2. 浙江海洋大学食品与医药学院, 舟山 316022
2. College of Food and Medicine, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China
抗生素的禁用和有效疫苗的缺乏，在一定程度上促进了益生菌、益生元、免疫增强剂、植物提取物等的应用[1]。壳寡糖(chitosan oligosaccharide, COS)属于益生元的一种，它作为自然界中唯一一种带正电荷的碱性氨基多糖[2]，具有较好的溶解度和中性pH下的低黏度，且在胃肠道内不易被分解，可被直接吸收入血发挥作用[3]，引起了研究人员的普遍关注。最近的研究多集中于报道COS的多种生物学效应，包括促生长、抗感染、抗肿瘤、降血压、降低胆固醇等。研究表明，饲粮中添加COS可提高断奶仔猪的肠道绒毛高度并降低隐窝深度，进而提高营养物质的消化率，对仔猪的生长性能有积极的改善作用[4]；进一步研究表明，COS可提高吉富罗非鱼幼鱼血清中溶菌酶和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及抗嗜水气单胞菌感染的能力，进而对生长性能和免疫性能具有一定的调节作用[5]；大量体外研究表明COS可刺激巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)等细胞因子[6-8]，进而增强巨噬细胞的活性，COS是否可引起正常动物分泌细胞因子的研究报道不多；此外，在哺乳动物中COS的抗氧化研究多集中于妊娠后期母猪阶段和仔猪阶段等易发生应激的时间段[9]，在普通时间段的研究较少。因此，本试验拟研究在正常生理状态下COS对小鼠生长性能、免疫功能和抗氧化性能的改善作用，以期为利用COS生产功能性食品提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用COS由浙江维丰生物科技有限公司提供，纯度为99%，分子质量为1 000 u，脱乙酰度为85%~90%，聚合度为5~10，溶于水，为黄色粉末状固体，生产批号为KG-1503029。
1.2 试验设计与饲养管理试验动物为4周龄、体重14~16 g的雄性无特定病原体(SPF)级ICR小鼠，购买于上海莱克斯生物科技有限公司，生产许可证号为SCXK(沪)2002-0002。65只小鼠随机分笼适应1周后，选取体重均一、健康的60只小鼠，随机分为6组，每组10只。试验设置1个对照组和5个试验组，壳寡糖剂量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/kg BW，采用灌胃的方式给药，灌胃时以生理盐水(NS)为溶剂将壳寡糖配成0、10、20、30、40和50 mg/mL浓度的溶液，按0.02 mL/g BW给予相应剂量组动物灌胃，每天定时灌胃。每周称量1次体重，根据体重的大小来控制灌胃体积，灌胃42 d，试验小鼠饲养于浙江大学试验动物中心半封闭通风系统环境，控制环境温度在(24±1) ℃，湿度为(50±10)%，自由清洁饮水、采食(小鼠基础饲粮由浙江大学试验动物中心提供)，每周换2次垫料，小鼠饲养试验过程按照国家《实验动物管理条例》执行。
1.3 测定指标与方法 1.3.1 体重测定在试验第1天、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天和第43天清晨对每只小鼠分别进行空腹称重，分析体重变化。
1.3.2 免疫器官指数的测定试验结束时，禁食24 h(自由饮水)后称重，每组10只小鼠全部摘眼球取血收集血液后，断头脱臼处死，剥离出胸腺和脾脏，称重并计算免疫器官指数。
胸腺指数(mg/g)=胸腺重(mg)/体重(g)；
脾脏指数(mg/g)=脾脏重(mg)/体重(g)。
1.3.3 血清免疫指标的测定收集的每组10只小鼠的血液，室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，收集血清，用以测定免疫球蛋白含量、细胞因子水平和抗氧化酶活性，每组10个重复。
1.3.3.1 血清免疫球蛋白含量的测定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量均采用试剂盒测定，试剂盒购自于武汉博士德生物工程有限公司，并按其说明书进行试剂配制和指标测定。
1.3.3.2 血清细胞因子水平的测定血清IL-6、白细胞介素-10(IL-10)、IL-1β、转化生长因子-β(TGF-β)和TNF-α水平均采用试剂盒测定，试剂盒购自于武汉博士德生物工程有限公司，并按其说明书进行试剂配制和指标测定。
1.3.3.3 血清抗氧化酶活性的测定血清SOD、髓过氧化物酶(MPO)、过氧化物酶(POD)和碱性磷酸酶(AKP)活性均采用试剂盒测定，试剂盒购自于南京建成生物工程研究所，并按其说明书进行试剂配制和指标测定。
