2. 溧阳市动物疫病预防控制中心, 常州 213300
2. Animal Disease Prevention and Control Center of Liyang, Changzhou 213300, China
仔猪断奶时肠道发育不完善、机体免疫功能低下，易引起断奶应激综合征，导致肠道菌群紊乱和腹泻，严重影响仔猪生长发育[1]。抗生素和高锌因能有效缓解仔猪断奶应激造成的不利影响被广泛应用于生产实践[2]。但是，研究人员发现使用抗生素和高锌有诸多弊端，如抗生素导致的药物残留、细菌耐药性等；动物饲用高剂量的锌，锌由于消化率低会随着粪便大量排出体外，造成资源浪费和环境污染[3]，欧盟、荷兰和美国等多个国家已经限定仔猪饲料中锌的添加量。因此，探索锌的合理利用方法，积极寻找有效缓解仔猪断奶应激的抗生素替代品势在必行。在已知方法中，使用纳米氧化锌是替代传统氧化锌的潜在可行方案，与传统氧化锌比，纳米氧化锌效果更加显著[4]。纳米氧化锌具有颗粒小、比表面积大、吸收率高等特性，其粒径为1~100 nm，能够调节动物免疫力和繁殖性能[5]。研究已经证明饲粮中添加200~1 000 mg/kg纳米氧化锌对家畜和家禽均具有不同程度促生长作用，能够改善动物机体肠道黏膜形态、降低腹泻率等，还能够刺激生物体细胞、体液及非特异免疫功能，提高机体抗病能力[6-8]；Zhao等[9]研究发现饲喂肉鸡60 mg/kg纳米氧化锌能够提高后期日增重；Long等[10]在断奶仔猪饲粮中添加500 mg/kg纳米氧化锌发现能够显著提高日增重、日采食量，降低腹泻率，效果优于3 000 mg/kg氧化锌。但高剂量纳米氧化锌具有毒性负作用[11]。
凹凸棒土(attapulgite)简称凹土，又称为坡缕石(palygorskite)，是一种以硅酸盐为主要成分的黏土矿[理论化学式为Si8Mg5O20(OH)2.4H2O]，无毒、无味、无刺激性，廉价易得。凹土具有表面多孔、比表面积大、阳离子可交换特性，且对铅离子(Pb2+)、铜离子(Cu2+)、抗生素等具有良好的吸附效果[12-15]。此外，有研究表明黏土类矿物质是一种控释载体，能够控制生物活性分子、药物及营养素等物质的释放[16-18]。因此，凹土自2011年起被列入饲料添加剂名单[19]。研究发现，在断奶仔猪饲粮中添加2 000 mg/kg凹土能显著提高仔猪平均日采食量，提高饲料转化率，且有效改善仔猪肠道健康[20]；Tang等[21]发现饲粮中添加1 800 mg/kg凹土能显著增加仔猪平均日增重，减少腹泻，促进仔猪生长，提高经济效益。但大量研究表明，凹土添加剂量过高，会影响仔猪生长发育[21-23]。前人研究均局限于添加高剂量凹土，尚未发现低剂量凹土在仔猪中使用效果，同时有关500~1 000 mg/kg纳米氧化锌在仔猪饲粮中添加效果褒贬不一。因此，本试验立足于前人研究结果，结合实际生产成本考虑，将同比例低剂量凹土与不同水平纳米氧化锌颗粒结合，组成凹土纳米氧化锌，并通过在断奶仔猪饲粮中添加凹土纳米氧化锌，探索低剂量凹土和纳米氧化锌结合体在断奶仔猪饲养前期的适宜添加量和替代抗生素及高锌成为新型绿色健康添加剂的可能性。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用氧化锌(白色粉末状)、纳米氧化锌(白色粉末状，纯度≥99%，平均粒径45 nm)和凹土纳米氧化锌(纯度为85%，由80%纳米氧化锌和20%凹土组成，其中纳米氧化锌理化特性同上，凹土主要成分为硅酸盐，双层链状结构)由扬州大学化工学院提供；50%喹乙醇、15%金霉素、10%硫酸黏菌素由扬州大学饲料厂提供；试验仔猪为21日龄杜×长×大断奶仔猪，由苏州市太仓金诸农业发展有限公司提供。
试验所用硫酸黏菌素为2016年9月生产，根据中华人民共和国农业部公告第2428号规定可使用至2017年4月30日，本试验时间符合使用标准。且以上材料仅限于试验研究使用，旨在替代抗生素的使用。
