自然界的很多天然活性物质能调控机体的氧化应激和免疫反应，保障机体细胞内外环境的稳定和生理机能正常。桦木酸(betulinic acid, BA)是一种植物源性五环三萜类物质，广泛存在于植物界，已有大量文章报道许多种属的植物中均有BA^[1]。BA对正常细胞或机体具有保护作用，该保护作用可能与抗氧化应激和提高机体免疫力有关^[2]。研究发现，BA能激活小鼠腹腔巨噬细胞，提高其吞噬能力和能量代谢水平，增强机体抗氧化能力^[3]；进一步研究发现，BA对小鼠的细胞免疫、体液免疫和非特异免疫功能有显著的增强作用^[4-5]。此外，BA具有极低的毒性，当剂量高达500 mg/kg时，动物没有出现明显的中毒现象^[4]，这些研究证实了BA可以作为抗氧化剂和免疫调节剂，在动物健康养殖方面具有广阔的应用前景^[6]。

环磷酰胺(cyclophosphamide, Cy)为烷化剂类抗肿瘤药。它既是广谱抗肿瘤药，又是目前应用的各种免疫抑制剂中作用最强、应用最多的药物之一^[7]。但Cy会引起机体骨髓抑制、脱发、白细胞减少和致畸等副作用^[8]。研究表明，Cy能够降低小鼠淋巴细胞数，使脾脏和淋巴结中T淋巴细胞CD25⁺、CD4⁺数量和百分比显著减少^[9]，表现出强大的免疫抑制作用，因此，Cy常用作免疫抑制模型的建立^[8]。同时，Cy可促进组织氧化，释放更多的自由基，导致氧化损伤^[3]，也被用作氧化应激模型的建立^[10]。BA是否对Cy引起的免疫器官氧化性损伤进而导致的免疫抑制具有改善或保护作用，还未见报道。本试验采用腹腔注射Cy诱导小鼠免疫器官氧化应激模型，研究BA对Cy导致免疫抑制的影响，旨在为BA的临床应用提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 试验试剂

BA：以白桦树皮(2016年春季收集于吉林省长春市，经60 ℃烘干后贮藏在黑暗、干燥处备用)为原料，从白桦树皮中提取桦木醇，经琼斯试剂氧化制备中间产物桦木酮酸后，用硼氢化钠还原合成BA，具体步骤按参考文献[11]，高效液相色谱(HPLC)测定BA纯度为96.53%。Cy：江苏恒瑞医药股份有限公司生产。

谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量测定试剂盒以及BS-200全自动生化分析仪均为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司产品；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 试验动物与饲粮

50只健康雄性昆明小鼠，4周龄，无特定病原体(SPF)级，体质量为(20±2) g。饲粮为小鼠普通育成料，由湖南斯莱克景达试验动物有限公司提供，其主要原料是小麦、玉米、豆油、麸皮、豆粕、鱼粉、麦芽糊精、酵母、草粉和预混料；主要营养水平(风干基础)如下：粗蛋白质(CP)20.50%、粗脂肪(EE)4.62%、钙(Ca)1.23%、磷(P)0.91%、赖氨酸(Lys)1.30%、蛋氨酸+半胱氨酸(Met+Cys)0.68%。

1.3 试验方法

将50只健康昆明小鼠放置在21~25 ℃、相对湿度为50%~70%的饲养房中饲养1周后，随机分为5组，即对照组、Cy组及0.05、0.50、5.00 mg/kg BW BA组。将BA混悬于1%的可溶性淀粉溶液中，按0.01 mL/g BW灌胃，对照组和Cy组给予等量的1%可溶性淀粉溶液，1次/d，连续灌胃14 d。除对照组外，其余各组小鼠第15天开始连续2 d腹腔注射50 mg/kg BW Cy，建立氧化应激模型，对照组注射等量的生理盐水。禁食16 h(自由饮水)后，眼眶采血扑杀，室温静止2 h，3 000 r/min离心10 min，收集血清用于检测生化指标。无菌取脾脏和胸腺，称重，计算免疫器官指数，公式如下：

免疫器官指数=免疫器官/体重。

脾脏和胸腺与预冷生理盐水的质量体积比为1 : 9制成10%组织匀浆，3 000 r/min离心15 min，收集上清液-80 ℃贮藏，用于检测SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH、MDA含量。

