马铃薯茎叶是我国乃至全世界一种产量很高的农副产品。因其具有较高的粗蛋白质(CP)[1-2]、钙(Ca)、磷(P)含量[2-3]和较低的粗纤维含量[1-3]而成为一种很有潜力的饲料资源。马铃薯茎叶可以制作成青贮料[1-9]，这在改善其适口性的同时不会对反刍动物产生危害[10-11]。但有关马铃薯茎叶青贮料对反刍动物瘤胃发酵影响的研究较少。仅见到Malecky等[12]用体外产气法研究了添加5%糖蜜和1.5%尿素的马铃薯茎叶青贮料对绵羊瘤胃发酵的影响，该结果表明，马铃薯茎叶青贮料对瘤胃发酵无不良影响。为进一步说明马铃薯茎叶青贮料对反刍动物的影响，本试验利用瘤胃模拟技术(Rusitec)研究了马铃薯茎叶混合青贮料体外瘤胃发酵特性，旨在为马铃薯茎叶的研究与应用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验设计采用单因素完全随机设计，将Rusitec系统的8个发酵罐分为2组，分别采用玉米秸青贮料、马铃薯茎叶混合青贮料(马铃薯茎叶与玉米秸按40 : 60混合青贮)配制发酵绵羊饲粮，2组分别以此为发酵底物，每组4个重复，每个重复1个发酵罐。
1.2 发酵底物配方发酵底物精粗比为40 : 60，所需玉米、豆粕、苜蓿干草和小麦秸均采自甘肃农业大学奶牛场，小麦秸剪碎至2~3 cm，所有原料均为饲喂状态。2种青贮料均为本实验室制作。马铃薯茎叶混合青贮料品质参数如下：pH 4.87；氨氮(NH3-N)含量21.98 g/kg TN(总氮)；干物质(DM)含量168.82 g/kg；乳酸(LA)含量23.89 g/kg；CP含量114.28 g/kg；中性洗涤纤维(NDF)含量556.13 g/kg(LA、CP、NDF含量均为DM基础)；玉米秸青贮料品质参数如下：pH 4.38；NH3-N含量18.77 g/kg TN；DM含量197.98 g/kg；LA含量31.61 g/kg；CP含量62.75 g/kg；NDF含量677.30 g/kg(LA、CP、NDF含量均为DM基础)。发酵底物组成及营养水平见表 1。
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表 1 发酵底物组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the fermentation substrate (DM basis) |
Rusitec系统为日本Shina-gawa公司产品。缓冲液参照McDougall[13]的配方，具体组成如下：NaHCO3 9.8 g、Na2HPO4·12H2O 9.3 g、NaCl 0.47 g、KCl 0.57 g、MgCl2 0.06 g、CaCl2 0.04 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。瘤胃液从3只9月龄安装了永久瘘管的小尾寒羊[(体重20.88±1.75) kg]瘤胃中采取。每个尼龙袋(8 cm×17 cm, 孔径100 μm，制作参照文献[14])装12 g发酵底物(DM基础)。缓冲液流速为0.39 mL/min[15-17]，流出液口筛网孔径为1.2 mm，搅拌机的搅拌频率为4~5次/min，发酵罐内温度为39 ℃，用通入CO2的方法保持厌氧环境。
1.4 发酵底物的发酵试验包括8 d预试期和2 d采样期。于预试期第1天早饲前，收集瘤胃液及瘤胃不同部位的食糜。将瘤胃液经4层纱布过滤后装入预热的保温瓶内，通入CO2后迅速带回实验室。将瘤胃液和缓冲液分装于已安装于39 ℃水槽预热的8个发酵罐中(400 mL瘤胃液+400 mL缓冲液)，09:00在每个发酵罐中放入1个装有70 g食糜的尼龙袋和1个装有12 g发酵底物的尼龙袋，于发酵罐中通入CO2。预试期第2天09:00取出装有食糜的尼龙袋，放入1个新的装有12 g发酵底物的尼龙袋，预试期第3天09:00取出发酵了48 h的装有发酵底物的尼龙袋，再放入1个新的。采样期每天09:00取出1个已消化48 h的尼龙袋，同时放入1个新的装有发酵底物的尼龙袋。换料过程在30 min内完成。
