2. 珠海天香苑生物科技发展股份有限公司, 珠海 519000;
3. 华中农业大学水产学院, 武汉 430070;
4. 农业部饲料生物技术重点开放实验室, 北京 100081
, YU Huanhuan1, LIANG Xiaofang1, CHEN Pei1, CHEN Xuesong2, LU Cunren2, ZHENG Yinhua1, WU Xiufeng1, LIANG Xufang3, XUE Min1,4
2. Zhuhai Tianxiangyuan Biotech Holding Co., Ltd., Zhuhai 519000, China;
3. College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
4. Key Laboratory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
大口黑鲈(Micropterus salmoides)，又名加州鲈，隶属鲈形目(Perciforme)，太阳鱼科(Ceutrarchidac)，黑鲈属(Micropterus)。由于其具有生长快、病害少、耐低温、味道鲜美、营养丰富等优点，已成为我国养殖业中主要淡水鱼品种之一[1]。投喂人工配合饲料常引起大口黑鲈出现不同程度的肝脏疾病和厌食，从而导致生长性能的降低，目前大口黑鲈养殖中仍依赖冰鲜小杂鱼[2]。大口黑鲈的肝脏疾病已经成为限制其投喂人工配合饲料的重要因素之一，诱发大口黑鲈肝脏疾病的主要原因可能是氧化应激[3]、饲料中高水平的可消化碳水化合物(>19%)[4]和霉菌毒素等[5]。由于鱼类对糖的利用率较低，高糖饲料会引起肝糖原储积过剩和持久的高血糖[6]。已有研究表明高糖会引起鱼体肝脏的病变[7]。
酵母水解物(yeast hydrolysate，YH)是以新鲜啤酒酵母为原料，采用现代生物工程技术，经除杂、自溶、酶解、喷雾干燥等工艺精制而成的，其富含核酸、小肽、细胞壁多糖(免疫多糖)、游离氨基酸及丰富的B族维生素。氨基酸和小肽易于消化吸收，在动物蛋白质营养中优势显著，因此酵母水解物是一种理想的功能性蛋白质源[8]。本试验通过在基础饲料中添加5 g/kg酵母水解物，以生长性能、蛋白质沉积率、血浆生化指标、肝脏组织学病理及相关基因表达量的分析为依据，研究酵母水解物对大口黑鲈肝脏组织健康的影响。
1 材料与方法 1.1 试验鱼试验用水产靶动物为大口黑鲈，于2016年5月购自佛山市三水白金水产种苗有限公司。试验正式开始前，试验鱼在养殖系统中暂养1周，暂养期间投喂暂养饲料。
1.2 试验饲料采用低鱼粉基础饲料(目前商用大口黑鲈饲料中鱼粉使用量超过40%)作为对照，在此基础上添加5 g/kg的酵母水解物(由珠海天香苑生物科技发展股份有限公司提供)配制试验饲料，将2种饲料分别命名为YH0和YH5。物料经超微粉碎，均匀混合后，使用双螺杆挤压膨化机(洋工机械TSE65)挤压膨化，制成颗粒饲料，自然晾干后于-20 ℃储存备用。试验饲料组成及营养水平见表 1。
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表 1 试验饲料组成水平及营养水平 Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets |
试验在国家水产饲料安全评价基地(北京，南口)室内循环流水养殖系统中进行。随机挑选体质健康、个体均匀的大口黑鲈[平均初始体重为(28.50±0.01) g]，分配到容积为0.26 m3的圆锥形养殖桶中。本试验设计2个组，分别投喂饲料YH0和YH5，每组包含4个桶(重复)，每桶养殖20尾鱼。试验周期10周。每天表观饱食投喂2次，投喂时间分别为08:00和16:00。定期检测水质，水质条件保持在溶氧(DO)浓度>7.0 mg/L，总氨氮浓度 < 0.3 mg/L，pH=7.5~8.5，水温(23±1) ℃。
10周生长试验结束后，禁食24 h，然后分别对各桶鱼称重并统计摄食量、存活数，用于计算生长指标。每桶随机取4尾鱼，测量体长、体重、内脏重、肝脏重，用于计算形体指标。每桶随机取6尾鱼，三氯叔丁醇麻醉后尾静脉取血，采用氟化钠草酸钾抗凝剂，在4 ℃、4 000 r/min的条件下离心10 min，取上层血浆保存于-80 ℃冰箱中待测。