1.4 检测指标

用全自动生化分析仪检测血清中ALT和AST的活性、TP和ALB的含量。脾脏和胸腺SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定；脾脏和胸腺GSH-Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法测定；脾脏和胸腺MDA含量采用硫代巴比妥酸显色法测定；脾脏和胸腺GSH含量采用DTNB法测定；脾脏和胸腺CAT活性采用钼酸铵比色法测定。SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA、GSH含量的检测均按试剂盒说明书严格操作。

1.5 数据统计分析

采用SPSS 17.0对数据进行统计分析，采用one-way ANOVA程序进行方差分析，两两比较采用q检验，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析 2.1 体重

BA持续灌胃14 d，小鼠未见明显异常，同时也没有发生伤亡现象，这说明BA对小鼠没有明显的毒性作用。由表 1可见，与对照组相比，Cy组小鼠体重没有显著变化(P>0.05)；与Cy组相比，各剂量BA组小鼠体重无显著变化(P>0.05)。

2.2 血清生化指标

由表 2、表 3可见，与对照组相比，Cy组的血清AST和ALT活性极显著升高(P < 0.01)，血清ALB和TP含量基本没有变化(P>0.05)。与Cy组对比，5.00 mg/kg BW BA组血清ALT和AST的活性极显著降低(P < 0.01)，而ALB和TP含量则无显著变化(P>0.05)。

2.3 免疫器官指数

由表 4可见，与对照组相比，Cy组小鼠脾脏指数和胸腺指数显著下降(P < 0.05)，说明Cy导致免疫器官萎缩。与Cy组相比，除0.05 mg/kg BW BA组胸腺指数显著提高(P < 0.05)外，各剂量BA组免疫器官指数有提高趋势，但差异不显著(P>0.05)。

2.4 脾脏和胸腺的SOD活性

由表 5可见，与对照组相比，Cy组胸腺SOD活性极显著降低(P＜0.01)，而脾脏SOD活性无显著变化(P>0.05)。与Cy组相比，各剂量BA组胸腺SOD活性下降，且0.50 mg/kg BW BA组变化极显著(P＜0.01)，而脾脏SOD活性无显著变化(P>0.05)。

2.5 脾脏和胸腺GSH含量

由表 6可见，与对照组相比，Cy组脾脏GSH含量显著下降(P＜0.05)，而0.50 mg/kg BW BA组极显著高于Cy组(P＜0.01)。这说明Cy通过降低小鼠脾脏中GSH含量引起氧化损伤，而适当剂量BA处理能增强脾脏GSH含量，从而提高其抗氧化损伤的能力。

2.6 脾脏和胸腺GSH-Px活性

由表 7可见，与对照组相比，Cy组脾脏和胸腺GSH-Px没有发生显著改变(P>0.05)。与Cy组相比，0.50和5.00 mg/kg BW BA组脾脏和胸腺内GSH-Px活性显著或极显著升高(P < 0.05或P < 0.01)。这说明BA可以通过增强脾脏和胸腺GSH-Px活性来起到抗氧化损伤的作用。

2.7 脾脏和胸腺CAT活性

由表 8可见，与对照组相比，Cy组脾脏和胸腺中CAT活性下降，且在胸腺中差异极显著(P＜0.01)。与Cy组相比，0.50和5.00 BW mg/kg BW BA组脾脏和胸腺CAT活性显著或极显著提高(P＜0.01或P＜0.05)。这表明BA能改善Cy诱导后的小鼠脾脏和胸腺CAT活性，改善其抗氧化损伤的能力，对免疫器官起到一定保护作用。

2.8 脾脏和胸腺MDA含量

由表 9可见，与对照组相比，Cy组脾脏MDA含量极显著升高(P＜0.01)。与Cy组相比，各剂量BA组脾脏MDA含量均极显著降低(P＜0.01)。胸腺中MDA含量变化与脾脏相同，但变化不显著(P>0.05)。这表明BA可以通过降低脂质过氧化来缓解Cy对小鼠免疫器官的氧化损伤。

