我国是农业大国，农作物秸秆资源丰富，特别是玉米秸秆，是反刍动物重要的粗饲料来源之一。秸秆细胞壁由纤维素、半纤维素、木质素、部分果胶等其他化学成分组成，其中纤维素占据整个细胞壁的30%~50%，是反刍动物可以直接利用的碳源^[1]。但是秸秆细胞壁中，木质素作为一种芳香族高分子化合物，与半纤维素形成稳定的木质素-碳水化合物复合体，将纤维素和半纤维素包裹其中，使瘤胃微生物与纤维素降解酶不能直接接触纤维素，如能有效破解秸秆细胞壁复合体结构，则可以提高生物制剂的作用效果，从而提高秸秆的利用率^[2-3]。因此，对秸秆进行破壁处理，是提高秸秆饲料化利用率的关键步骤，其主要目的是破解或去除秸秆中的抗营养结构，增加微生物与酶的可及性，提高纤维素的降解速率和转化率^[4]。纤维素具有特定的一级、二级、三级、四级结构，分别用聚合度、氢键作用力、结晶度和比表面积进行表征，而表征指标的变化则可以代表纤维微观结构的变化，进而代表秸秆被降解的程度^[5]。目前，大部分学者主要是以改善秸秆营养品质、提高秸秆饲料利用率为研究重点，但是在秸秆生物处理过程中，秸秆细胞壁纤维结构的破解程度与秸秆主要纤维成分，如中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)、纤维素、半纤维素的相关却鲜有报道。观察并分析秸秆细胞壁的纤维形态和微观结构，可以从分子水平揭示秸秆饲料化的作用机制，对评价秸秆饲料的营养价值具有很大的作用。因此，本研究以玉米秸秆为试验材料，研究生物发酵前后秸秆的营养成分、发酵品质和纤维微观结构变化，旨在为秸秆饲料化利用的技术提供支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

玉米秸秆取自河北省保定市，品种为金玉99，于2016年9月收获籽实后收割。采集的玉米秸秆经65 ℃烘干48 h后，混合均匀，粉碎至40目用于营养成分和微观结构测定。

酶制剂：纤维素复合酶[纤维素酶(cellulase，≥10 000 U/g)+木聚糖酶(xylanase，≥120 000 U/g)+β-葡聚糖酶(β-glucanase，≥40 000 U/g)]、果胶酶(pectinase，≥10 000 U/g)、漆酶(laccase，10 000 U/g)，试验所用复合酶制剂及酶制剂均购自夏盛实业集团有限公司，粉末状，常温贮存。

活菌制剂：植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum，≥2×10⁶ CFU/g)、布什乳酸杆菌(Lactobacillus buchneri，≥2×10⁶ CFU/g)，菌种保藏于中国农业科学院饲料研究所，活菌制剂冻干粉，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 试验设计

本试验共设计5个组，分别为：秸秆原料组(CS组)、青贮对照组(CK组)、复合酶制剂组(CPL组)、复合酶-单活菌组(CPLP组)、复合酶-双活菌组(CPLB组)。

处理方法如下：玉米秸秆刈割后，用青贮切碎揉搓机切短至1~2 cm，按表 1的分组及添加剂量溶于蒸馏水，搅拌，将生物制剂均匀喷洒在粉碎的玉米秸秆上，水分调节至65%~70%。样品均装入聚乙烯袋(24 cm×40 cm)，每袋1 kg，用真空包装机(DZ-280/2SD)抽真空并封口，室温(25~37 ℃)贮藏45 d后开封取样。CK组直接添加蒸馏水，不添加任何生物制剂。另取玉米秸秆原料样品置于冰盒中，迅速带回实验室，-20 ℃贮藏，待检。每个组4个重复，3个用于样品测定，1个为备用。

