随着畜牧业的发展，饲料资源在基本得到充分利用的同时已普遍缺乏。葡萄是世界上普遍栽培的水果之一，我国年产葡萄约500万t，而新疆维吾尔族自治区是主要的葡萄生产地。所得葡萄果实中，80%用于酿酒，13%用于鲜果食用，7%用于加工果汁等，葡萄籽是葡萄工业生产的副产品。葡萄籽干物质(DM)占鲜果质量的4%~7%，按此计算，则全世界葡萄加工副产品葡萄籽拥有量约为380万t(按5%计算)，我国拥有量约为48.5万t[1]，具有很大的利用空间。
目前，国内外对葡萄渣和葡萄籽及其加工产品开发利用的研究报道很多，葡萄籽残渣在畜牧养殖方面上的应用也有一些报道，吴建敏等[2]利用葡萄籽残渣代替部分玉米、麸皮和豆粕进行奶牛的饲养试验，发现葡萄籽残渣在奶牛精饲料中适宜水平为10%左右；张鹏等[3]在饲粮中添加不同水平葡萄籽粉替代玉米，发现在基础饲粮中使用葡萄籽粉替代7%玉米对成年母羊的增重效果和经济效益最佳。本试验所用葡萄籽酿酒残渣是新疆维吾尔族自治区石河子市西部牧业公司所提供用葡萄籽酿造白酒后的副产物，本课题组对其营养价值评定发现，非纤维碳水化合物的含量仅为2.64%，不可利用纤维含量达到34.18%，所能提供的有效能值相应偏低；粗蛋白质(CP)含量为14.2%，小部分可溶性的蛋白质被瘤胃降解后，剩余的大部分蛋白质为结合蛋白质(CP中58.17%)，进入小肠后，蛋白质中氨基酸(AA)的消化率均很低[4]。这表明葡萄籽酿酒残渣可以作为反刍动物的粗饲料开发利用，但其适宜用量尚不清楚。因此，本试验设计了5种葡萄籽酿酒残渣水平的全混合日粮(TMR)，测定育肥羊瘤胃食糜的外流速度和营养物质的瘤胃降解动力学参数，研究葡萄籽酿酒残渣水平对TMR营养物质有效降解率的影响，以期明确该原料在育肥羊TMR中的适宜水平，为其在育肥羊饲养中开发利用提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 葡萄籽酿酒残渣本试验所用葡萄籽酿酒残渣由新疆维吾尔族自治区石河子市西部牧业公司提供，为葡萄籽采用“葡萄籽酒精固态发酵—综合提取罐—浸出、分馏、层析纯化”工艺酿造葡萄酒后所剩余的残渣, 其营养水平见表 1。
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表 1 葡萄籽酿酒残渣营养水平(风干基础) Table 1 Nutrient levels of brewing residue of grape seed (air-dry basis, n=3) |
根据NRC(1985)所推荐的育肥羊营养需要，设计5种不同葡萄籽酿酒残渣水平[0(TMR1)、4.17%(TMR2)、8.33%(TMR3)、12.50%(TMR4)、16.67%(TMR5)]但等能等氮的TMR，试验TMR组成及营养水平见表 2。
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表 2 试验TMR组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of experimental TMRs (air-dry basis) |
选取3只当年出生的哈萨克去势公羊，体重为(35±3.7) kg，代谢笼内单笼饲养，经隔离检疫、肌注阿维菌素驱虫后，手术安装永久性瘤胃瘘管。试验在石河子大学动物科技学院营养代谢实验室中进行。在试验开始前，所有的羔羊自由采食TMR1，每只羔羊每日自由采食量超过1 400 g(DM)。为了避免饲料剩余，试验期内育肥羊按1 200 g/d饲喂，08:00、20:00各等量饲喂1次，自由饮水。
1.4 试验设计以3只公羊进行5期试验，各期分别以5种不同葡萄籽酿酒残渣水平的TMR进行瘤胃灌注试验，按TMR葡萄籽酿酒残渣水平由低到高依次进行。每期15 d，其中第1~7天为预试期，第8~12天为连续灌注期，第13~15天为采样期。同时在每期的第13~15天进行尼龙袋试验。
1.5 试验方法 1.5.1 瘤胃灌注试验连续灌注期内，以醋酸镱四水合物[纯度99.99%, 购自萨恩化学技术(上海)有限公司]为瘤胃食糜标记物，按100 mg/d镱(Yb)的灌注量配制醋酸镱(Yb-ac)溶液500 mL(取1 mL待测Yb浓度)，经瘤胃瘘管灌注, 采用蠕动泵全天24 h不间断灌注。
采样期内，在停止灌注后的0、2、4、8、12、24、36、48、60和72 h各采集瘤胃食糜50 mL，60 ℃烘干后粉碎取样，用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定配制好的Yb-ac溶液及食糜样品中Yb的浓度。绘制浓度衰减曲线，利用非线性回归(NLIN)法来拟合其瘤胃食糜外流速度。