1.4 指标测定 1.4.1 生长指标各指标计算公式如下：
存活率(survival rate，SR, %)=100×Nt/N0；
增重率(weight gain rate，WGR, %)=100×(Wt-W0+Wd)/W0；
特定生长率(specific growth rate，SGR, %/d)=100×(lnW0-lnWt)/t；
饲料系数(feed conversion ratio，FCR)=C/(Wt+Wd-W0)；
摄食率(feeding rate，FR, %/d)=100×C/{[(W0+Wt+Wd)/2]/t}；
蛋白质沉积率(protein deposition rate，PDR, %)=100×(Wt×Wtp-W0×W0p)/(Wf×Wfp)。
式中：N0为初始鱼数量(尾)；Nt为终末鱼数量(尾)；W0为初始鱼体总重(g)；Wt为终末鱼体总重(g)；Wd为死亡鱼体总重(g)；C为摄食量(g)；Wtp为终末全鱼粗蛋白质含量(%)；W0p为初始全鱼粗蛋白质含量(%)；Wf为饲料投喂量(g)；Wfp为饲料粗蛋白质含量(%)；t为试验天数(d)。
1.4.2 形体指标各指标计算公式如下：
肥满度(condition factor，CF，g/cm3)=平均体重/平均体长3；
肝体比(hepatosomatic index，HSI，%)=100×肝脏重/体重；
脏体比(viscerasomatic index，VSI，%)=100×内脏重/体重。
1.4.3 常规营养成分饲料中的水分、粗灰分、粗蛋白质、粗脂肪和总能分别采用105 ℃常压干燥法(GB/T 6435—2006)、550 ℃灼烧法(GB/T 6438—2007)、凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)、全脂肪测定法(GB/T 6433—2006)和氧弹仪燃烧法测定。
1.4.4 血浆生化指标血浆中总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、葡萄糖(glucose，GLU)、总胆汁酸(total bile acid，TBA)、丙二醛(malondiadehyde，MDA)含量及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)活性均按照试剂盒说明书测定，所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.4.5 肝脏组织切片每个组随机取16尾鱼，解剖取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的肝脏组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。经脱水、透明后，石蜡包埋组织，切片厚度7 μm。之后，肝脏组织切片采取3种染色方式进行染色，包括苏木精-伊红(HE)染色、天狼星红胶原纤维染色及激活态半胱天冬酶免疫荧光染色，绿色荧光(Alexa Flour 488，山羊抗兔)显示凋亡细胞，核染色采用DAPI荧光染料。以共焦显微镜(Leica DM2500，Leica)进行观察拍照。
1.4.6 肝脏炎症和凋亡因子相关基因mRNA提取、反转录和表达量的分析用miRNasy Mini Kit试剂盒(TaKaRa)提取肝脏的总RNA。取1 μL RNA，采用超微量蛋白分析仪(Nanodrop2000, Thermo)检测光密度(OD)值，确保OD260/OD280在1.9~2.1并记录RNA浓度。反转录采用Prime Script RT Reagent Kit(Bio-Rad)试剂盒，于冰上操作。
荧光定量PCR反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，退火温度(TM)(每个引物退火温度如表 2所示)20 s，72 ℃ 40 s，35个循环(CFX96TM Real-Time System，Bio-Rad)。荧光定量PCR反应体系如下：SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L)1.0 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1.0 μL、RT反应液(cDNA溶液)2.0 μL，加灭菌蒸馏水(dH2O)至25 μL。