1.5 样品采集在采样期第1天收集24 h的总产气，用于测定产气量和甲烷产量。采样期第2天采集换料后0、3、6、9和12 h的发酵液，立即测定pH后保存于-20 ℃待测总氮、NH3-N、尿素氮和挥发性脂肪酸(VFA)含量。于采样期第2天收集已消化48 h的发酵残渣测定DM、CP、NDF和ADF，用于计算48 h瘤胃降解率。计算公式为：
某营养物质的降解率(%)=100×(发酵前该营养物质的含量-发酵后该营养物质含量)/发酵前该营养物质的含量。
1.6 测定方法发酵液pH用酸度计(PHS-3C，上海雷磁仪器厂)测定。产气量用气体流量计(DC-1，日本Shina-gawa公司)测定。甲烷产量用气相色谱仪测定(6890N，美国Agilent公司)，色谱柱为AT.SE-30毛细管柱(中国科学院兰州化学物理研究所)。发酵液尿素氮含量用二乙酰-肟法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。发酵液VFA含量用气相色谱仪测定，采用30 m×0.32 μm×0.5 μm毛细管柱(美国Agilent公司)。发酵液NH3-N含量参照冯宗慈等[18]的比色法测定。发酵液微生物氮含量计算公式如下：
微生物氮含量(mg/dL)=总氮含量-NH3-N含量-尿素氮含量[19]。
瘤胃液总氮含量，发酵底物DM、CP、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)、Ca和P含量及发酵残渣的DM和CP含量按照杨胜[20]提供的方法测定；发酵底物和发酵残渣的NDF和酸性洗涤纤维(ADF)含量按照Van Soest等[21]所述的方法测定。
1.7 数据统计数据采用SPSS 19.0软件进行t检验，以P < 0.05作为差异显著的判断标准。
2 结果与分析 2.1 产气量由表 2可知，马铃薯茎叶混合青贮料组的产气量显著高于玉米秸青贮料组(P < 0.05)，甲烷产量显著低于玉米秸青贮料组(P < 0.05)。
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表 2 不同青贮料饲粮的体外瘤胃发酵产气量和甲烷产量 Table 2 Gas production and methane production of in vitro rumen fermentation of diets containing different silages |
由表 3可知，马铃薯茎叶混合青贮料组在换料后3 h的pH、9 h的发酵液乙酸含量、6和9 h的发酵液乙酸/丙酸均显著低于玉米秸青贮料组(P < 0.05)。马铃薯茎叶混合青贮料组在换料后9 h的pH、6和9 h的发酵液丙酸含量显著高于玉米秸青贮料组(P < 0.05)。马铃薯茎叶混合青贮料组全期发酵液总氮、NH3-N(除了3 h)和微生物氮含量均显著高于玉米秸青贮料组(P < 0.05)。
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表 3 不同青贮料饲粮的体外瘤胃发酵特性 Table 3 Characteristics of in vitro rumen fermentation of diets containing different silages |
由表 4可知，2组DM、CP、NDF和ADF降解率均无显著差异(P>0.05)。
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表 4 不同青贮料饲粮的体外瘤胃发酵营养物质降解率 Table 4 Degradation rates of diets containing different silages after in vitro rumen fermentation |
