高产奶牛尤其是泌乳高峰期的奶牛，由于较高的营养需求和代谢水平，通常伴随着自由基类代谢产物的增加。过量的自由基可以诱导动物机体产生脂质过氧化，引起细胞膜结构和功能的改变，造成机体的抗氧化应激能力、免疫功能及炎症应答能力下降，使奶牛对疾病的易感性增强。研究表明，从妊娠后期到围产期和泌乳高峰期，奶牛氧化应激水平的进程性提高是导致免疫功能障碍的主要原因[1-2]。因此，深入探讨奶牛机体的氧化应激发生机制、减缓氧化应激的发生、提高其免疫功能对保障奶牛的健康生产具有重要的理论与实际意义。一氧化氮(NO)是生物体内的一种气体信号分子和活性氮自由基，存在于多种细胞(如巨噬细胞、肝细胞、肌细胞和内皮细胞等)中，主要具有免疫调节、神经信号传递、血压生理调控和血小板凝聚抑制等生理功能[3]。研究证实，NO的浓度与机体多种信号通路的活性和炎症反应有关，低剂量的NO对维持机体免疫功能、血流量、血小板凝集反应和神经传递等内环境的稳定具有重要的生理作用，而过多的NO通常伴随有炎症和免疫紊乱。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在生理情况下不表达，而在炎症状态下iNOS被激活产生大量NO，导致组织损伤，加剧炎症进程[4]，由此得出，NO的过量产生可能是引起奶牛氧化应激产生的原因之一。本课题组的前期研究表明，高剂量二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)使奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)产生明显的氧化应激反应，并已成功建立NO诱导的BMEC氧化损伤模型[5]。奶牛外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是一类重要的免疫效应细胞，能够反映机体感染及疾病的发生，其抗氧化应激能力与奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相关。目前，关于PBMC氧化应激发生机制的研究报道较少。有研究认为，分布于巨噬细胞的iNOS在机体的免疫应答后激活并产生过量的NO，是引起PBMC氧化应激和机体炎症反应加剧的原因之一[6]。鉴于此，本研究以DETA/NO为NO供体，筛选NO的作用浓度与作用时间，建立奶牛体外PBMC的NO损伤模型，为通过体外法揭示奶牛PBMC的氧化应激机制，进一步缓解高产奶牛氧化应激提供基础性理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料PBMC，采用单次密度梯度离心分离法分离培养制备；RPMI-1640基础培养基，购自美国Gibco公司；台盼蓝、牛PBMC分离液，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；DETA/NO，购自美国Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)，购自上海碧云天生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，购自美国HyClone公司。
1.2 DETA/NO培养液的配制准确称取10 mg DETA/NO溶于612.8 μL的超纯水中，配制成浓度为0.1 mol/L的母液，配制方法参照本课题组前期试验[5]。再将DETA/NO母液按试验要求配制成不同浓度(0、50、100、200、300、500 μmol/L)的DETA/NO贮备液。取不同浓度的DETA/NO贮备液加入到RPMI-1640基础培养基中，配制成DETA/NO终浓度分别为0、50、100、200、300、500 μmol/L的细胞培养液。各细胞培养液中除DETA/NO浓度不同外，其他成分均相同。将上述细胞培养液经22 μm的过滤器过滤，现用现配，避光保存。
1.3 PBMC的培养本试验利用单次密度梯度离心分离法分离培养PBMC，分离培养方法参照天津灏洋TBD牛PBMC分离液说明书。健康奶牛尾静脉采血后，12 h内进行PBMC分离。将血液样本用RPMI-1640基础培养基稀释1倍后，小心地将血液加于牛PBMC分离液上方，15 mL离心管中稀释后血液与分离液比例为1 : 1，400~500×g分离40 min(离心机温度低于25 ℃, 细胞获得率高低与室温有关，超过25 ℃时会影响细胞获得率)，离心后由上至下分为4层，第1层为血浆层，第2层为环状乳白色PBMC层，第3层为透明分离液层，第4层为红细胞层。吸取第2层，并用PBS重悬清洗细胞，250×g离心10 min后弃上清，重复清洗细胞2次后，将细胞接种于25 cm2培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，培养68 h后将细胞离心后收集进行后续试验。在细胞培养结束前4 h取部分细胞用台盼蓝进行染色并计数活细胞数( > 95%)
1.4 试验设计试验分为2个部分。试验1采用单因子完全随机试验设计，将细胞离心后重悬于不同浓度的DETA/NO培养液中，以6×106个/mL的密度接种于96孔培养板中，并随机分为30个组，每组8个重复，细胞培养液中DETA/NO的终浓度分别为0、50、100、200、300、500 μmol/L，并在37 ℃下分别作用2、4、6、8、12 h，通过测定其对细胞存活率的影响，初步筛选DETA/NO适宜的作用时间，其中以0 μmol/L为对照组。试验2采用单因子完全随机试验设计，将培养后得到的PBMC以6×106个/mL的密度接种于24孔培养板中，并随机分为6个组，每组6个重复，细胞培养液中DETA/NO的终浓度分别为0、50、100、200、300、500 μmol/L，在37 ℃下以试验1筛选得出的DETA/NO适宜作用时间为DETA/NO的处理时间，通过检测细胞培养液抗氧化指标和炎症因子，进一步筛选出DETA/NO的适宜作用浓度，其中以0 μmol/L为对照组。
