硒(Se)是许多动物体内必需的营养物质[1]。我国的《饲料添加剂品种目录(2013)》中将亚硒酸钠和酵母硒作为矿物元素饲料添加剂用于养殖动物补硒剂。亚硒酸钠作为硒添加剂，来源丰富，价格较低，但是存在生物有效性低、中毒量与需要量之间范围小、毒性大、易污染环境等缺陷，因而被严格限制其使用量。欧盟等一些国家和地区已经限制或禁止使用亚硒酸钠作为硒的营养补充剂，例如瑞典已限制其在乳猪料中使用。而日本则禁止在动物饲料中添加亚硒酸钠。因此，目前呈现出其他形式硒逐渐取代亚硒酸钠在饲料中添加的趋势。天然存在的硒主要有硒醚、单质硒、硒酸盐、亚硒酸盐和有机硒几种形式[2-3]。亚硒酸盐和硒酸盐的中毒量与需要量范围很窄，而单质硒被认为既无毒也无生物活性[4-6]。然而，粒径在20~350 nm的红色纳米单质硒颗粒由于其突出的安全性和生物活性引起了越来越多的关注[5-6]。许多研究表明，一些细菌可以通过将亚硒酸钠还原成为红色纳米单质硒从而有效地降低毒性[7-9]，与此同时，纳米单质硒分散在细菌分泌的蛋白质或者多糖表面上，又显著提高了富硒蛋白多糖产品的抗氧化活性等功能[10]。在本研究前期工作中，对产多糖菌种进行耐硒驯化得到产多糖耐硒阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的细菌菌株Z0206，并运用形态学、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析相结合的方法鉴定其为Enterobacter cloacae。Enterobacter cloacae Z0206能耐受高浓度的亚硒酸钠并可产生大量的胞外蛋白多糖，在小鼠和家禽上的应用发现其具有较强的抗氧化和免疫功能[11-13]。最近的研究发现部分硒为零价并具备纳米粒子的大小，判断为纳米单质硒[14]，本研究将着眼于定量分析纳米单质硒。
目前常规测定零价硒的技术手段是敞口湿法消解、微波辅助密闭消解[15-16]，文献报道的方法一般是通过向试样中加入强氧化剂[如硝酸(HNO3)或高氯酸(HClO4)]或者混合酸反复加热回流或者微波消解。如国家标准(GB/T 13883—2008)对于饲料中硒的测定方法中在对试样的前处理上，是先将试样在混合酸(HNO3-HClO4)中消化过夜，次日再在电热板上反复加热。前处理的方法原理均是先将零价硒氧化成四价硒(Se4+)[17-22]再进行检测，但上述过程冗长，试剂耗量大，尤其是在高浓度酸介质存在时操作需要十分谨慎，并且需要进一步采取除酸措施以避免对后续高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)测定产生仪器损害和信号抑制。因此，本研究在传统的消解基础上加以改进，以双氧水(H2O2)-盐酸(HCl)体系室温下反应代替HNO3和HClO4加热消化的方法，实现纳米单质硒的氧化，获得可直接进行HPLC-ICP-MS检测的溶液，实现对富硒蛋白多糖中纳米单质硒的快速、准确、安全测定，使整个样品处理周期控制在2 h以内。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试剂ⅩⅣ型蛋白酶[由灰色链霉菌(Stretomyces griseus)产生]、硒粉(纯度≥99.95%)、标准品亚硒酸钠(纯度≥98%)和色谱级甲醇购自美国Sigma-Aldrich公司。柠檬酸、HCl、30% H2O2、硼氢化钾(KBH4)、氢氧化钾(KOH)均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 主要仪器Nexion 300 HPLC-ICP-MS联用仪(美国PerkinElmer公司)、KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、超纯水仪(德国EMD Millipore公司)、电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)、ST 40R离心机(美国Thermo公司)、pH计(美国Mettler Toledo公司)、AFS-8220氢化物原子荧光光度计(北京吉天仪器有限公司)配备高性能空心阴极灯(波长：196.0 nm，北京有色金属研究总院)。
1.2 富硒蛋白多糖样品的制备参考课题组前期研究报道[12]，对Enterobacter cloacae Z0206菌株添加亚硒酸钠，深层发酵获得发酵液，先离心除去菌丝体，再将上清液经95%乙醇沉淀，最后对沉淀物进行冷冻干燥，即获得富硒蛋白多糖样品。该样品将作为本试验的材料。
