我国传统的仔猪断奶时间为56日龄左右，而现代生猪养殖为了追求生产效率，仔猪早期断奶已成为规模化猪场的普遍生产方式，一般在21～35日龄时断奶[1-2]。然而，35日龄前仔猪消化道发育尚未健全，饲粮由液体母乳转为适口性较差的固体饲粮，使肠道内环境受到很大冲击。断奶伴随着转群运输、新猪舍环境适应、仔猪混养等，使仔猪发生断奶应激，引起采食量下降、消化不良、腹泻和生长缓慢等一系列“仔猪早期断奶综合征”[3]。因此，选择合适的断奶时间，平衡母猪流转效率和仔猪健康，对于猪场的综合效益尤为重要。
肠道不仅是动物吸收营养的主要场所，也是体内重要的免疫器官[4]。断奶应激严重损伤仔猪肠道形态和功能，导致肠黏膜屏障受损，引起肠道形态发生变化[5]、肠道通透性增加[6-8]，极大地影响其未来的生产性能和免疫功能。基于肠道功能发育规律是选择和优化仔猪断奶时间的关键基础。目前研究多集中在不同断奶日龄(14～35日龄)对仔猪生长性能、消化器官和酶活性的影响[2, 9-10]，但有关断奶后仔猪肠道形态和功能发育规律的研究较少。本试验旨在研究21～28日龄仔猪肠道结构、紧密连接蛋白和细胞因子的发育性变化以及21日龄断奶对仔猪肠道形态和功能的损伤，为合理选择早期断奶时间、制订预防断奶应激损伤策略提供新思路。
1 材料与方法 1.1 试验设计与试验饲粮采用2×3双因子完全随机试验设计，组别(哺乳组、断奶组)和日龄(22、24和28日龄)为2个主效应。选取6窝体况相近的健康大白仔猪，每窝为10～12头。21日龄时，每窝选取6头平均体重为(6.1±0.2) kg的仔猪，随机分为2组，分别为断奶组(于保育舍饲喂基础饲粮)和哺乳组(于原产床继续哺食母乳)。断奶仔猪单栏饲养，舍内温度和光照时间与哺乳仔猪保持一致，温度维持在30 ℃左右；自由饮水，采用湿拌料方式饲喂，每天08:00和16:00饲喂玉米-豆粕型基础饲粮。基础饲粮参照NRC(2012)营养标准配制成粉料，营养成分满足5～10 kg仔猪的营养需要量，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
分别于22、24和28日龄时，仔猪禁食12 h后，进行前腔静脉采血，肝素抗凝，静置1 h，4 000 r/min离心后制备血浆，-80 ℃保存。按照窝源一致的原则，每窝选取2头(哺乳组和断奶组各1头，即每组6头仔猪)，放血处死后，剖开腹腔分离出空肠和回肠，采集空肠前端和回肠末端肠道，使用预冷的生理盐水轻轻冲洗后，手术刀刮取黏膜，分装于2 mL冻存管，液氮速冻后转移至-80 ℃保存；剪取约1 cm的空肠和回肠肠环，浸入4%多聚甲醛固定。
1.3 测定指标与方法 1.3.1 生长性能分别于22和28日龄时对仔猪称重，计算仔猪断奶后的平均日增重(按照生长至28日龄的12头仔猪计算)。每天观察仔猪的健康和腹泻情况，计算腹泻率。
腹泻率(%)=[试验期内仔猪腹泻头数/(试验天数×同组仔猪头数)]×100。
1.3.2 肠道形态将固定好的空肠和回肠肠环组织石蜡包埋后切片(3～4 μm)，采用苏木精-伊红(HE)染色，中性树脂封片，光学显微镜下观察。Leica LAX软件拍照并对空肠、回肠的绒毛高度和隐窝深度作定量分析。
1.3.3 血浆和肠道黏膜的二胺氧化酶(DAO)活性肠道黏膜组织进行10%组织匀浆。血浆和肠道黏膜组织液的DAO活性采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。
1.3.4 肠道黏膜相关基因表达空肠和回肠黏膜总RNA的提取采用试剂盒(QIAGEN)，并用微量分光光度计(Bio-Drop)测定总RNA的纯度和浓度。按照试剂盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa)操作步骤反转录合成cDNA。反应体系按照SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒说明书配制。荧光定量PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s；60 ℃退火延伸30 s，共40个循环；熔解曲线的制作参照荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX 96)操作说明书进行。基因的mRNA表达量采用2-ΔΔCt方法计算，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，引物见表 2，由英潍捷基贸易有限公司合成。
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表 2 引物序列信息 Table 2 Primer sequence information |