1.3 测定项目和方法 1.3.1 发酵品质及营养成分测定

取玉米秸秆青贮20 g，加入180 mL蒸馏水，匀浆1 min，用4层纱布过滤，用pH测定仪(Testo 205，德国)测定青贮浸出液的pH^[6]。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮(NH₃-N)含量^[5]。使用GC128型气相色谱仪分析乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)的含量，分析条件为：火焰离子化检测器(FID)，柱2 m×4 mm，固定相Pora-pak Q(80目)，柱温120 ℃，检测器和进样器温度230 ℃，氮气(N₂)流速65 mL/min，空气流速300 mL/min，氢气(H₂)流速30 mL/min，灵敏度16×10³，纸速5 mm/min。化学分析法测定玉米秸秆生物发酵前后的营养成分含量，包括干物质(dry matter，DM)、粗蛋白质(crude protein，CP)、NDF、ADF、木质素(lignin，L)^[7]。

纤维素(cellulose，C)=ADF-酸性洗涤木质素(ADL)；

半纤维素(hemicellulose，HC)=NDF-ADF；

总氮(total nitrogen，TN)含量=CP/6.25。

1.3.2 玉米秸秆微观结构的测定 1.3.2.1 一级结构——聚合度

玉米秸秆样品粉粹过40目，采用苯酚-硫酸法测定玉米秸秆样品中的总糖含量，4，4′二羧酸-2，2′-喹啉(BCA)法测定玉米秸秆样品中还原糖含量，总糖与还原糖的比值，即为玉米秸秆纤维素的聚合度^[8]。

1.3.2.2 二级结构——傅里叶转换红外光谱(FTIR)图谱

使用VERTEX 70V FTIR仪(Bruker公司，德国)对不同组的玉米秸秆样品进行扫描电镜观察，得出FTIR图谱^[5]。试验处理：玉米秸秆样品粉碎2 min，过40目；65 ℃干燥12 h后，称取1 mg样品与50 mg溴化钾(KBr)研磨均匀，使用FW-5压片机，压强1 Mpa，30~60 s，压成直径约13 mm的薄片。试验条件：扫描范围在1 000~4 000 cm^-1区间，光谱分辨率2 cm^-1。

1.3.2.3 三级结构——X射线衍射(XRD)图谱

使用D8-Advance型XRD仪(Bruker公司，德国)对不同组的玉米秸秆饲料进行XRD扫描，得出XRD图谱^[5]。试验处理：各组样品均粉碎2 min，过40目。试验条件：Cu-Ka，40 kV×40 mA，扫描速度1 ℃/min，步长0.04°，2θ扫描范围3°~40°。观察不同处理后的样品结晶度变化，并根据Meyer等^[9]提出的公式计算结晶度：

CrI(%)=[(I₀₀₂-I_am)/I₀₀₂]×100。

式中：CrI表示结晶度；I₀₀₂表示纤维素Ⅰ在2θ为22°~23°时结晶强度的最大值(对于纤维素Ⅱ，2θ为18°~22°)；I_am表示纤维素Ⅰ在2θ为18°~19°时结晶强度的最小值(对于纤维素Ⅱ，2θ为13°~15°)。

1.3.2.4 四级结构——比表面积

采用伊红美兰法测定样品的比表面积^[10-11]。玉米秸秆样品粉碎过40目，取0.2 g悬浮于25 mL美兰溶液中，恒温25 ℃，转速120 r/min，10 000 r/min离心15 min，取得上清液，在660 nm的波长下进行比色，测得溶液中美兰的含量，单位质量玉米秸秆样品吸附剂吸附美兰的量可引据下列公式计算出：

q=[(C₀-C_t)×V]/m。

式中：q表示单位质量玉米秸秆样品吸附美兰的量(mg/g)；C₀表示美兰的初始浓度(mg/L)；C_t表示t时刻美兰的浓度(mg/L)；V表示美兰溶液的体积(L)；m表示玉米秸秆样品的质量(g)。