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表 2 大口黑鲈肝脏炎症和凋亡因子相关基因的荧光定量PCR引物 Table 2 Primer sequences for real-time quantitative PCR of inflammatory and apoptosis factor related genes in liver of largemouth bass |
将待测cDNA样品进行4倍梯度稀释。采用2-△△Ct法计算目标基因的相对表达量。
1.5 数据统计分析所有试验数据以平均值±标准误(mean±SE)的形式呈现，数据分析使用软件SPSS 20.0进行独立样本t检验(independent-sample t test)，以P < 0.05为差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 酵母水解物对大口黑鲈生长性能的影响酵母水解物对大口黑鲈生长性能的影响见表 3。结果显示，除YH5组的蛋白质沉积率显著高于YH0组(P < 0.05)外，大口黑鲈的其他生长性各组之间均无显著差异(P>0.05)。
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表 3 酵母水解物对大口黑鲈生长性能的影响 Table 3 Effects of yeast hydrolysate on growth performance of largemouth bass |
酵母水解物对大口黑鲈血浆生化指标的影响见表 4。结果显示，血浆中TG、TC、GLU、MDA、TBA含量以及AST和ALT活性各组之间均无显著差异(P>0.05)。YH5组血浆中AKP活性显著高于YH0组(P < 0.05)。
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表 4 酵母水解物对大口黑鲈血浆生化指标的影响 Table 4 Effects of yeast hydrolysate on plasma biochemical indices of largemouth bass |
肝脏组织切片表型统计结果见表 5。每组有16个样本量，各组肝脏均出现不同程度的损伤，主要表型为正常肝脏、脂肪肝(空泡化细胞)和纤维化肝脏。统计结果显示，YH0组有1尾显示严重纤维化、7尾具有脂肪肝表型、正常样本8尾。YH5组未见纤维化样本，7尾显示脂肪肝，其余9尾均正常。
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表 5 大口黑鲈肝脏组织切片表型统计 Table 5 Phenotypic statistics of histological sections of liver for largemouth bass |
大口黑鲈肝脏组织病理切片见图 1。HE染色结果可见纤维化肝脏中大面积组织坏死，脂肪肝样品表现大量空泡化细胞，核消失或移位。天狼星红胶原纤维染色结果在纤维化样本中可见大量红色的胶原信号，说明均为纤维化组织。正常和脂肪肝样本中胶原信号较低。在纤维化组织中显示较高的激活态半胱天冬酶3(caspase 3)信号，说明该表型下细胞凋亡严重高于脂肪肝和正常肝脏。大口黑鲈肝脏炎症和凋亡因子相关基因相对表达量结果(图 2)显示，与YH0组相比，YH5组肝脏中转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的相对表达量有下调的趋势(P>0.05)，肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和半胱天冬酶(caspase)家族基因的相对表达量各组间没有显著差异(P>0.05)。