1.2 试验设计试验选取21日龄体重相近[(6.30±0.51) kg]的健康杜×长×大断奶仔猪210头，随机分为7组，分别为对照组(CON组，饲喂基础饲粮)、抗生素组(ANT组，饲喂基础饲粮+100 mg/kg 50%喹乙醇+150 mg/kg 15%金霉素+50 mg/kg 10%硫酸黏菌素)、氧化锌组(ZO组，饲喂基础饲粮+3 000 mg/kg氧化锌)、纳米氧化锌组(NZO组，饲喂基础饲粮+800 mg/kg纳米氧化锌)、低凹土纳米氧化锌组(LA-ZO组，饲喂基础饲粮+700 mg/kg凹土纳米氧化锌)、中凹土纳米氧化锌组(MA-ZO组，饲喂基础饲粮+1 000 mg/kg凹土纳米氧化锌)和高凹土纳米氧化锌组(HA-ZO组，饲喂基础饲粮+1 300 mg/kg凹土纳米氧化锌)，每组6个重复，每个重复5头猪。试验于2017年4月在江苏省太仓金诸种猪场进行，试验预试期3 d，正试期9 d。
1.3 饲养管理及试验饲粮猪场属于规模化生产，设备齐全，防疫及管理措施完善。试验仔猪均在同一舍内饲养，饲粮为粉料，仔猪自由采食(每日饲喂4次，饲喂时间分别为06：30、10：30、14：30和18：30，每次添加量以料槽中略有剩余为宜)，自由饮水。每天清扫栏舍，保持栏内卫生，自然通风，日常管理、消毒与防疫按照猪场常规程序进行。
试验基础饲粮参照NRC(2012)仔猪营养需要标准并结合生产实践配制，其组成和营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验期间，全程以重复为单位记录采食量，试验第1天和结束当天08：00对每头仔猪空腹称重，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)。
1.4.2 腹泻率及腹泻指数试验期内每天07：00观察仔猪粪便，按照Castillo等[24]的方法对粪便进行评分。0分：粪便条形或粒状；1分：软粪、能成形；2分：稠装、不成形、粪水未分离；3分：液状、不成形、粪水分离。当粪便评分为2或以上时认为仔猪发生腹泻。计算试验期内各组腹泻率和腹泻指数，计算公式如下：
腹泻率(%)=100×试验期内每组仔猪腹泻头次/(试验天数×每组仔猪头数)；
腹泻指数=100×试验期内每组仔猪腹泻总评分/每组仔猪头数。
1.4.3 器官指数试验结束当天屠宰，采血后，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、胰腺，吸水纸吸干表明多余血液，立即称重，记录，计算各器官指数。
器官指数(g/kg)=器官湿重(g)/猪活体重(kg)。
1.4.4 血液生化指标在试验结束当天08：00，每个重复随机选取1头体重接近平均体重的仔猪，空腹前腔静脉采血3 mL于抗凝管中，测定血液中碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)活性以及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量，并计算白球比(A/G)。
1.5 数据统计与处理先用Excel 2010对试验数据进行初步整理，再用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法对各组间平均数进行多重比较，以P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能的影响由表 2可知，饲粮中添加抗生素、氧化锌、纳米氧化锌和凹土纳米氧化锌对断奶仔猪末重及F/G无显著影响(P>0.05)；与CON组相比，饲粮添加凹土纳米氧化锌显著提高断奶仔猪ADFI(P < 0.05)，显著提高ADG(P < 0.05)；此外，HA-ZO组ADFI较ANT组提高34.78%(P < 0.05)。
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表 2 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of attapulgite nano zinc oxide on growth performance of weaned piglets |
