会随着机体健康状态的改变而改变[19]。血红蛋白是体内运载氧气和二氧化碳的主要载体，更高的血红蛋白浓度有利于氧的转运、新陈代谢能力的增强以及免疫功能的提升。血液中的淋巴细胞分为T淋巴细胞和B淋巴细胞，既参与细胞免疫又参与体液免疫，当有不良物质侵入时起到保护机体的作用。益生菌具有免疫刺激作用，从而影响免疫系统和宿主的健康。从本次试验的数据来看，LEF组血液中平均血红蛋白含量最高，且显著高于其他各组；LEF组血液中淋巴细胞比例最高，显著高于CON组；所以基础饲粮中添加低剂量屎肠球菌SF68有助机体代谢并可增强机体抵抗力，对断奶仔猪有益。
3.3 屎肠球菌SF68对断奶仔猪血清生化指标的影响血清总胆汁酸是胆固醇经肝组织代谢的最终产物，它的生成和代谢与肝脏有着十分密切的关系，健康动物血清中总胆汁酸含量较低且恒定，当肝细胞受损或胆道阻塞时会引起胆汁酸代谢障碍，含量升高[20]。本试验结果表明，ALEF组血清中总胆汁酸含量最低，且显著低于HEF组，说明在基础饲粮中添加抗生素+低剂量屎肠球菌SF68可能对肝脏具有一定的保护作用；LDH存在于机体各组织器官中，是参与糖酵解的一种重要的酶，与血清葡萄糖含量一样，血清中LDH活性是反映动物机体糖代谢的重要指标。本试验结果表明，ALEF组血清中LDH活性最高，且显著高于HEF组，说明基础饲粮中添加抗生素+低剂量屎肠球菌SF68可以增强机体糖代谢能力，且效果优于其他各组；CHE是肝细胞在血液中释放的一种生物酶，血清CHE活性是肝细胞损伤的敏感指标，是评估肝脏的合成和储备功能的重要指标[21]。若肝脏细胞出现大量死亡现象，则CHE活性降低，本试验中，LEF组血清中CHE活性最高，且显著高于CON组。
3.4 屎肠球菌SF68对断奶仔猪抗氧化性能的影响氧化还原反应是机体重要的生理生化反应，在这一过程中会产生大量的自由基等活性分子。适量的自由基对维持机体正常生理功能有着重要的作用，它可以促进甲状腺激素的合成，刺激吞噬细胞杀菌作用，而且可以调节信号的传导。但是，过量的自由基对重大的生物大分子如蛋白质、糖类、脂肪、核酸等具有极强的亲和能力，它会使这些大分子发生交联、断裂或者结构变化，导致机体正常的生理功能紊乱。由过量的自由基刺激产生的氧化损伤，被称作氧化应激。当人与动物长期处于应激状态时，就会引起一系列的疾病，如人的糖尿病、心血管病、炎症等[22]；对断奶仔猪的危害主要有降低了仔猪的生长性能、抗氧化性能和免疫力。
在动物机体中存在着抗氧化小分子、抗氧化大分子和酶等多种抗氧化物，用以清除动物体内氧化还原反应过程中所产生的各种活性氧，来阻止活性氧所诱导的氧化应激的产生。而SOD、CAT、GSH、GSH-Px、维生素E(生育酚和生育三烯酚)、维生素C是机体先天的保护性抗氧化机制的重要组成部分[17]。本试验中，ALEF组和LEF组血清中H2O2含量显著高于CON组，肝脏、空肠和回肠中H2O2含量低于CON组，说明ALEF组和LEF组可能处于一个较高的抗氧化水平阶段。GSH是GSH-Px和谷胱甘肽转移酶(GST)2种酶的底物，因此GSH为2种酶分解过氧化物免受氧化损伤所必需的。本试验数据显示，ALEF组和LEF组的血清和空肠、ALEF组的肝脏、LEF组和HEF组的回肠中GSH含量较高；ALEF组和ANT组的血清、ALEF组和LEF组的肝脏、LEF组和CON组的空肠、ALEF组和LEF组的回肠中GSH-Px活性较高，表明血清、肝脏、空肠和回肠中GSH含量和GSH-Px活性较高的仔猪主要集中在ALEF组和LEF组中，因此我们得出在基础饲粮中添加低剂量的屎肠球菌SF68能更好地提高GSH含量，从而为GSH-Px提供更多的底物来减少过氧化物对细胞的氧化损伤。当动物机体发生氧化应激反应时，会发生脂质过氧化，MDA是生物体脂质过氧化的重要产物之一，有较强的生物毒性，因此试验中可以通过检测机体MDA的含量来反映脂质的过氧化程度，从而间接反映细胞的损伤程度。SOD是动物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种动物的体内。SOD具有特殊的生理活性，是动物体内清除自由基的首要物质。它可以对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。MDA的测定往往与SOD的测定相配合，SOD活性可间接反映机体清除氧自由基的能力，而MDA含量的高低又间接反映机体细胞受自由基损害的严重程度。综合肝脏、空肠和回肠中MDA含量和SOD活性来看，添加低剂量的屎肠球菌SF68可减少自由基和体内脂质的过氧化，并且抗生素和低剂量屎肠球菌SF68混合使用效果更好；CAT是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，其生物学功能就是催化细胞内的H2O2分解，进而防止过氧化。CAT在机体不同组织中其活性高低不同，肝脏中CAT活性较高。本试验结果表明，LEF组空肠和回肠中CAT活性较高，且HEF组血清CAT活性最低；而在肝脏中，ANT组CAT活性较高。这说明在肠道抗氧化防御系统中，低剂量的屎肠球菌SF68所发挥的抗氧化作用较大。机体内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶类总的抗氧化水平即体现了机体内的T-AOC。从肝脏、空肠和回肠中T-AOC来看，ALEF组和LEF组T-AOC较强，对肠道和肝脏的保护作用较好。综上所述，饲粮中添加低剂量的屎肠球菌SF68对减少断奶仔猪抗氧化应激效果较好。
4 结论① 饲粮添加低剂量的屎肠球菌SF68可降低断奶仔猪腹泻指数和F/G，且LEF组和ALEF组效果相似。
② 饲粮中添加低剂量的屎肠球菌SF68可以提高血液中平均血红蛋白含量和淋巴细胞百分比，有利于机体氧的运输、新陈代谢能力的增强以及免疫性能的提高。
③ 饲粮中添加抗生素+低剂量屎肠球菌SF68可降低血清中总胆汁酸含量，提高血清中LDH活性，对肝脏有一定保护作用，并且能增强机体的糖代谢水平。
④ 饲粮中添加低剂量的屎肠球菌SF68可提高血清中CHE活性，增强肝脏的合成和储存功能。
⑤ 饲粮中添加低剂量的屎肠球菌SF68可提高断奶仔猪血清、肝脏以及回肠的GSH含量和GSH-Px活性，并降低肝脏、空肠和回肠H2O2含量以及回肠中MDA含量。
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