1.4 数据分析试验数据使用SPSS 20.0统计软件分析试验数据，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间的统计学差异，差异显著时采用Duncan氏法进行多重比较，测定结果以平均值±标准误(mean±SE)表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 各组小鼠体重变化在连续灌胃COS 42 d中，各组小鼠均未出现任何异常反应和死亡现象。试验结束时，灌胃不同剂量的COS对小鼠生长性能未产生显著影响(P>0.05)(表 1)，对照组、0.2 g/kg BW COS组、0.4 g/kg BW COS组、0.6 g/kg BW COS组、0.8 g/kg BW COS组和1.0 g/kg BW COS组小鼠体重分别增长了6.12、5.51、5.29、5.15、6.44、5.21 g，其中0.8 g/kg BW COS组小鼠体增重较对照组提高了5.23%，其他试验组体增重较对照组略有降低。
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表 1 试验期间各组小鼠体重变化 Table 1 Change of body weight of mice from different groups during the whole experimental period |
从表 2中可以看出，0.6 g/kg BW COS组胸腺指数较对照组显著提高(P < 0.05)，提高了32.87%，其他剂量组胸腺指数较对照组有所提高，但未至显著水平(P>0.05)；灌胃不同剂量的COS对小鼠的脾脏指数无显著影响(P>0.05)。
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表 2 COS对小鼠免疫器官指数的影响 Table 2 Effects of COS on immune organ indexes of mice |
从表 3中可以看出，随COS灌胃剂量的增加，血清IgA、IgG和IgM含量总体呈现先升高后降低的趋势，且都在灌胃剂量为0.6 g/kg BW时达到最大值。其中，0.6 g/kg BW COS组血清IgA、IgG和IgM含量较对照组分别提高了12.14%(P < 0.05)、6.89%(P>0.05)和20.69%(P < 0.05)。
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表 3 COS对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响 Table 3 Effects of COS on serum immune globulin contents of mice |
从表 4中可以看出，灌胃不同剂量的COS对小鼠血清IL-6、IL-10、IL-1β、TGF-β和TNF-α水平均无显著影响(P>0.05)，但各试验组血清IL-6、IL-1β、TGF-β水平与对照组相比总体呈现下降的趋势，且均在0.6 g/kg BW COS组有最小值，较对照组分别降低了6.92%、20.27%和9.34%(P>0.05)；血清IL-10水平较对照组整体呈现上升趋势，且在0.4 g/kg BW COS组有最大值，较对照组提高了34.00%(P>0.05)。
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表 4 COS对小鼠血清细胞因子水平的影响 Table 4 Effects of COS on serum cytokine levels of mice |
从表 5中可以看出，灌胃COS具有提高小鼠血清SOD和POD活性的趋势，其中SOD活性在0.4 g/kg BW COS组最高，与对照组相比提高了11.31%(P>0.05)，POD活性在0.8 g/kg BW COS组最高，与对照组相比提高了45.08%(P < 0.05)；随COS灌胃剂量的增加，血清MPO和AKP活性呈现先升高后降低的趋势，其中MPO活性在0.6 g/kg BW COS组最高，与对照组相比提高了27.61%(P < 0.05)，AKP活性在0.4 g/kg BW COS组最高，较对照组提高了21.30%(P>0.05)。
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表 5 COS对小鼠血清抗氧化酶活性的影响 Table 5 Effects of COS on serum antioxidant enzyme activities of mice |