由表 3可知，与CON组相比，LA-ZO组、HA-ZO组断奶仔猪腹泻率显著降低(P < 0.05)，且LA-ZO组腹泻率显著低于ANT组(P < 0.05)。与CON组相比，凹土纳米氧化锌组腹泻指数均显著降低(P < 0.05)；与ANT组和NZO组相比，LA-ZO组断奶仔猪腹泻指数显著降低(P < 0.05)。
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表 3 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪腹泻的影响 Table 3 Effects of attapulgite nano zinc oxide on diarrhea of weaned piglets |
由表 4可知，与CON组相比，饲粮中添加不同水平的凹土纳米氧化锌对断奶仔猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺指数均无显著影响(P>0.05)；与ANT组和NZO组相比，随着凹土纳米氧化锌添加剂量增加，心脏指数有上升趋势(P>0.05)；与NZO组相比，LA-ZO组和MA-ZO组胰腺指数显著增加(P < 0.05)。
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表 4 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪器官指数的影响 Table 4 Effects of attapulgite nano zinc oxide on organ indices of weaned piglets |
由表 5可知，与CON组相比，饲粮中添加不同水平的凹土纳米氧化锌对断奶仔猪血液ALP、LDH活性和TP、ALB、GLB、LDL含量以及A/G均无显著影响(P>0.05)。与CON组相比，LA-ZO组和MA-ZO组血液TG含量显著降低(P < 0.05)。MA-ZO组血液TC含量与CON组相比降低23.04%(P < 0.05)，与ZO组相比降低25.94%(P < 0.05)。LA-ZO组血液HDL含量与CON组、ANT组和NZO组相比无显著差异(P>0.05)，但显著低于ZO组(P < 0.05)；MA-ZO组血液HDL含量与CON组和ANT组相比均提高54.55%(P < 0.05)；相比于CON组、ANT组，HA-ZO组血液HDL含量均提高16.36%(P < 0.05)。
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表 5 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪血液生化指标的影响 Table 5 Effects of attapulgite nano zinc oxide on blood biochemical indices of weaned piglets |
仔猪早期断奶导致肠道发育不完善，对营养物质消化吸收率低，腹泻频率高，严重影响其生长发育，而采食量和饲料转化率是决定断奶仔猪生长速度的主要因素[25-26]。有研究表明，凹土和纳米氧化锌能有效缓解仔猪断奶应激，提高仔猪生长性能。Wang等[27]等指出在断奶仔猪饲粮中添加1 200 mg/kg纳米氧化锌相比于添加硫酸黏杆菌素-氧化锌混合物改善了肠道屏障功能，从而保护肠道，降低了腹泻率，且研究发现仔猪组织和排泄物中锌的含量更低，说明减少了锌的富集，提高了锌的吸收利用，从而饲用少量纳米氧化锌达到高剂量传统氧化锌的效果。Long等[10]研究表明，饲粮中添加500 mg/kg纳米氧化锌能显著提高断奶仔猪ADG、ADFI和饲料转化率，与3 000 mg/kg氧化锌作用效果相当。孟艳莉[28]研究发现在1~21日龄和22~42日龄仔猪饲粮中添加3 000 mg/kg凹土能提高肠道内消化酶活性，促进糖类物质转化，加快营养物质消化，从而提高仔猪ADG和ADFI。从本试验结果看，减少凹土使用量也能够达到上述相似结论，不同的是本试验所用添加剂非单一物质，低剂量凹土所具体的功效有待进一步研究。