采用JMP 10.0软件分析数据，生长性能采用t检验统计分析，其余指标采用2×3双因子统计分析，Tukey法进行多重比较。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 21日龄断奶对仔猪生长性能的影响由表 3可知，2组仔猪的初重(断奶时体重)无显著差异(P>0.05)。与哺乳组相比，28日龄(断奶后第7天)时，断奶组仔猪的末重和平均日增重均极显著降低(P < 0.01)。断奶组仔猪断奶后第1～3天的腹泻率高于哺乳组，但无显著差异(P>0.05)。
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表 3 21日龄断奶对仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of weaning at 21 days of age on growth performance of piglets |
由图 1可知，断奶组仔猪的空肠绒毛脱落、隐窝凹陷。由表 4可知，断奶组仔猪的空肠绒毛高度极显著低于哺乳组(P < 0.01)。组别和日龄对空肠隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度有极显著交互作用(P < 0.01)，断奶组的空肠隐窝深度极显著高于哺乳组(P < 0.01)，哺乳组的空肠隐窝深度随着日龄的增加逐渐降低，而断奶组则逐渐增加；22日龄时，断奶组的空肠隐窝深度与哺乳组相比无显著差异(P>0.05)；24和28日龄时，断奶组的空肠隐窝深度极显著高于哺乳组(P < 0.01)。断奶组的空肠绒毛高度/隐窝深度极显著低于哺乳组(P < 0.01)，哺乳组28日龄时的空肠绒毛高度/隐窝深度极显著高于22和24日龄时(P < 0.01)，而断奶组在不同日龄时无显著差异(P>0.05)。
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图 1 21日龄断奶对仔猪空肠形态的影响 Figure 1 Effects of weaning at 21 days of age on jejunum morphology of piglets (40×) |
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表 4 21日龄断奶对仔猪空肠组织形态的影响 Table 4 Effects of weaning at 21 days of age on jejunum morphology of piglets |
由图 2可知仔猪回肠形态的变化。由表 5可知，与空肠不同，组别和日龄对仔猪的回肠绒毛高度有极显著交互作用(P < 0.01)，哺乳组的回肠绒毛高度极显著高于断奶组(P < 0.01)，哺乳组24日龄时的回肠绒毛高度极显著高于22日龄时(P < 0.01)，而断奶组在不同日龄时无显著差异(P>0.05)。断奶组的回肠隐窝深度极显著高于哺乳组(P < 0.01)，回肠隐窝深度随着日龄的增加逐渐增加(P < 0.05)。断奶组的回肠绒毛高度/隐窝深度极显著低于哺乳组(P < 0.01)，2组的回肠绒毛高度/隐窝深度在不同日龄时均无显著差异(P>0.05)。
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图 2 21日龄断奶对仔猪回肠形态的影响 Figure 2 Effects of weaning at 21 days of age on ileum morphology of piglets (40×) |
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表 5 21日龄断奶对仔猪回肠组织形态的影响 Table 5 Effects of weaning at 21 days of age on ileum morphology of piglets |
由表 6可知，组别和日龄对仔猪的空肠黏膜DAO活性有显著交互作用(P < 0.05)，断奶组的空肠黏膜DAO活性极显著低于哺乳组(P < 0.01)。2组的血浆DAO活性在不同日龄时无显著差异(P>0.05)。断奶组的回肠黏膜DAO活性显著低于哺乳组(P < 0.05)，但2组的回肠黏膜DAO活性在不同日龄时无显著差异(P>0.05)。
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表 6 21日龄断奶对仔猪血浆和肠道黏膜DAO活性的影响 Table 6 Effects of weaning at 21 days of age on the activity of DAO in plasma and intestinal mucosa of piglets |
由图 3可知，组别和日龄对仔猪空肠黏膜闭锁蛋白(occludin)的mRNA表达量有极显著交互作用(P < 0.01)，哺乳组空肠黏膜occludin的mRNA表达量随着日龄的增加先升高后降低(P < 0.05)，断奶组在不同日龄时无显著差异(P>0.05)；与哺乳组相比，断奶组22日龄时空肠黏膜occludin的mRNA表达量有下降趋势(P=0.05)，24日龄时显著降低(P < 0.05)。空肠黏膜闭锁小带蛋白1(ZO-1)的mRNA表达量随着日龄的增加先升高后降低(P < 0.05)。断奶组回肠黏膜ZO-1和occludin的mRNA表达量显著低于哺乳组(P < 0.05)，24日龄时回肠黏膜ZO-1的mRNA表达量显著高于22日龄时(P < 0.05)。