3 讨论

Cy是目前常用的一种烷化剂类抗肿瘤药物和细胞毒性药物，在体外无活性，进入体内被磷酰胺酶或磷酸酶水解，转化为有活性的磷酰胺氮芥，与DNA发生交叉联结，抑制DNA的合成，降低DNA的含量，从而影响机体的免疫水平^[12-14]。Cy作为免疫抑制剂可抑制各种动物的体液和细胞免疫应答^[15]。周华等^[16]研究证明，Cy可使肠黏膜Peyer’s结内细胞数量和CD3+、免疫球蛋白A阳性(IgA+)细胞减少，而细胞凋亡增强，说明Cy可以诱导肠黏膜免疫障碍。董晓芳等^[17]研究发现，肉仔鸡Cy处理后1 d，法氏囊指数、B淋巴细胞增殖能力、法氏囊中白细胞介素1β和脾脏、法氏囊中干扰素γ的mRNA表达量显著降低。王光等^[8]研究也表明，超剂量Cy可严重损伤脾组织，并认为这种脾损伤可能与体内的氧化与抗氧化平衡被打破有关。本研究发现，腹腔注射大剂量Cy后，免疫器官中的抗氧化酶类(如SOD、GSH-Px和CAT)活性和GSH含量大大降低，MDA含量增加。这说明超剂量使用Cy后，抗氧化酶类被大量消耗，氧化还原平衡被打破，引起脂质过氧化，造成淋巴细胞损伤，最终导致氧化应激。本研究发现，Cy处理后血清中AST和ALT活性极显著升高，说明在氧化应激的状态下，小鼠的肝脏受到了损伤。本试验还发现Cy引起免疫器官指数降低，导致免疫器官萎缩，说明Cy引起免疫器官氧化性损伤，进而导致免疫抑制。

BA属于植物源性五环三萜类物质，具有抗炎、抗氧化应激和提高机体免疫力等多种生物活性^[18]。体外研究发现，BA可抑制肿瘤坏死因子引起的人脐静脉内皮细胞活性氧含量增加，达到保护血管的作用^[19]。体内研究表明，BA通过改善肝脏组织中的氧化还原体系，保护抗氧化系统，降低脂质过氧化作用，对酒精诱导肝脏损伤有预防性的保护作用^[20-22]。本试验结果发现，BA处理后，显著降低了血清中AST和ALT的活性，说明BA对Cy引起的肝脏损伤具有保护作用。BA处理后极显著缓解了Cy所致脾脏GSH-Px、CAT活性和GSH含量的降低，极显著减低了脾脏MDA的含量，显著或极显著提高了胸腺GSH-Px和CAT活性，表明BA对Cy引起的淋巴免疫器官氧化损伤具有保护作用。BA的保护作用可能与自身的抗氧化性有关，通过提高抗氧化酶类的活性，降低脂质过氧化物的生成，缓解Cy引起的氧化应激。另据研究报道，BA抑制角叉菜胶诱导胸膜炎小鼠的足爪组织中髓过氧化物酶的活性，其抑制率为50.5%，增加足爪组织GSH-Px和谷胱甘肽还原酶的活性^[23]，说明BA通过抑制炎性细胞浸润，提高机体抗氧化能力，从而达到抗炎提高机体免疫力的作用，本试验结果与此相似。值得注意的是，0.50 mg/kg BW BA组胸腺SOD活性极显著低于Cy组，这说明BA不能通过调节SOD活性来缓解Cy对小鼠免疫器官造成的氧化损伤。本课题组前期研究发现，BA处理后能显著提高地塞米松诱导氧化损伤小鼠淋巴细胞SOD活性^[24]，本试验结果与此不一致，可能是诱导氧化应激的药物不一样所致。此外，BA对Cy致免疫器官氧化损伤的保护作用可能与提高机体的免疫力相关。本研究发现，BA能够增强免疫低下小鼠免疫应答能力，减轻Cy造成的胸腺萎缩，对免疫器官指数具有显著的修复作用。本课题组前期研究也发现，BA增强淋巴细胞活性和改变T淋巴细胞、B淋巴细胞的数目或亚群，从而提高机体的细胞免疫^[25]。这说明BA提高抗氧化酶的活性，减少细胞内过氧化物，降低脂质过氧化，保护机体免受自由基的损伤，通过提高机体的抗氧化能力，从而提高机体的免疫力，证实了BA的免疫调节作用有赖于抗氧化应激能力的发挥。BA具体的抗氧化应激机制尚有待于进一步研究。

4 结论

BA通过提高小鼠免疫器官CAT、GSH-Px活性和GSH含量，降低MDA含量，改善Cy引起的小鼠免疫器官的氧化应激，对Cy诱导的氧化损伤有预防性的保护作用。