本试验研究凹土与纳米氧化锌颗粒结合的凹土纳米氧化锌的应用效果，发现与CON组相比，凹土纳米氧化锌能显著提高断奶仔猪ADG和ADFI，且LA-ZO组和MA-ZO组ADG和ADFI与ZO组效果相当，同时LA-ZO组改善生长性能方面优于ANT组，促生长功效在数值上优于NZO组，且F/G最低，说明降低锌和凹土的使用量能够维持相近效果，这与前人研究结果相似，但不同的是随着凹土纳米氧化锌剂量的增加，饲料转化率逐渐降低。已有研究发现，凹土棒土具有黏性、流变性及离子交换性，能够形成胶状薄膜，提高凹土在仔猪肠道内存留时间，改善绒毛生长[18, 20, 28-29]，因此我们推测出现此试验结果的一个可能原因是凹土能够形成胶状薄膜，覆盖于肠道黏膜表面，减少了黏膜的损伤以及与有害物质的接触，保证了黏膜完整性，并且随着凹土与黏膜的紧密接触，使凹土携带的纳米氧化锌微粒逐渐被肠道吸收，而且凹土本身携带的离子能够与消化道中离子发生置换反应，置换出的离子可能被肠道吸收后促进各种消化酶的释放，加快饲粮的转化吸收，进而提高断奶仔猪生长性能；但随着凹土纳米氧化锌剂量的增加，仔猪肠道黏膜表面可能会覆盖过量凹土纳米氧化锌，反过来阻碍了营养物质的消化吸收，从而降低了饲料转化率，但未达到显著水平。此外，纳米氧化锌还能够提高回肠中Lgr5和Bmil干细胞的增值速度，这类细胞增值加快能促进肠道上皮细胞更新，改善肠道吸收和利用营养物质[30-31]。因此，凹土和纳米氧化锌共同作用于肠道，从而促进仔猪生长发育。
3.2 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪腹泻的影响仔猪断奶后，因机体防御系统不完善，对外界不良环境抵抗力差，易应激引起肠道菌群紊乱，降低肠道优势菌群对大肠杆菌等有害菌的抑制，使其大量定植，从而导致腹泻[32]。研究发现，凹土在治疗人类和反刍动物腹泻中效果良好[33-35]，但在仔猪上应用较少。纳米氧化锌在断奶仔猪中应用较多，且效果良好，能有效降低腹泻发生频率[25-26]。Hu等[1]研究发现，在断奶仔猪饲粮中添加500和750 mg/kg蒙脱石-氧化锌混合物(锌的含量为25%)能显著降低4~14日龄断奶仔猪腹泻指数，其中500 mg/kg蒙脱石-氧化锌混合物与2 000 mg/kg氧化锌添加量效果相当，并指出500和750 mg/kg蒙脱石-氧化锌混合物能够改善肠道黏膜完整性并提高胰腺和小肠内的消化酶活性，加快营养物质分解，减缓固态饲粮对肠道的持续刺激，从而降低仔猪腹泻。韩萌[31]在断奶仔猪饲粮中分别添加2 000 mg/kg传统氧化锌和500 mg/kg纳米氧化锌对比发现，2组腹泻发生率均显著降低，并且纳米氧化锌组与传统氧化锌组无差异，主要原因是纳米氧化锌能显著降低仔猪肠道通透性，提高回肠和结肠的绒毛高度与绒隐比，改善肠道环境。本试验结果提示，饲粮中添加3个水平凹土纳米氧化锌均能有效降低断奶仔猪腹泻率及腹泻指数，添加剂量为700 mg/kg时腹泻率及腹泻指数最低，低于3 000 mg/kg氧化锌组和800 mg/kg纳米氧化锌组，显著优于ANT组，即低剂量凹土纳米氧化锌的添加抗腹泻效果良好。140 mg/kg的凹土根据其性质且与纳米氧化锌结合，可能因此能够与添加200 mg/kg凹土达到相同止泻效果；1 000 mg/kg添加量时腹泻指数与3 000 mg/kg氧化锌相近，这些结果与Hu等[1]研究结果相似。由此可知：饲粮中添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌抗腹泻效果最佳。饲粮中添加凹土纳米氧化锌能有效降低仔猪腹泻率的原因可能是凹土携带的纳米氧化锌能够提高肠道黏膜蛋白occludin、claudin的表达，这类蛋白有利于肠道物理屏障的修复，且纳米氧化锌能够杀死大肠杆菌等革兰氏阴性菌以及抗高温高压孢子，协助肠道有益菌的定植并成为优势菌群[36]。此外，凹土具有吸附性，能够吸附霉菌毒素，保护肠道屏障，两者相互协同，共同维护肠道完整性与菌群稳定，减少腹泻[37]。本试验在饲养过程中发现CON组及ANT组多为轻度腹泻和软便，因此腹泻率较高，但抗生素对仔猪生长具有促进效果，能够改善饲料利用率，从而F/G低于CON组；高剂量氧化锌能缓解仔猪腹泻，但可能影响仔猪对营养物质吸收转化从而降低了饲料转化率。