1.5.2 尼龙袋试验采用尼龙袋法测定5种TMR的DM、有机物(OM)和CP在育肥羊瘤胃的动力学参数。采用尺寸为5 cm×8 cm、孔径为40~50 μm的尼龙袋，且尼龙袋中的待测定的样本即为试验TMR。精确称量2.5 g样品装于尼龙袋中，用尼龙线扎口并绑在铁链上。每条铁链共绑9个尼龙袋，在试验期第13天晨饲前通过瘘管将尼龙袋投放在瘤胃腹馕中，并将铁链末端的尼龙线用夹子固定于羊毛上, 防止掉入瘤胃中。投放后分别于2、4、8、12、24、36、48、60、72 h从3只试验羊瘤胃中各取出1个尼龙袋，用自来水冲洗干净后-20 ℃冷冻保存。待全部尼龙袋取完后，再在水龙头下用自来水反复冲洗至水澄清为止。0时刻尼龙袋不放入瘤胃中，按照上述洗涤方法冲洗后冷冻保存、待测。按杨胜[5]的方法测定各时间点尼龙袋残渣中的DM、OM、CP含量。
1.6 计算公式 1.6.1 瘤胃食糜外流速度瘤胃食糜的外流速度由瘤胃内容物中Yb浓度下降曲线来确定，数学模型如下：
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式中：b为t时刻瘤胃内容物中Yb的浓度(mg/kg)；C0为零时间点瘤胃内容物中的Yb浓度(mg/kg)；t为停止灌注后的时间(h)；k为瘤胃食糜的外流速度(%/h)；e为自然对数的底。根据不同时间点食糜中的Yb浓度采用SAS 8.01软件[6]中的NLIN过程错位法(DUD)来拟合Yb浓度下降曲线方程，求出各项参数。
1.6.2 瘤胃降解动力学参数TMR的DM、OM、CP的瘤胃降解动力学参数采用SAS 8.01软件[6]中NLIN过程Marquadt方法拟合。按Ørdkov等[7]方法计算DM、OM及CP在瘤胃内的有效降解率，计算公式为：
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式中：ED为有效降解率(%)；a为快速降解组分含量(%)；b为慢速降解组分含量(%)；Kd为慢速降解组分的降解速率(%/h)；Kp为瘤胃食糜的外流速度(%/h)。下式同。瘤胃降解动力学参数采用SAS 8.01软件[6]中NLIN过程Marquadt方法拟合。
采用以下公式计算DM在瘤胃内的有效停留时间：
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法国农业科学研究院(INRA)指出，每千克可发酵有机物(FOM)可产生23.2 g微生物氮或145 g微生物蛋白质(MCP)。依据RENB理论，按瘤胃可降解蛋白质(RDP)转化为MCP的效率为0.9计算，RENB值的计算公式如下：
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MCP转化率的计算公式如下：
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采用SAS 8.01软件[6]中的相关(CORR)过程对TMR葡萄籽酿酒残渣、NDF、ADF水平与外流速度之间进行直线相关分析，再用回归(REG)过程进行直线回归分析。TMR的DM、OM、CP在瘤胃中的动态降解率采用混合线性模型(PROC MIXED)程序进行重复性测量数据方差分析。瘤胃降解动力学参数和DM在瘤胃内的有效停留时间采用PROC ANOVA程序进行方差分析。P < 0.05为差异显著, P < 0.01为差异极显著。FOM、RDP、RENB值及有效降解率采用对照(GLM CONTRAST)语句进行线性和二次曲线趋势分析。
2 结果与分析在整个试验过程中所有的试验羊都是健康的，正常消耗了定量供给它们的TMR，少有余料，在试验结束后3只试验羊平均体重为(39.0±2.3) kg。
2.1 瘤胃食糜外流速度瘤胃食糜中Yb浓度随时间呈递降趋势，48 h后趋于0(图 1)。
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图 1 瘤胃食糜外流速度 Figure 1 Outflow rate in rumen digesta |
葡萄籽酿酒残渣水平与外流速度之间呈显著正相关的直线关系(r=0.607 0, P < 0.05)，模型为：y=0.428 61x(R2=0.736 0)，其变化规律为外流速度随葡萄籽酿酒残渣水平的提高而升高，其中TMR1组与TMR5组之间差异显著(P < 0.05)，其他TMR组之间差异不显著(P>0.05)(表 3)；NDF水平与外流速度之间也呈显著正相关的直线关系(r=0.607 0, P < 0.05)，模型为：y=0.0.098 62x(R2=0.987 2)，表明外流速度随NDF水平的提高而升高；ADF水平与外流速度之间呈显著正相关直线关系(r=0.605 0，P < 0.05)，模型为：y=0.130 58x, R2=0.987 1。