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A：苏木精-伊红染色；B：天狼星红胶原纤维染色；C：免疫荧光法对激活态半胱天冬酶3染色(细胞凋亡信号)。肝脏组织纤维化和大范围信号凋亡(表型Ⅰ，图B中用绿色箭头标记和图C中用黄色箭头标记)，肝脂肪浸润(表型Ⅱ，图A中用红色箭头标记的强烈空泡化)和正常组织(表型Ⅲ)。 A: hematoxylin and eosin (HE) staining; B: sirius red staining of collagen fibers; C: cleaved-caspase 3 staining (apoptosis signal) by immunofluorescence method. Hepatic fibrosis and large scale apoptosis signals (phenotype Ⅰ, marked with green arrows in figure B and yellow color signal in figure C, hepatic steatosis (phenotype Ⅱ, intense vacuoles marked with red arrows in figure A) and normal tissues (phenotype Ⅲ). 图 1 大口黑鲈肝脏组织病理切片 Figure 1 Histopathologic sections of liver for largemouth bass |
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数据柱上标无字母表示差异不显著(P>0.05)。 Data columns with no letter mean no significant difference (P > 0.05). 图 2 大口黑鲈肝脏炎症和凋亡因子相关基因相对表达量 Figure 2 Liver inflammatory and apoptosis factor gene relative expression levels of largemouth bass (n=14) |
本研究显示，在饲料中添加5 g/kg的酵母水解物对大口黑鲈的成活率和增重率的影响无显著影响，但会显著提高鱼体的蛋白质沉积率。Oliva-Teles等[13]研究了啤酒酵母水解物在幼鲈(Dicentrarchus labrax)饲料中部分替代鱼粉对鱼体生长的影响，结果表明，用30%的啤酒酵母水解物替代鱼粉可以提高饲料效率及鱼体蛋白质沉积率，用50%的啤酒酵母水解物替代鱼粉对幼鲈的生长没有负面影响。Rumsey等[14]在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)上的研究发现，随着酵母提取物添加量的增加，鱼体氮沉积率也随之增加。这表明，添加一定量的酵母水解物有提高鱼体蛋白质沉积的作用。这可能是由于酵母水解物富含氨基酸和小肽，一些研究表明添加小肽之后会显著提高鱼体蛋白质保留效率[15-16]。鱼类饲料中的蛋白质不仅为氮沉积和利用提供氨基酸的来源，而且蛋白质中所含的小肽可以在消化道中随着消化过程而释放，其中具有生物活性的小肽可影响鱼类消化吸收和血液循环，从而影响机体对氨基酸的吸收与利用[17]。本试验所用的酵母水解物含有较高水平的氨基酸(40.6%)、β-葡聚糖(17.8%)和甘露聚糖(10.5%)，有研究表明在饲料中补充氨基酸可以提高大口黑鲈全鱼蛋白质含量[18]。葡聚糖、甘露聚糖和核苷酸均可以通过改善肠道微生物组成和组织结构，促进营养素吸收，提高鱼体免疫能力及生长性能[19-20]，从而影响鱼体对蛋白质的代谢。不同酵母水解物所含的有效成分有一定差别，除必需氨基酸外，酵母水解物的功能性物质主要为甘露聚糖、葡聚糖和核苷酸等益生物质。Yu等[19]确定花鲈饲料中酵母细胞壁最适添加量为500 mg/kg，其主要功能性成分葡聚糖和甘露聚糖的有效含量分别为140和120 mg/kg。本试验中，5 g/kg的酵母水解物中主要功能性成分β-葡聚糖和甘露聚糖含量达到890和525 mg/kg，因此酵母类产品在鱼类饲料中应用的过程中有效成分的含量是指导合理使用的前提。
3.2 酵母水解物对大口黑鲈血浆生化指标的影响血液生化指标的检测为鱼类营养水平、机体代谢及疾病诊断提供重要信息，是衡量鱼类健康状况的重要参考依据[21]。本研究显示，各组大口黑鲈血浆中TG、TC、GLU含量和AST活性均没有显著差异，且均在参考范围内。TC和TG是血液脂肪的组成成分，反映体内胆固醇以及饲料中脂类在动物体中吸收与代谢状况。本试验结果表明，血浆中TC、TG和GLU含量均无显著差异，表明饲料中添加5 g/kg的酵母水解物对大口黑鲈脂肪代谢和糖代谢均没有产生显著影响。MDA作为脂类物质氧化应激的最终产物，可以衡量机体内活性氧的水平和氧化应激的程度[22]，已有研究用MDA来反映机体受氧化损伤的程度[23-24]。本研究结果显示，血浆中MDA含量各组之间没有显著差异，表明在饲料中添加5 g/kg的酵母水解物对大口黑鲈并没有造成氧化性损伤。