S=q×a。

式中：S表示比表面积(m²/g)；q表示单位质量玉米秸秆样品吸附美兰的量(mg/g)；a为1 mg美兰覆盖固体的面积，对秸秆物质为2.45 m²。

1.4 数据统计分析

试验数据经过Excel 2007初步整理后，采用SPSS 21.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVE)检验程序进行差异显著性分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析 2.1 青贮玉米秸秆的营养成分

由表 2可以看出，与CS组相比，玉米秸秆发酵45 d以后，其他各组的NDF、ADF、纤维素、半纤维素、木质素含量均显著降低(P＜0.05)。CS组的DM、CP、NDF、ADF、纤维素、半纤维素含量显著高于CK组(P＜0.05)。与CK组相比，CPL组的NDF、ADF、纤维素、半纤维素、木质素含量差异不显著(P＞0.05)，CPLP和CPLB组的NDF、ADF、纤维素、半纤维素含量均显著降低(P＜0.05)。

2.2 青贮玉米秸秆的发酵品质

由表 3可以看出，各组玉米秸秆发酵后，pH均在4.2以下。与CK组相比，CPL组的NH₃-N/TN和乳酸/乙酸均显著降低(P＜0.05)，乳酸含量差异不显著(P＞0.05)；CPLB组的乳酸含量显著增加(P＜0.05)，CPLP和CPLB组的NH₃-N/TN和乳酸/乙酸均显著降低(P＜0.05)。各组均未检测到丙酸和丁酸。

2.3 青贮玉米秸秆的微观结构 2.3.1 一级结构——聚合度

由表 4可以看出，玉米秸秆发酵后，纤维素的聚合度具有差异性。CS组的聚合度显著高于CK组(P＜0.05)。与CK组相比，CPL组的聚合度无显著差异(P＞0.05)；CPLP、CPLB组的聚合度分别显著降低了38.92%、35.64%(P＜0.05)。

2.3.2 二级结构——氢键作用力

玉米秸秆二级结构的FTIR图谱如图 1所示。与CK组相比，CS组的-OH吸收峰、—CH₂吸收峰、C=O吸收峰振动较强。玉米秸秆经复合酶制剂、复合酶-单活菌、复合酶-双活菌发酵以后，各组在3 386 cm^-1为—OH伸缩振动、2 909 cm^-1为—CH的伸缩振动、1 098 cm^-1的结晶纤维素吸收峰、1 375 cm^-1的—CH(纤维素、半纤维素)弯曲振动及1 515 cm^-1、1 656 cm^-1与芳香环共轭的C=O的木质素特征吸收峰强度均减弱，说明秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素被降解，微观结构发生了改变。

2.3.3 三级结构——结晶度(XRD衍射)

由表 5可以看出，经过发酵以后，玉米秸秆的结晶度具有增加的趋势。结晶度从大到小依次为CPL组＞CPLB组＞CPLP组＞CK组＞CS组。玉米秸秆的XRD图谱如图 2所示。CPL、CPLP和CPLB组的101、002和004处晶面的衍射峰变宽，衍射强度明显增强，说明秸秆青贮后结晶度发生了改变。

2.3.4 四级结构——比表面积

纤维素的比表面积是表征纤维素微纤丝与纤维素降解酶分子间可接触面积大小的参量，对微生物及纤维素降解酶的可及性均有较大的影响^[10]。由表 6可以看出，玉米秸秆发酵以后，与CK组相比，CPL组的比表面积无显著差异(P＞0.05)，CPLP和CPLB组的比表面积显著增加(P＜0.05)，但是变化范围不大，其中CPLP组比表面积增加的最多。