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表 3 5种TMR的瘤胃食糜外流速度 Table 3 Outflow rate of rumen digesta of 5 kinds of TMR |
由表 4可知，5种TMR的DM降解率随瘤胃中滞留时间的延长均呈现极显著上升的趋势(P < 0.01)。葡萄籽酿酒残渣水平对DM降解率产生了极显著影响(P < 0.01)，随着TMR中葡萄籽酿酒残渣水平的增加, DM在瘤胃中的降解率逐渐降低后上升，各时间点平均值以TMR4组最低, 为39.45%，极显著低于其他4组(P < 0.01)，其他4组之间差异不显著(P>0.05)。
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表 4 5种TMR中DM在瘤胃中动态降解率 Table 4 Dynamic degradation rate of DM in rumen of 5 kinds of TMR |
由表 5可知，5种TMR的OM降解率随瘤胃中滞留时间的延长均呈现极显著上升的趋势(P < 0.01)。TMR4组和TMR5组的OM降解率各时间点平均值极显著低于其他3组(P < 0.01)，但这2组之间差异不显著(P>0.05)。
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表 5 5种TMR中OM在瘤胃中动态降解率 Table 5 Dynamic degradation rate of OM in rumen of 5 kinds of TMR |
由表 6可知，5种TMR的CP降解率随瘤胃中滞留时间的延长均呈现极显著上升的趋势(P < 0.01)，CP降解率在60 h之后趋于稳定，降解达到了平台期。各TMR组CP降解率各时间点平均值差异不显著(P>0.05)。
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表 6 5种TMR中CP在瘤胃中动态降解率 Table 6 Dynamic degradation rate of CP in rumen of 5 kinds of TMR |
由表 7可知，各TMR组的DM、OM和CP的快速降解组分含量和降解速率均差异不显著(P>0.05)。TMR1组的DM在瘤胃内的有效停留时间显著高于其他4组(P < 0.05)。DM有效降解率为TMR1组显著高于TMR4组和TMR5组(P < 0.05)，OM有效降解率为TMR1组显著高于TMR3组、TMR4组和TMR5组(P < 0.05)，CP有效降解率为TMR1组显著高于其他各组(P < 0.05)。
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表 7 5种TMR中DM、OM、CP在瘤胃中动力学参数 Table 7 Kinetic degradation parameters of DM, OM and CP of 5 kinds of TMR in rumen |
由表 8可知，随着葡萄籽酿酒残渣水平的不断增加，DM的有效降解率呈显著直线下降趋势(P=0.011)；OM的有效降解率呈极显著直线下降趋势(P=0.002)；而CP的有效降解率呈显著二次曲线下降趋势(P=0.020)。5组之间各项瘤胃动力学参数均无显著性差异，因此造成有效降解率发生显著性改变的主要因素是外流速度的不同。
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表 8 5种TMR中DM、OM、CP的瘤胃有效降解率 Table 8 Effective degradability of DM, OM and CP of 5 kinds of TMR in rumen |
从表 9可知，FOM、RDP、RENB值均随葡萄籽酿酒残渣水平的增加呈线性下降趋势(P < 0.001、P=0.006、P=0.005)。各TMR组的RENB值均为负值，表明随着葡萄籽酿酒残渣水平的增加，RDP过剩，而FOM不足，需要补充FOM才能进一步提高RDP的利用效率。根据回归公式计算出MCP转化率，结果表明，TMR1组和TMR2组的MCP转化率较高。
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表 9 5种TMR的瘤胃能氮平衡(干物质基础) Table 9 RENB of 5 kinds of TMR in rumen (DM basis) |