有关COS对动物生长性能的影响报道不尽相同，一些研究者认为在基础饲粮中添加COS对仔猪的生长性能具有促进作用[10-11]，但乔丽红等[12]认为COS对断奶仔猪的生长性能无显著影响，产生这些差异的原因可能是因为不同试验所选用的COS的分子质量和溶解度不同，也可能是因为动物种类及生活环境不同。从上述讨论得知，COS的促生长效果不稳定，受饲养环境卫生条件的影响较大。同时，在COS具有促生长作用的研究中发现，随着COS剂量的增加，生长性能并不是呈线性增加，而是有一个最佳值，随后呈现下降趋势[13]。本试验结果显示，试验前期(第1~22天)，低灌胃剂量COS组(0.2 g/kg BW COS组)小鼠体重增加量高于对照组，中、高灌胃剂量COS组(0.6 g/kg BW COS组、0.8 g/kg BW COS组和1.0 g/kg BW COS组)体重增加量低于对照组。这表明，在0.6~0.8 g/kg BW的灌胃剂量范围内，COS对小鼠的生长性能具有提高的趋势，当COS灌胃剂量至1.0 g/kg BW时，生长性能反而具有降低的趋势，这与上述研究结果类似。可见，COS的添加剂量有一个适宜的范围，过量添加可能会对动物的生长性能产生不利影响，目前对COS副作用的研究尚未见报道，具体原因有待于进一步的研究。目前研究认为，哺乳动物对碳水化合物的消化主要限于以α-1, 4糖苷键连接而成的多糖，对其他形式的糖苷键不分解或分解能力弱，而COS是由β-1, 4-糖苷键连接而成的，在哺乳动物小肠内不能被消化酶分解，直接被小肠吸收，过量添加会导致动物不良性腹泻，对生长产生负效应[14]。试验后期(第22~43天)，中、高灌胃剂量组(0.6 g/kg BW COS组、0.8 g/kg BW COS组)小鼠体重增加量高于对照组及低灌胃剂量组(0.2 g/kg BW COS组、0.4 g/kg BW COS组)，可能是试验后期小鼠对COS产生了适应性，具体原因有待进一步研究。
3.2 COS对小鼠免疫器官指数的影响免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官两部分，中枢免疫器官包括骨髓和胸腺，外周免疫器官包括淋巴结、脾脏和黏膜相关淋巴组织等。胸腺是T细胞分化和发育成熟的主要场所，其作用是诱导淋巴细胞产生成熟的免疫细胞进行免疫应答；脾脏是机体最大的外周免疫器官，是机体进行免疫应答的主要场所[15]。胸腺指数和脾脏指数可作为基本的免疫指标直接反映机体的免疫功能[16-17]。目前认为COS对免疫器官发育存在着一定作用，本试验结果显示灌胃0.6 g/kg BW COS可显著提高胸腺指数，灌胃0.6~0.8 g/kg BW COS对脾脏指数具有提高趋势。邓阳勇等[18]研究表明芦荟多糖可使胸腺皮质增厚，皮质和髓质分解明显，淋巴细胞更密集。推测本次试验中0.6 g/kg BW COS组小鼠胸腺指数显著提高的原因可能是添加COS可促进小鼠胸腺中淋巴细胞的发育，提高胸腺中淋巴细胞数目，进而促进免疫器官发育，提高免疫机能。
3.3 COS对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响体外研究表明COS可以刺激巨噬细胞分泌多功能的细胞因子，这些细胞因子刺激T细胞和B细胞的分化，并促进免疫球蛋白的产生[19]。本试验结果显示灌胃0.6 g/kg BW COS可显著提高小鼠血清中IgA和IgM含量，推测其原因可能是COS的活性基团直接刺激了小鼠的免疫应答反应[20]。此外，免疫球蛋白是化学结构与抗体相似或具有抗体活性的一类糖蛋白，其结构中的大部分糖是以聚糖的形式结合形成的，聚糖有2种类型，N-乙酰基半乳糖和N-乙酰基葡萄糖，COS可以提供N-乙酰基葡萄糖的残基，并可以结合到具有免疫活性的存在于细胞表面的残基受体，进而提高免疫能力；此外，COS携带的正电荷可与T淋巴细胞及巨噬细胞表面的负电荷相互吸引，激发免疫细胞向B细胞发出指令，产生免疫球蛋白[21]。另有研究表明，在动物胃肠道内寄居的乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌可以分泌打开β-1，4糖苷键的酶，进而利用COS[4]。双歧杆菌和乳酸菌利用COS可产生琥珀酸、乳酸、短链脂肪酸，降低肠道的pH，产生酸性的肠道环境，有利于乳酸菌的增殖[22]。肠道内的有害菌如沙门氏菌、大肠杆菌等由于不能分泌分解COS的酶类而不能利用COS，COS可通过携带正电荷的游离氨基与细菌细胞壁或者细胞表面所携带的阴离子物质相结合，阻止营养物质的进入或使细胞变形，进而干扰其正常的物质代谢，发挥抑制有害菌增殖的作用[23]。因此，COS也可能是通过促进有益菌的生长和抑制有害菌的生长来提高免疫机能。