3 讨论 3.1 青贮发酵作用对玉米秸秆营养成分及微观结构的影响

研究表明，秸秆青贮后变得柔软多汁，可以有效地保存秸秆原有的营养成分^[6]。本试验中，CS组的NDF、ADF、纤维素、半纤维素含量分别比CK组高21.97%、20.65%、26.22%和22.50%，木质素含量高2.75%。从微观结构来看，CS组的聚合度比CK组高13.18%，说明秸秆原料中的分子链排列紧密，糖苷键数目高于CK组，玉米秸秆青贮后内部的分子链发生了断链现象，造成聚合度降低^[12]。3 386 cm^-1出现的较宽的吸收峰是—OH伸缩振动引起的，主要由纤维素中的氢键产生；2 909 cm^-1处的吸收峰主要是来自纤维素—CH振动，1 730 cm^-1处的吸收峰是C=O弯曲振动引起，主要由半纤维素中的酰基和糖醛基产生；此外，1 515 cm^-1处的苯环伸展振动和1 656 cm^-1处的与芳香环共轭的C=O的振动吸收，是木质素的特征吸收峰^[13]。经FTIR分析后，青贮玉米秸秆的特征官能团的吸收峰发生了变化，—OH键振动减弱以及2 909、1 730、1 515、1 635 cm^-1的吸收峰强度均有所减弱，这与秸秆青贮前后的营养成分变化相一致。玉米秸秆中的纤维素包括结晶区和无定形区，结晶区的纤维素大分子链结构紧密，排列整齐，水解速度慢；无定形区的纤维素大分子链取向较差，结构疏松，容易水解^[14]。经XRD图谱分析，青贮玉米秸秆的101、002处的衍射峰变宽，结晶度由49.50%增加到50.07%，这说明秸秆纤维素的无定形区被优先利用，使秸秆纤维素的结晶度增加。同时，从纤维素的比表面积来看，青贮玉米秸秆纤维素的比表面积增加了2.20%，这说明青贮使玉米秸秆的表面产生了更多空洞，有利于纤维素降解酶及瘤胃微生物的吸附。

3.2 复合酶制剂对玉米秸秆营养成分及微观结构的影响

研究表明，优质的青贮具有较高的乳酸含量和较低的pH及NH₃-N、丁酸含量^[15]。NH₃-N/TN越高，说明青贮中的蛋白质和氨基酸分解越高，青贮饲料的质量越差。王玉荣^[11]发现，使用纤维素复合酶处理青贮水稻秸秆，可以显著降低青贮的pH及NH₃-N、NDF、ADF含量。本试验中，CPL组青贮玉米秸秆的pH、乳酸/乙酸和NH₃-N/TN显著降低，但是乳酸、NDF、ADF、纤维素、半纤维素含量无显著差异，这可能与原料种类、破碎程度有关。一般情况下，乳酸/乙酸大于3.0，被认为是同型发酵乳酸菌发酵，乙酸对真菌具有抑制作用，可以提高青贮饲料的有氧稳定性^[11]。研究表明，酶制剂可以针对性地降解秸秆结构^{[11, 16]}。李新平等^[17]研究表明，随着复合纤维素酶用量的增加，纤维素大分子链逐渐断裂，聚合度逐渐减小。本试验中，复合酶制剂组的聚合度低于青贮对照组，这可能是由于纤维素酶中的内切葡聚糖酶优先水解了纤维素分子链中的无定形区，随机水解β-1, 4糖苷键，纤维素分子链被切断^[18]。经FTIR分析，在青贮玉米秸秆中添加复合酶制剂，纤维素的特征吸收峰3 386、2 909 cm^-1，半纤维素的特征吸收峰1 730 cm^-1，木质素特征吸收峰1 656和1 515 cm^-1仍然存在，只是强度减弱。陈云玲^[19]对速生杨P-RC APMP进行纤维素酶、木聚糖酶、漆酶处理后，浆料表面的纤维素含量降低，—CH₂、C—O—C、—OH和C=O基团均受到了纤维素酶的破坏，其特征官能团的吸收峰强度降低，本研究结果与其一致。宋丽丽^[16]研究表明，酶解后玉米秸秆多孔性增加，增加了底物的粗糙度，纤维素酶液更容易浸润木质纤维素，使纤维素分子与底物的吸附性增强，木质纤维素的转化率得以提升。本研究发现，相较于CK组，CPL组的结晶度和比表面积具有增加的趋势，与Wang等^[20]研究结果一致。究其原因是生物制剂渗入到秸秆细胞壁内部，优先降解秸秆的无定形区，使木质素和半纤维素发生溶解，并去除部分无定形区的细小纤维，导致无定形区的面积减小，结晶度增加^[19]。Zheng等^[21]认为，结晶度提高是由于木质纤维分子发生有序重排，进行了次期结晶，使非结晶部分和晶体结构不完整部分继续结晶，从而使结晶度增大。