杜道全等[9]在饲粮中用葡萄籽粕替代等比例的苜蓿干草饲喂奶牛，发现在饲粮中添加2%~4%的葡萄籽粕对奶牛生产性能及个体情况没有不良影响；孙占鹏等[10]研究结果发现，在基础饲粮中添加8%葡萄渣对提高成年母羊增重效果最好；张鹏等[3]在饲粮中使用葡萄籽粉替代7%玉米饲喂成年母羊，不仅对羊增重有较好的促进作用，且可降低饲料成本，提高经济效益。本试验中在TMR中添加葡萄籽酿酒残渣对育肥羊的采食量并无显著影响，这可能与本试验采用限制性饲喂有关。
3.1 不同葡萄籽酿酒残渣水平TMR对瘤胃食糜外流速度的影响育肥羊瘤胃食糜外流速度是指单位时间内从瘤胃中流出的固体或液体食糜的体积占瘤胃内容物体积的百分比，单位为%/h。外流速度是评定饲料DM及CP在瘤胃内有效降解率的重要参数之一，因此，准确评定动物在特定生理、饲养与环境等条件下的外流速度，对于准确评估饲料营养价值、科学配合饲粮具有非常重要的科学意义和实用价值。当食糜的外流速度提高时, 反刍动物瘤胃对粗饲料的消化程度和整个消化道的消化率就会降低, 反之则提高。而且流通速率是一个动态值。前人研究表明，动物的品种[11-12]、采食量[13-14]、饲粮精粗比和NDF水平[15]、饲养水平[17-18]等诸多因素都会影响外流速度的大小。
本试验中在5种TMR等能等氮的条件下，TMR的NDF水平对瘤胃食糜外流速度的影响是显著的，与王海荣等[19]发现在绵羊进食的能氮量相似的情况下, TMR的纤维水平对消化道同一部位的食糜外流速度影响不显著的结论相反，这可能是由于TMR所选用的纤维源不同所造成的，纤维水平[20-21]、纤维质量[22-23]、纤维长度[24-25]等都会影响对纤维物质的利用，从而导致试验结果的不同。Chase等[26]发现食糜通过率随饲粮纤维水平的降低而呈现线性下降的趋势，从3.90%/h降至3.68%/h，这与本试验的研究结果相一致。
3.2 不同葡萄籽酿酒残渣水平TMR对DM、OM、CP瘤胃动力学参数的影响李文波等[27]研究发现，饲粮的降解率随着瘤胃微生物作用时间延长而升高。本试验也得到了类似结果，随着TMR在瘤胃内停留时间的延长，DM、OM、CP的降解率随之提高，并最终趋于平衡。
有研究表明，在营养水平相近时，改变精粗比必然导致饲粮组成的变化，可以影响瘤胃微生物的数量，进而影响饲粮中各养分的降解率[28-29]。薄玉琨等[30]在尼龙袋试验中发现，同白酒糟相比，醋糟的DM消化率较低，这与醋糟中相对较高的NDF水平有关。本试验中，随着TMR葡萄籽酿酒残渣水平依次增加，精料比例相应降低，DM、OM、CP的降解率逐渐下降后趋于稳定或略有上升，与前人研究结果[31]一致，TMR5组降解率呈上升趋势这可能与尼龙袋试验中尼龙袋冲洗不足有关[32]。粗饲料的蛋白质多存在于细胞内容物中，蛋白质的降解速度取决于植物细胞壁的纤维结构。因此，饲粮中纤维物质的降解情况对CP的降解率有重大的影响。刘海霞等[33]采用尼龙袋法测定绵羊常用粗饲料瘤胃DM和CP的降解率，发现饲粮中粗纤维水平相对高时可能导致瘤胃中CP降解率下降，与本试验研究结果一致。
3.3 不同葡萄籽酿酒残渣水平TMR对RENB的影响MCP是小肠可代谢蛋白质的主要来源，瘤胃MCP的合成与RDP和FOM的利用率密切相关，当FOM提供的能量与瘤胃RDP的降解量达到平衡时，MCP合成率最高。本试验中，5种TMR均为瘤胃能氮负平衡型，表明5种TMR的RDP过剩，TMR氮利率较低，FOM低于平衡需要，代谢能量成为了限制因子，瘤胃内能量和RDP比例失衡导致了饲料间负组合效应。陈喜斌等[34]发现RDP转化为微生物氮的效率受饲粮蛋白质降解率、降解速度及RDP与微生物可利用能平衡的影响。本试验中，饲粮的蛋白质降解率随葡萄籽酿酒残渣水平的增加而降低，使RDP转化为微生物氮的效率也随之降低，导致了RENB值随TMR葡萄籽酿酒残渣水平的增加而下降，应该补充FOM进一步提高RDP的利用效率，使FOM与RDP达到平衡，促使MCP合成最大化。
4 结论① 随着TMR中葡萄籽酿酒残渣水平的增加，瘤胃食糜的外流速度呈线性增高，导致TMR养分的瘤胃有效降解率先下降后趋于稳定或略有上升。
② 葡萄籽酿酒残渣水平超过TMR的12.50%时将导致DM有效降解率、MCP、FOM显著降低，MCP合成受到影响。
③ 育肥羊TMR中葡萄籽酿酒残渣的适宜水平为8.33%~12.50%。
致谢: 对试验过程中给予帮助和支持的新疆农业大学动物科技学院的李凤鸣和李昊老师表示诚挚的谢意!| [1] |
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