产气量是反映饲料可发酵程度的指标，饲料可发酵性越强，瘤胃微生物活性越高，产气量就越大[22]。本试验中，马铃薯茎叶混合青贮料组的产气量显著高于玉米秸青贮料组，说明马铃薯茎叶混合青贮料更有利于瘤胃发酵。Malecky等[12]用体外产气试验比较了马铃薯茎叶青贮料(马铃薯茎叶中加5%糖蜜和1.5%尿素)取代50%苜蓿干草对绵羊瘤胃发酵产气量的影响，结果没有产生显著影响，从而说明马铃薯茎叶青贮料可以取代50%的苜蓿干草。随着饲料中碳水化合物在瘤胃中被细菌和原虫发酵，产生大量的甲酸、H2和CO2[23]。瘤胃产甲烷菌能够利用H2和CO2合成甲烷，通过嗳气释放到空气中。这个过程不仅造成饲料能量的损失而且会加重地球的温室效应。本试验中，马铃薯茎叶混合青贮料组的甲烷产量显著低于玉米秸青贮料组，说明马铃薯茎叶混合青贮料有利于饲料能量的利用，可以减少能量损失和甲烷对大气的污染，这一结果与该组在某些时间点的发酵液丙酸含量高于玉米秸青贮料组、乙酸/丙酸低于玉米秸青贮料组的结果一致。因未见到相关研究，所以不好做比较分析。
瘤胃液pH的高低对瘤胃纤维素分解菌的活性有重要影响，纤维素分解菌降解纤维类物质的适宜pH一般大于6.3，当瘤胃液pH低于6.3时，能部分抑制纤维素分解菌的活性；而当pH低于6.0时，纤维素分解菌的活性则被完全抑制[24]。本试验中，2组不同时间点的发酵液pH在7.02~7.28，均处于纤维素分解菌所需要的pH范围内，说明马铃薯茎叶混合青贮料对纤维素分解菌的活性不会产生不良影响。
当瘤胃发酵产生较高比例的乙酸时，甲烷产量随之提高；而当瘤胃液丙酸比例增高时，甲烷产量降低[25]。本试验中，马铃薯茎叶混合青贮料组换料后9 h的发酵液乙酸含量显著低于、换料后6和9 h的发酵液丙酸含量显著高于玉米秸青贮料组的结果与其甲烷产量低的结果一致。
瘤胃微生物可以产生蛋白质水解酶，在酶的催化作用下，饲料CP可在不同程度上被降解为肽类、氨基酸和氨，瘤胃微生物可以用CP降解产物作为原料合成微生物蛋白。本试验中，马铃薯茎叶混合青贮料组发酵液的总氮含量显著高于玉米秸青贮料组，可能是由于马铃薯茎叶混合青贮料组发酵底物的CP含量(146.87 g/kg)高于玉米秸青贮料组(133.27 g/kg)所致。瘤胃液的NH3-N含量取决于饲粮CP的含量以及其降解特性、流出速率等。在饲粮CP的降解率变化不大的情况下，饲粮蛋白质的含量是影响瘤胃液NH3-N含量最主要的因素[25]。本试验中，马铃薯茎叶混合青贮料组的发酵液NH3-N含量高于玉米秸青贮料组，可能是由于马铃薯茎叶混合青贮料组发酵液总氮含量高于玉米秸青贮料，而2组的CP降解率相近所致。Satter等[26]研究表明，瘤胃液NH3-N的正常含量介于0.8~56.1 mg/dL。本试验不同时间点的发酵液NH3-N含量(12.98~18.47 mg/dL)均位于正常范围。据报道，瘤胃液尿素酶的活性很高，尿素被降解成氨的速度是氨被同化速度的4倍，故瘤胃液尿素氮的含量较低[27]。本试验中，2组发酵液尿素氮的含量也较低且2组间无显著差异的结果说明，发酵液中的尿素酶的活性相当。另外，马铃薯茎叶混合青贮料组全期发酵液微生物氮含量显著高于玉米秸青贮料组，是由马铃薯茎叶混合青贮料组发酵液NH3-N含量较高所致。
本试验中，2组的各营养物质降解率均无显著差异的结果说明，2种青贮料所引起的瘤胃环境的改变还不足以表现在对营养物质的降解上，2组发酵液总挥发性脂肪酸(TVFA)含量无显著差异的结果也说明了这一点。Malecky等[12]采用体外产气试验也得到了类似结果，马铃薯茎叶青贮料组与苜蓿干草组的DM、NDF和CP降解率均无显著差异。
4 结论马铃薯茎叶混合青贮料对绵羊瘤胃体外发酵没有产生不良影响，且有利于减少瘤胃甲烷对环境的污染并且促进了反刍动物对能量和氮的利用。
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