1.3 富硒蛋白多糖样品的前处理称取25 mg富硒蛋白多糖于5 mL离心管中，加入3 mg ⅩⅣ型蛋白酶，再加入3 mL的蒸馏水，置于超声波清洗机中超声30 min，温度设置为37 ℃，将上述酶解液离心30 min，转速设为10 000 r/min，收集沉淀，并向沉淀中加入3 mL的蒸馏水，混匀后10 000 r/min离心30 min，离心结束后弃去上清，向沉淀中加入100 μL浓度为6 mol/L的HCl，再向其中加入3 mL H2O2常温下反应30 min，将上述反应液转移到容量瓶中，并用蒸馏水定容至500 mL，过0.45 μm滤膜，进行HPLC-ICP-MS分析。
1.4 标准曲线的制备准确称取25.0 mg亚硒酸钠溶解在250 mL水中，逐步稀释成0.500、0.300、0.200、0.050以及0.025 μg/mL的亚硒酸钠标准工作液，进行HPLC-ICP-MS分析。
1.5 HPLC-ICP-MS及氢化物发生-原子荧光(HG-AFS)分析条件 1.5.1 HPLC-ICP-MS分析条件PRP-X100阴离子色谱柱(250 mm×4.1 mm，10 μm，美国Hamilton公司)；进样量25 μL；流动相为5 mmol/L柠檬酸水溶液(pH 4.5)；流速0.8 mL/min[23]。
射频功率：1 100 W；等离子气[氩气(Ar)]流速：16.0 L/min；辅助气(Ar)流速：1.3 L/min；雾化气(Ar)流速：0.91 L/min；碰撞气[氦气(He)]流速：3 mL/min；质荷比78。
1.5.2 HG-AFS分析条件仪器参数：光电倍增管负高压290 V，原子化器高度8 mm；空心阴极灯电流80 mA；载气流量300 mL/min；屏蔽气流量800 mL/min；载流液为5% HCl；进样体积0.5 mL。硒标准工作液浓度为10 ng/mL，制作标准曲线时，采用5% HCl为稀释液，仪器自动稀释为2、4、6、8和10 ng/mL系列浓度，测定不同标准溶液中硒含量。所有样品硒含量平行测定3次，取平均值。
1.6 数据处理与分析数据处理采用Excel 2010统计分析软件进行处理和计算，以平均值来表示。
2 结果与分析 2.1 富硒蛋白多糖样品的前处理富硒蛋白多糖样品经前处理，最后离心得到的沉淀如图 1-A所示；加入H2O2、HCl振摇混匀后，沉淀得到很好的分散，如图 1-B所示；在室温放置30 min后，所有样品表现出清晰、无色透明状，如图 1-C所示。这种现象表明，红色的纳米单质硒在常温下可以被H2O2-HCl体系快速消解成无色溶液状态。
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图 1 纳米单质硒消解变化过程 Figure 1 The appearance of nano elemental selenium during the digestion |
亚硒酸钠标准工作液色谱图见图 2，保留时间为5.008 min，以亚硒酸钠标准工作液浓度为横坐标(x)，以78硒(78Se)积分面积为纵坐标(y)，拟合计算得到亚硒根离子(SeO32-)浓度的标准曲线方程及相关系数：y=167 993.58x+2 364.94(R=0.999 4)。
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图 2 亚硒酸钠标准工作液(0.30 μg/mL)色谱图 Figure 2 Chromatogram of 0.30 μg/mL Na2SeO3 standard solution |
将GB/T 13883—2008中HNO3-HClO4体系作为本试验消解处理方法的对照，将离心沉淀得到的纳米单质硒同时经过H2O2-HCl和HNO3-HClO4体系消解处理并分别进行HPLC-ICP-MS和HG-AFS分析。纳米单质硒经H2O2-HCl体系消解后的色谱图如图 3，经HPLC-ICP-MS分析，测得样品中纳米单质硒含量为2 439 μg/g(表 1)；而采用HNO3-HClO4体系消解处理，经HG-AFS分析，测得样品中纳米单质硒含量为2 450 μg/g。2种方法的测定结果十分接近。