3.4 COS对小鼠血清细胞因子水平的影响作为免疫促进剂的COS可与淋巴细胞或吞噬细胞的特异性受体结合，通过与细胞因子的协同作用，有效刺激机体的免疫应答[24]，此过程中释放的细胞因子包括白细胞介素类、干扰素类等。有关COS对细胞因子水平的影响报道不一致，Deng等[25]研究表明COS可刺激巨噬细胞释放IL-1β、IL-6和TNF-α，从而提高肉鸡的免疫力；而Walsh等[26]在断奶仔猪上的研究发现COS并没有影响IL-6、IL-10、TNF-α等的表达。本试验结果表明试验组小鼠血清中IL-6、IL-1β、TGF-β水平与对照组相比总体呈现下降的趋势，血清IL-10水平较对照组整体呈现上升趋势。COS分子结构中含有的氨基可被机体的免疫系统识别，结合到巨噬细胞表面的受体，刺激巨噬细胞释放细胞因子，同时可引起T细胞表面的白细胞介素-2(IL-2)受体的表达，加速T细胞成熟而释放IL-2，其与受体结合后进一步加速了T细胞的成熟和分化，刺激血液循环中抗体的产生[21]。贾培媛等[27]研究发现COS可显著增加小鼠脾脏中CD8+T淋巴细胞的比例，而CD8+T淋巴细胞在IL-10产生的过程中发挥重要作用[28]，IL-10在体内是免疫系统的中央调节器[29]，它的缺失不仅会造成小鼠结肠性炎症，而且还可导致上皮渗透性炎症[30]。本试验中，灌胃不同剂量COS后小鼠血清IL-10水平整体呈现上升趋势，不会引发炎症反应。IL-10作为重要的抗炎性细胞因子，能过抑制活化的T细胞的产生过量的IL-6、IL-1β等炎性细胞因子，从而防止过度免疫应答对机体造成的伤害[31]。本试验显示，与对照组相比，试验组小鼠血清IL-6、IL-1β水平整体呈现下降趋势，不会引发过度的免疫反应，同时这也与试验组小鼠血清IL-10水平的升高相吻合。本研究结果与Walsh等[26]的研究结果相符，与Deng等[25]的结果不同，因猪和小鼠同属于哺乳动物，而鸡属于鸟类，因而推测COS在哺乳动物和鸟类上产生的效果可能不同。
3.5 COS对小鼠血清中抗氧化酶活性的影响通过体外测定COS对超氧阴离子自由基(O2-·)、羟基自由基(·OH)、二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)等自由基的清除率或抑制率，表明COS具有清除自由基、抗氧化的功能。Xie等[32]采用化学发光的研究技术探究COS对·OH的清除能力，结果表明其对·OH的清除能力与对硫脲相当，并且高于甘露醇和苯甲酸；王振等[33]通过体外抗氧化活性检测发现，当抗坏血酸和COS的浓度分别达到0.04和0.02 mg/mL时，对DPPH·的清除率均可达到90%，表明COS具有较强的清除DPPH·的能力。随着研究的深入，COS在细胞水平上的抗氧化活性研究也逐步展开，张吉等[34]在N9小胶质细胞上的研究表明，COS可通过降低活性氧簇(ROS)水平来抑制脂多糖(LPS)对N9小胶质细胞的损伤，起到对神经细胞的保护作用；Joodi等[35]研究表明COS可有效降低细胞内的ROS水平，减少过氧化氢(H2O2)对细胞造成的氧化损伤。COS的抗氧化活性在动物体内也得到了一些验证，且在鱼类上研究较多。孙立威等[36]报道，饲料中添加COS能显著提高吉富罗非鱼幼鱼血清中SOD、AKP活性，李振达等[37]研究发现COS可显著提高三疣梭子蟹血清中SOD和POD活性。在哺乳动物中，关于COS对抗氧化酶活性影响的研究尚未见报道。SOD是关键性的抗氧化酶之一，是超氧自由基的天然消除剂，可以清除体内多余的自由基，使自由基的形成与消除处于一种动态平衡中，从而免除其对生物分子的损害；SOD可作为机体非特异性免疫指标，来判定免疫刺激剂对机体非特异性免疫力的影响。POD广泛存在于动物、植物及微生物体内，是生物体内重要的酶类之一，它可以与H2O2结合减少自由基对机体的损伤，对细胞代谢过程中的活性氧具有清除作用，从而提高机体的抗病能力。AKP普遍存在于动植物体内，是溶酶体酶的重要组成部分，而溶酶体酶在机体的免疫反应中发挥重要作用。MPO是一种重要的氧化酶，与H2O2和卤化物组成了抗微生物体系，此体系在高等动物的免疫系统中发挥着重要作用[38]，因此，本试验测定了COS对小鼠血清中SOD、MPO、POD和AKP活性的影响，结果表明COS可显著提高小鼠血清MPO和POD活性，二者且分别在0.6 g/kg BW COS组和0.8 g/kg BW COS组达到最大值。COS分子中的氨基、一级羟基和二级羟基是其抗氧化功能的结构基础[39]，Feng等[40]研究表明COS结构中含有的还原端基，其还原性可清除或抑制自由基；Xie等[32]研究表明COS中的氨基能在溶液中与氢离子结合而形成NH3+，NH3+中的氢离子可以与其他自由基反应形成稳定的物质，继而起到清除自由基的作用。因此，推测COS可通过激活并提高机体内的抗氧化防御体系，从而维持机体内环境的相对稳定。
4 结论在本试验条件下，灌胃不同剂量COS对小鼠的生长性能、脾脏指数以及血清IgG含量、细胞因子水平、SOD和AKP活性均无显著影响，但灌胃剂量为0.6~0.8 g/kg BW时，小鼠脾脏指数有增加的趋势，且胸腺指数以及血清IgA和IgM含量、MPO和POD活性均有不同程度提高。
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