3.3 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪器官指数的影响内脏器官是动物机体重要组成成分，维持机体正常生长发育，抵抗外界环境变化和病原侵入。器官指数能够体现动物各器官生长发育、新陈代谢、功能、健康状态等情况是否正常，从而反映出动物生长性能和生理状况等，而胰腺是胃肠道的重要组成部分，其分泌的内源消化酶活性影响胃肠道对饲料中营养物质的吸收与利用[38]。组织器官的良好发育是动物机体缓解应激的重要因素，能够影响仔猪生长发育及营养物质的吸收。本试验结果提示，相比于添加800 mg/kg纳米氧化锌，饲粮中添加700和1 000 mg/kg凹土纳米氧化锌能够显著提高仔猪胰腺重量，且略高于CON组，但随着凹土纳米氧化锌添加剂量的增加，胰腺指数越来越低。已有研究发现，高剂量纳米氧化锌会对小鼠器官生长产生毒性作用，影响小鼠发育[12]。因此我们猜测这可能是因为锌添加量的提高，会抑制胰腺中某些抗应激相关酶的活性和含量或部分干细胞的分化，加剧了胰腺氧化应激，对器官生长产生负作用，导致胰腺发育受损，而凹土具有一定缓解损伤作用，其具体作用机制有待进一步研究发现；心脏指数则随着凹土纳米氧化锌添加剂量的增加有增加趋势，且高于ANT组，但均与CON组间无显著差异，表明凹土纳米氧化锌对断奶仔猪心脏发育无显著影响，且对其他器官生长也无显著作用。
3.4 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪血液生化指标的影响血液是机体内环境重要组成部分，血液生化指标的变化能够间接反映出机体内器官组织和新陈代谢的变化，良好的新陈代谢能够促进仔猪对营养物质的吸收以及各种酶类的释放，从而维持机体营养平衡，改善仔猪生长性能，提高生产效益。TG由脂肪分解或某些糖类转化得到，能够为机体提供能量，血清中TG含量的高低能够反映脂肪分解和体脂变化情况，TG含量下降，则脂肪分解加强或转化为体脂增强，适量TG有利于机体内环境稳态[39]。TC是一种脂类物质，是多种类固醇激素的合成材料，其含量能够反映机体内脂类物质的吸收和代谢状况。孟艳莉[28]研究表明在断奶仔猪饲粮中添加3 000 mg/kg凹凸棒石对仔猪血液中TG含量无显著影响；徐奇友等[41]研究指出，肉鸡饲粮中添加40 mg/kg纳米氧化锌在28日龄后血清中的TC含量显著降低。本试验在仔猪饲粮中添加1 000 mg/kg凹土纳米氧化锌结果显示，血清中TC含量与后者研究结果相似，与前者结果不同，可能的原因是凹土对血液中TG和TC的含量无显著影响，但纳米氧化锌能够影响它们的生成和转化，适量降低TG和TC含量，从而促进仔猪脂肪分解和脂类物质的转化与吸收，提高能量利用率，改善生长性能。HDL具有重要的转运功能，能够将胆固醇转运到肾上腺等组织进行代谢，还能将其从周围组织转运到肝脏以胆酸形式排泄，缓解动脉粥样硬化[42]。王彬等[43]发现，饲粮中添加150和300 mg/kg纳米氧化锌能增加断奶仔猪血清中HDL含量，但与高锌组无显著差异，并指出新型纳米氧化锌能够提高饲粮中粗蛋白质的吸收利用率，促进仔猪生长。本试验结果提示，1 000 mg/kg凹土纳米氧化锌的添加剂量能显著提高血液中HDL含量，且显著高于ANT组，但与ZO组差异不显著，说明凹土纳米氧化锌能够提高血液中HDL合成速率，加快胆固醇转化，加快组织间物质转运，促进营养物质代谢与吸收，从而提高动物生产性能。
4 结论① 饲粮中添加凹土纳米氧化锌可显著提高断奶仔猪ADG和ADFI，降低仔猪腹泻率，改善仔猪生长性能，但随着添加剂量的增加，F/G逐渐提高。
② 饲粮中添加1 000 mg/kg凹土纳米氧化锌可显著降低血液TG和TC含量，显著提高血液HDL含量，促进脂肪分解，加快胆固醇等脂类物质转化，促进脂代谢。
③ 综合本试验结果，700 mg/kg凹土纳米氧化锌在提高断奶仔猪生长性能和降低腹泻率方面可替代抗生素、800 mg/kg纳米氧化锌和3 000 mg/kg氧化锌，并以低剂量锌应用于断奶仔猪饲粮中，可提高生产效益，因此本试验推荐凹土纳米氧化锌适宜添加量为700 mg/kg。
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