血浆中TBA含量和AKP活性共同升高是胆汁淤积的重要指标，本研究中各组血浆中TBA含量没有显著差异，血浆中AKP活性单独升高可能与梗阻性黄疸有关[25]。正常生理条件下血浆中ALT和AST活性很低，当动物肝细胞受损时其活性会显著升高，升高程度与肝细胞受损程度相一致[26]，血浆中ALT和AST活性的升高可以作为肝损害和慢性肝炎的指标[26-27]。本研究显示，血浆中TBA含量以及ALT和AST活性各组之间均没有显著差异，YH5组血浆中AKP活性虽然显著高于对照组，但并未见其他胆汁酸代谢障碍的指标异常，饲料中添加5 g/kg酵母水解物是否会引起胆汁淤积症尚需进一步研究。
3.3 酵母水解物对大口黑鲈肝脏组织结构的影响本研究针对大口黑鲈肝脏进行了病理学分析，从大口黑鲈的肝脏组织切片可以看出，各组的肝脏均出现了不同程度的损伤，对照组出现1尾肝脏纤维化。各组肝脏均出现损伤的原因可能与饲料中含有相对较高水平的碳水化合物有关。徐祥泰等[28]报道，饲料中淀粉含量高于10%即有可能导致大口黑鲈肝脏病变。谭肖英等[29]报道，大口黑鲈饲料中含有15%~23%的碳水化合物主要影响大口黑鲈内脏器官的相对质量及肝脏的营养成分组成。
通常认为组织的纤维化是由于正常伤口愈合失败所导致的[30]。组织受损后，需要形成新的结缔组织，在此过程中需要成纤维细胞的活化、增殖并迁移到伤口处[31]。处于损伤处的成纤维细胞是由特定的肌成纤维细胞形成的，而肌成纤维细胞在α-SMA中高表达，成纤维细胞可以使损伤处愈合，肌成纤维细胞存在于纤维化病变过程中，会导致组织的纤维化[30]。此外，组织的损伤愈合是在一系列促纤维化细胞因子与抗纤维化细胞因子相互作用下完成的，主要包括转化生长因子-β(TGF-β)和TNF-α等[32]。在组织损伤愈合的过程中促炎因子TNF-α在巨噬细胞中表达[33]。肝癌患者的肝组织中TNF-α阳性细胞数量增加，预示着TNF-α可能会促进肝脏的纤维化[34]。肝脏的纤维化是由一系列刺激引起的慢性炎症反应的结果，包括持续性感染、自身免疫反应、化学损伤、组织损伤和氧化应激，其中氧化应激会提高线粒体通透性并促进肝细胞损伤和肝脏纤维化[35]。此外，TNF-α可以导致肝细胞凋亡并引起肝细胞损伤或肝脏癌症[36]。TGF-β1可以抑制多种类型细胞的生长与分化，调节免疫和炎症反应，调节伤口愈合[37]。TGF-β1抑制促炎反应，被认为是一种抗炎因子[38]。有研究表明TGF-β1的下调抑制肝脏干细胞的活化和肝脏纤维化的发展[39]。
caspase家族是通过调节细胞凋亡和炎症反应来维持体内平衡的重要基因家族，其中凋亡通路通常分为外在途径和内在途径的细胞凋亡。外在细胞凋亡途径的激活是通过将配体绑定在死亡结构域上，例如TNF-α超家族及其受体，从而激活半胱蛋白酶8(caspase 8)和半胱蛋白酶10(caspase 10)，通过启动caspase 3启动细胞凋亡[40]。内在细胞凋亡途径被称为线粒体凋亡。首先，有利于线粒体通透性的氧化应激诱导线粒体功能障碍[41]。线粒体功能障碍在凋亡信号通路中发挥着重要作用，伴随着凋亡信号通路ROS的增强，导致脂质过氧化物的积累和细胞色素C释放到细胞质中[42]。然后，通过各种细胞应激反应激活半胱氨酸蛋白酶9(caspase 9)，线粒体细胞凋亡途径被激活。最后，活化的caspase 9通过激活启动肝细胞凋亡和纤维化，切割和激活caspase 3[40]。本研究中，因只有1个样本存在明显的凋亡信号，2组大口黑鲈脂肪肝样本发生几率一致，且尚未观察到大量的凋亡细胞，这可能是2组间在炎症和凋亡通路相关基因表达方面没有显著差异的主要原因。YH5组肝脏中TGF-β1的相对表达量较对照组有下调的趋势，可能是该组未见纤维化样本的原因之一。
4 结论在大口黑鲈饲料中添加5 g/kg的酵母水解物可促进大口黑鲈鱼体蛋白质沉积，并有降低肝细胞纤维化风险的趋势。
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