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同一项目数据柱上标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。*表示2组间差异显著(P < 0.05)。N代表哺乳组，W代表断奶组；22、24、28分别表示22、24、28日龄。下图同。 Value columns in the same item with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant differences (P>0.05). * means significant difference between two groups. N represents the nursing group, and W represents the weaning group. 22, 24 and 28 mean 22, 24 and 28 days of age, respectively. The same as below. 图 3 21日龄断奶对仔猪肠道黏膜紧密连接蛋白mRNA表达量的影响 Figure 3 Effects of weaning at 21 days of age on mRNA expression of tight junction protein of intestinal mucosa of piglets |
由图 4可知，组别和日龄对仔猪空肠黏膜肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达量有显著交互作用(P < 0.05)，断奶组24和28日龄时空肠黏膜TNF-α的mRNA表达量显著高于哺乳组(P < 0.05)。断奶组空肠黏膜白细胞介素10(IL-10)的mRNA表达量显著低于哺乳组(P < 0.05)。日龄对空肠黏膜细胞因子的mRNA表达量无显著影响(P>0.05)。
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图 4 21日龄断奶对仔猪空肠黏膜细胞因子mRNA表达量的影响 Figure 4 Effects of weaning at 21 days of age on mRNA expression of cytokines of jejunum mucosa of piglets |
由图 5可知，与空肠黏膜不同，组别和日龄对仔猪回肠黏膜细胞因子的mRNA表达量无显著交互作用(P>0.05)。回肠黏膜白细胞介素1β(IL-1β)的mRNA表达量随着日龄的增加而降低(P < 0.05)。2组回肠黏膜细胞因子的mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。
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图 5 21日龄断奶对仔猪回肠黏膜细胞因子mRNA表达量的影响 Figure 5 Effects of weaning at 21 days of age on mRNA expression of cytokines of ileum mucosa of piglets |
仔猪消化道发育尚未健全，肠道免疫功能低下，微生物区系不稳定，断奶时会遭遇环境、营养、心理等多方面的挑战，造成仔猪断奶后生理机能紊乱。研究表明，肠道疾病往往随着断奶应激而出现[11-12]，这表明断奶应激在疾病感染中起到至关重要的作用。本试验中，21日龄断奶诱发了仔猪应激，表现为体重显著下降，平均日增重降低了86.46%，断奶后第1天有16.67%存在腹泻情况，生长性能受到严重影响。肠道是断奶应激的主要损伤部位之一。空肠和回肠是小肠中营养物质吸收的重要肠段，其绒毛形态和功能发育是否良好，直接影响机体对营养物质的吸收。本试验中，仔猪断奶后空肠和回肠绒毛变短，并伴有脱落现象，同时隐窝凹陷，说明21日龄断奶严重影响了仔猪肠道的形态和发育。断奶后绒毛变短，减少了肠道吸收面积，是引起仔猪平均日增重极显著降低的重要原因之一。
肠道绒毛作为机体营养物质吸收的主要部位，小肠绒毛上皮细胞将消化道中的氨基酸、葡萄糖、无机盐等吸收进入血液，若此部位受损，会影响营养物质的吸收。DAO主要存在于哺乳动物肠道黏膜或绒毛上皮细胞中，是组胺等多胺物质进行代谢的重要调节酶，并在细胞增殖中发挥重要作用[13]，肠道黏膜DAO活性与肠道黏膜绒毛高度、肠上皮细胞的完整性和成熟度有密切关系[14-16]。本试验结果表明，哺乳组仔猪的空肠黏膜DAO活性随着日龄的增加逐渐降低，断奶组却无显著变化，这表明哺乳期仔猪肠道处于不断发育的过程中，上皮细胞不断发生增殖分化，28日龄时空肠黏膜DAO活性降低说明仔猪肠道上皮细胞发育趋于稳定。而断奶组的仔猪回肠黏膜DAO活性显著低于哺乳组，说明21日龄断奶严重损坏仔猪肠道上皮细胞的完整性和成熟度，造成仔猪肠道绒毛变短。