3.3 复合酶-菌制剂对玉米秸秆营养成分及微观结构的影响

在玉米秸秆青贮中添加纤维素降解酶和乳酸菌，有利于改善秸秆发酵和保存秸秆原有的营养成分^[22]。本试验中，相较于CK组，CPLP和CPLB组的乳酸含量升高，乳酸/乙酸降低，pH和NH₃-N/TN也显著降低，这与王奇等^[23]、韩立英等^[24]研究结果相似。这主要是二者充分发挥了各自的作用，不仅能增加乳酸发酵的碳源，还可以提高青贮发酵初期乳酸菌的数目，从而提高玉米秸秆青贮发酵品质。从营养成分来看，复合酶-活菌制剂显著降低了NDF、ADF、纤维素、半纤维素的含量，并且木质素含量也显著降低，说明纤维素降解酶和乳酸菌的协作有利于乳酸菌作用的发挥，从而抑制有害微生物的发酵，保存秸秆原有的营养成分，这与门宇新^[25]和顾拥建等^[26]研究结果一致。从微观结构变化分析，CPLP和CPLB组的聚合度显著低于CK组，这可能与复合酶制剂和乳酸菌制剂协同作用的性能叠加有关。由FTIR图谱得知，CPLP和CPLB组的—OH、—CH、C=O基团均受到明显地破坏，1 515 cm^-1处的木质素芳香族骨架振动和C—O苯环拉伸的特征吸收峰也明显减弱，此结果说明，经过复合酶-活菌制剂处理后，玉米秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素发生了改变或被降解，与玉米秸秆化学组成的变化一致^[18]。彭丹^[14]使用纤维素酶和降解真菌处理玉米秸秆，结果表明，玉米秸秆的结晶度降低，比表面积增大，纤维素降解菌丝穿入了纤维素的结晶区，破坏了结晶区的致密平行结构，形成了无定形结构。本研究结果与其不符，可能是与酶的活性、添加比例及原料的木质化程度及分子结构有关。本试验中，与CK组相比，复合酶-活菌制剂处理后的玉米秸秆的比表面积显著增加，其中以CPLP组增加的最多，这可能是由于纤维素降解酶进攻葡萄糖苷键，使秸秆受到不同程度地破坏，增加秸秆孔洞所致，这与Xu等^[27]、Zeng等^[2]研究结果一致。Nazarpour等^[28]研究表明，木质素经真菌降解后会增加底物的孔隙，为纤维素酶提供更多的接触面积。去除半纤维素中的乙酰基可以增加纤维素的内表面积和孔隙度，同时增加底物的润胀性，提高纤维素酶的降解率^[29]。

4 结论

① 复合酶制剂+活菌制剂处理玉米秸秆，NDF、ADF、纤维素、半纤维素含量显著降低，pH、NH₃-N/TN、乳酸/乙酸比例显著降低，改善了秸秆营养品质。

② 玉米秸秆经不同生物制剂处理，可有效破解秸秆的抗营养结构，降低纤维素中的非晶区域。复合酶制剂+活菌制剂处理可以使聚合度显著降低，氢键作用力减弱，结晶度、比表面积显著增加，秸秆细胞壁纤维素的微观结构发生了明显的改变。

③ 玉米秸秆4种纤维成分的降低与微观结构的聚合度降低、氢键作用力减弱、结晶度和比表面积增加相吻合，测定玉米秸秆的微观结构可以从分子层面阐述秸秆破壁的程度。