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图 3 纳米单质硒经H2O2-HCl体系消解后的色谱图 Figure 3 Chromatogram of nano elemental selenium digested by H2O2-HCl system |
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表 1 HPLC-ICP-MS法测定富硒蛋白多糖中纳米单质硒含量 Table 1 The content of nano elemental selenium extracted from selenium-enriched polysaccharides determined by HPLC-ICP-MS method |
富硒蛋白多糖中硒的存在形式有纳米硒和有机硒甚至可能有亚硒酸盐，为了有效地提取纳米单质硒，本试验参考文献报道[24]对有机硒进行了酶水解提取，使样品中的大分子含硒化合物水解成水溶性小分子化合物从而与纳米硒进行分离。在对酶的选择上，试验比对了文献报道所提及的不同的酶，如ⅩⅣ型蛋白酶、蛋白酶K以及链蛋白酶等。试验结果表明，ⅩⅣ型蛋白酶在30 min内即可使样品酶解完全，并且在超声波辅助作用下完全可以替代常规的摇床培养(48 h)。通过ⅩⅣ蛋白酶的加入，使样品中的蛋白质水解，样品酶解物经水洗后，在离心机的作用下纳米单质硒能够沉淀下来，从而使疏水性的纳米单质硒与水溶性的硒代氨基酸以及样品中可能存在的亚硒酸钠得以分离[25-28]。
3.2 H2O2-HCl和HNO3-HClO4消解处理对测定结果的影响目前对于饲料中硒的测定国家标准(GB/T 13883—2008)中对于试样的前处理是先将试样在混合酸(HNO3-HClO4)中消化过夜，次日再在电热板上反复加热。上述操作对于样品是否消解完全，一是从高氯酸冒烟上判断，二是从色泽上判断，整个过程操作需要十分谨慎，以防止电热板上加热的样品被蒸干。因此，若将饲料中硒的测定方法移植至富硒蛋白多糖中纳米单质硒的检测中，前处理步骤不但耗时，而且烦琐。
H2O2在硒测定中的氧化作用已经在前人研究得以证实[29-30]，原理如下：
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在传统的测定硒的方法中，通常采用的是HG-AFS法：样品经HNO3-HClO4混合酸加热消解后，在HCl介质中Se6+还原为Se4+，用KBH4作为还原剂，将Se4+还原为硒化氢(SeH2)，再由载气带入仪器中进行检测。考虑到样品消解需要静置过夜，一般测试1个样品需要12 h以上。而本试验采用H2O2-HCl体系对纳米单质硒进行前处理时发现，加入100 μL浓度为6 mol/L的HCl和3 mL H2O2，常温静置30 min，纳米单质硒即可反应完全得到SeO32-。参考饲料中硒的测定(GB/T 13883—2008)，采用HG-AFS法对纳米单质硒检测得到样品中纳米单质硒含量为2 450 μg/g，采用H2O2-HCl体系消解，经HPLC-ICP-MS法检测得到样品中纳米单质硒含量2439 μg/g，2种处理方法所得结果基本一致。相比于传统的建立在HNO3-HClO4体系上的测定方法，本试验建立的纳米单质硒测定方法快速、简便、环保、准确度高、安全性好，适用于纳米单质硒的快速检测。
4 结论① 本试验成功建立了采用超声波辅助ⅩⅣ型蛋白酶水解富硒蛋白多糖的方法。将富硒蛋白多糖样品悬浮在水中，在ⅩⅣ型蛋白酶作用下保持37 ℃超声30 min，样品得到充分酶解。
② 由酶解液离心得到的纳米单质硒在常温下经H2O2-HCl体系可以完全消解得到SeO32-。离心得到的纳米单质硒在100 μL浓度为6 mol/L的HCl和3 mL H2O2作用下，常温静置30 min即可反应完全，得到便于检测的SeO32-。
③ 本试验建立了一种直接定量检测上述反应液中SeO32-的HPLC-ICP-MS分析方法。采用PRP X100阴离子色谱柱对SeO32-进行分离，流动相组成为5 mmol/L柠檬酸水溶液(pH 4.5)，流速0.8 mL/min，HPLC-ICP-MS可在10 min内完成对SeO32-的检测。
④ 采用本试验建立的方法对富硒蛋白多糖中纳米单质硒含量进行测定，所得结果与经典的HNO3-HClO4消解HG-AFS分析检测结果高度一致，表明本试验建立的方法快速、简便、环保、准确度高、安全性好，适用于纳米单质硒的快速检测。
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