肠道黏膜中肠上皮细胞、黏蛋白、肠道黏膜相关淋巴组织及其分泌的细胞因子、抗菌肽、微生物区系等形成了天然的屏障[17]，维护肠道和机体健康。肠上皮细胞通过紧密连接等细胞连接形成机械屏障，外周血中DAO活性是肠上皮细胞机械屏障损伤的重要标志。正常生理条件下血浆DAO活性较低，当肠道黏膜受损时，DAO可以由肠黏膜进入血液循环导致血浆中DAO活性增加。本试验中，断奶后血浆DAO活性提高了10.67%，但由于动物个体差异大，未达到显著水平。断奶后回肠黏膜ZO-1、occludin的mRNA表达量显著降低，24日龄时空肠和回肠黏膜ZO-1的mRNA表达量显著高于22日龄时，这表明21日龄断奶，肠上皮细胞间紧密连接的结构蛋白表达在转录水平受到抑制，破坏了肠黏膜屏障，增加了肠道通透性。栾兆双[18]研究发现，仔猪断奶后紧密连接蛋白ZO-1、occludin的mRNA表达量显著降低，28日龄后逐渐升高；Weiler等[19]研究发现，在应激条件下，ZO-1、occludin的mRNA相对表达量降低，与本研究结果基本一致。28日龄时断奶仔猪空肠occludin的mRNA表达量基本达到哺乳仔猪水平，说明断奶7 d后，肠道黏膜损伤基本得到修复。
得益于肠上皮细胞形成的机械屏障，水、离子等可溶性小分子物质可以选择性地通过，而毒素、病原体等有害物质被阻止进入[17]。由于21日龄断奶造成了肠道屏障损伤，毒素、病原体等有害物质进入，可能激活肠黏膜中固有层淋巴组织、派伊氏结(PP结)、肠系膜淋巴结[20]，产生免疫应答，分泌细胞因子。本试验研究发现，断奶组24和28日龄时空肠黏膜TNF-α的mRNA表达量显著高于哺乳组，而空肠黏膜IL-10的mRNA表达量显著低于哺乳组。Pié等[21]研究也发现，仔猪断奶后肠道促炎性细胞因子IL-1β、白细胞介素6(IL-6)和TNF-α的mRNA表达量迅速升高，肠道出现炎症反应。研究表明，肠黏膜的树突状细胞在黏膜中不断捕获由杯状细胞转运的抗原，分泌IL-10和转化生长因子β(TGF-β)并迁移至肠系膜集合淋巴结，活化初始T细胞为Treg，在免疫耐受中发挥至关重要的作用[22-23]。在人和小鼠中敲除抗炎性因子IL-10或其受体后会表现强烈的炎症反应，还使促炎性因子的分泌增加[24-26]。与空肠黏膜相比，断奶并未引起回肠黏膜细胞因子mRNA表达量的显著变化，表明在断奶应激条件下仔猪回肠的免疫稳定能力优于空肠，推测与回肠上富有黏膜相关淋巴组织相关。PP结作为黏膜淋巴相关组织的重要组成部分，主要集中在回肠[27-28]，它是一个完整的执行免疫应答的功能场所，聚集着执行适应性免疫的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和巨噬细胞等，当肠道中的抗原被传递到黏膜相关淋巴组织后，会激活B细胞引起体液免疫应答，同时也可被树突状细胞捕获后活化T细胞，引起更强烈的免疫应答。本试验中回肠黏膜免疫屏障表现出的强耐受力可能与此机制相关。
断奶时间的选择不仅要考虑母猪的流转，还要考虑仔猪的成活率。目前猪场常采用21或28日龄断奶。21～28日龄是仔猪快速发育阶段，断奶的窗口期应基于仔猪发育的生理状况来确定。本研究结果表明，21～28日龄时，哺乳仔猪肠道绒毛持续发育，表现为绒毛高度逐渐增长；肠道屏障功能在24日龄时最高，表现为肠上皮细胞间的紧密连接蛋白的mRNA表达量最高，肠黏膜促炎性因子TNF-α的mRNA表达量在24日龄时下降。综合这些指标，24日龄是仔猪肠道发育的关键点。21日龄断奶后，仔猪生长至24日龄时肠道绒毛损伤最为严重，表现为肠道绒毛最短且脱落现象最严重、血浆DAO活性最高、肠道紧密连接蛋白的mRNA表达量严重下降、促炎性因子的mRNA表达量上升。由此可知，24日龄是断奶应激损伤最严重的时间点。在这个时间节点的严重应激损伤一方面是因为应激反应发展的进程[18, 21]，另一方面是因为仔猪肠道发育在24日龄前后的变化显著。尽管21日龄断奶后至28日龄，仔猪肠道形态、屏障功能均有所恢复，但推荐在24日龄时仔猪完成消化道发育进程后断奶。本研究还发现了断奶影响肠道屏障功能的重要黏膜细胞因子。关于饲料添加剂改善仔猪生长性能、维持肠道健康已有许多报道[29-31]。因此，在选择合理的断奶时间的同时，配合新型饲料添加剂促进抗炎性细胞因子的表达、加强肠道屏障功能，将有助于仔猪更好地度过断奶应激。
4 结论① 哺乳仔猪22～28日龄肠道发育趋于成熟。
② 21日龄断奶会破坏仔猪肠道上皮细胞的结构，肠道绒毛变短和脱落，影响营养物质吸收，造成仔猪腹泻，降低平均日增重。
③ 21日龄断奶抑制肠道紧密连接蛋白mRNA的表达，损伤屏障功能，导致肠道通透性增加，引起肠道炎症反应。
④ 24日龄是仔猪肠道发育的关键时间点，以24日龄后断奶为宜。
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