1.5 样品采集与处理将24孔培养板中的细胞培养液以重复为单位，分别收集于1.5 mL Eppendorf离心管中，于4 ℃、10 000×g离心5 min，收集上清液用于抗氧化指标与炎症因子的测定，样品采集与处理方法参照本课题组前期相关试验[7]。
1.6 测定指标与方法 1.6.1 细胞存活率采用CCK-8法检测细胞存活率，以吸光度值反映细胞的数量[8]。按照试验1的试验设计将细胞悬液以6×106个/mL的密度接种于96孔培养板，100 μL的细胞悬液加入CCK-8的体积为10 μL，避光37 ℃孵育4 h后在波长450 nm处检测各孔的吸光度值(OD450 nm)，各组的细胞存活率用相对于对照组OD450 nm的百分比表示。对照组的细胞存活率表示为100%。
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抗氧化指标：超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用比色法测定，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性采用二硫代二硝基苯甲酸法测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，操作步骤按照试剂盒说明书进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
炎症因子：NO、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量均采用双抗体夹心法测定，具体操作按照试剂盒说明书进行，试剂盒购自美国R&D公司。
1.7 数据统计与分析试验数据用Excel 2007进行初步整理，采用SAS 9.0统计软件中的ANOVA程序进行单因素方差分析，应用Duncan氏法进行多重比较，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 DETA/NO作用浓度与作用时间对PBMC存活率的影响由表 1可以看出，与对照组相比，作用时间为4~12 h时，所有作用浓度的DETA/NO对PBMC存活率均具有显著的降低作用(P < 0.05)，且随着DETA/NO作用浓度的增加，PBMC存活率呈逐渐的降低趋势。作用时间为4 h时，DETA/NO作用浓度为50、100 μmol/L时，PBMC存活率组间差异不显著(P > 0.05)，但数值上有下降的趋势；DETA/NO作用浓度为200~500 μmol/L时，PBMC存活率随作用浓度的增加显著下降(P < 0.05)；作用浓度为300、500 μmol/L时PBMC存活率分别为59.3%和47.7%，显著低于作用浓度为50、100和200 μmol/L时(P < 0.05)，作用浓度为50、100和200 μmol/L时PBMC存活率均在70%以上。作用时间为6、8 h的各浓度组中，100~500 μmol/L组作用6 h时PBMC存活率为30.9%~54.1%，作用8 h时PBMC存活率为22.1%~52.6%，均显著低于对照组和50 μmol/L组(P < 0.05)；作用时间为12 h的各浓度组中，100~500 μmol/L组PBMC存活率为22.5%~50.4%，显著低于对照组和50 μmol/L组(P < 0.05)。当DETA/NO作用浓度为50 μmol/L时，作用时间分别为2、4、6 h时，PBMC存活率均在80%以上，当作用时间延长至8、12 h时，PBMC存活率降低，分别为76.8%、75.8%。当DETA/NO作用浓度分别为300、500 μmol/L时，随着DETA/NO作用时间的延长，PBMC存活率分别由2 h的83.7%、79.5%均降低至60%以下，最低降到22.1%。
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表 1 DETA/NO作用浓度与作用时间对PBMC存活率的影响 Table 1 Effects of action concentration and time of DETA/NO on PBMC survival rate |
由表 2可以看出，不同浓度的DETA/NO作用4 h后，SOD活性随着DETA/NO作用浓度的增加呈下降趋势。当DETA/NO作用浓度为50 μmol/L时，SOD活性相比对照组差异不显著(P > 0.05)；当DETA/NO浓度为100~500 μmol/L时，SOD活性相比对照组显著降低(P < 0.05)，且DETA/NO作用浓度为200~500 μmol/L时的SOD活性还显著低于DETA/NO作用浓度为50 μmol/L时(P < 0.05)，尤以作用浓度为500 μmol/L时SOD活性最低。GPx和CAT活性呈现与SOD活性相似的变化规律，MDA含量则呈现与SOD活性相反的变化规律，且以作用浓度为DETA/NO 500 μmol/L时GPx和CAT活性最低，MDA含量最高。
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表 2 DETA/NO作用浓度对PBMC抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of DETA/NO action concentration on antioxidant parameters of PBMC |
由表 3结果可以看出，不同浓度的DETA/NO作用4 h后，随着DETA/NO作用浓度的增加TNF-α含量逐渐升高，以500 μmol/L组TNF-α含量最高；DETA/NO作用浓度为50~500 μmol/L时的TNF-α含量相较对照组均显著上升(P < 0.05)。NO、IL-1、IL-6含量与TNF-α含量呈现相似的变化趋势，但DETA/NO作用浓度为50 μmol/L时IL-1含量与对照组相比在数值上呈上升趋势，但差异未达显著水平(P > 0.05)。
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表 3 DETA/NO作用浓度对PBMC炎症因子含量的影响 Table 3 Effects of DETA/NO action concentration on inflammatory cytokine contents of PBMC |
NO是生物体内的一种气体信号分子和活性氮自由基，介导多种生物功能，如宿主防御、血管舒张等[9]。NO是由L-精氨酸向L-瓜氨酸转化过程中生成的，并通过一氧化氮合酶(NOS)内源合成。巨噬细胞来源的NO在生理、病理和炎症反应中起重要作用，然而NO的过量产生引发机体炎症反应及氧化应激[10]。DETA/NO是人工合成的NO/核苷化合物，无需酶催化便能迅速释放NO且半衰期长，有利于体外试验的长时程观察，是较为理想的外源性NO供体[11]。因此，以DETA/NO为NO供体，诱导PBMC建立氧化损伤模型，可为科学调控奶牛抗氧化能力及机制研究提供理想的试验平台。
周丽娜等[12]的研究指出，细胞死亡率为20%~30%可以作为建立小鼠脊髓神经元细胞氧化应激模型的评判标准。Huo等[13]报道，在小鼠的心肌细胞中，选取细胞存活率为40%~50%作为过氧化氢(H2O2)氧化损伤模型的依据。孙婧陶等[14]指出，以细胞死亡率为50%~60%作为建立延边奶山羊BMEC氧化损伤模型的判别标准。叶新平等[15]在人的体外淋巴细胞损伤试验中，使用低浓度乙醇建立了氧化损伤模型，将乙醇对淋巴细胞的抑制率控制在10%。郭咏梅等[5]在用DETA/NO建立BMEC损伤模型时，将细胞死亡率控制在20%~30%作为判断标准。根据上述研究报道可知，由于细胞种类及使用的刺激源不同，细胞对氧化损伤的耐受能力也不相同，在选择细胞损伤标准上也存在差异。
本试验初步确定将细胞死亡率控制在20%~30%作为判断标准，结果表明，当DETA/NO作用4 h后，50、100 μmol/L组的PBMC存活率分别为89.9%和87.2%，而200 μmol/L组的PBMC存活率表现出显著下降，为72.3%。在全部浓度组中以细胞存活率控制在70%~80%内的DETA/NO作用浓度与作用时间可供参考的是：50 μmol/L作用8或12 h，PBMC存活率分别为76.8%和75.8%；200 μmol/L作用4 h，PBMC存活率为72.3%；500 μmol/L作用2 h，PBMC存活率为79.5%。
DETA/NO作用时间为2 h时，各浓度组的PBMC存活率随着作用浓度的增加在数值上有下降的趋势，除500 μmol/L组PBMC存活率为79.5%外，其余各组PBMC存活率均在80%~90%之间，表现为细胞在不同浓度的DETA/NO处理下仍保持较好的生长状况和细胞活力，即PBMC对DETA/NO的氧化损伤具有较好的耐受性；但考虑到作用浓度过高不适合作为DETA/NO损伤的适宜作用浓度。另外，当DETA/NO作用时间为12 h时，尽管50 μmol/L组PBMC存活率为75.8%，但作用时间过长，不便于试验进行。200 μmol/L DETA/NO作用4 h，可使PBMC存活率降低至72.3%，综合作用时间不宜过长、作用浓度不宜过高，初步筛选DETA/NO作用4 h即可使PBMC的氧化应激达到较为理想的损伤效果，便于后续试验继续对DETA/NO的作用浓度进行合理筛选。
活性氧物质的生物效应在体内受到多种酶和非酶防御机制的控制，SOD、CAT、GPx活性及MDA含量可反映出细胞是否受到氧化损伤以及细胞的氧化损伤程度[16]。NO、IL-1、IL-6、TNF-α是当机体发生氧化应激后产生的常见的炎症因子，测定这些炎症因子含量可以进一步反映细胞氧化损伤的程度[17]。因此，细胞氧化应激模型的建立，除了以细胞存活率作为判别指标外，细胞的抗氧化指标和炎症因子含量的变化也是非常关键的判别指标。通过本试验的结果可以看出，与对照组相比，当DETA/NO作用时间为4 h、作用浓度为100~500 μmol/L时，即可引起SOD、CAT、GPx活性显著下降，MDA含量显著升高；当DETA/NO作用时间为4 h、作用浓度为50 μmol/L时，即可引起NO、IL-6、TNF-α含量显著上升。如前所述，引起PBMC存活率达到70%~80%的DETA/NO作用浓度为200 μmol/L、作用时间为4 h，因此，结合以上抗氧化指标与炎性因子的结果可以得出，以DETA/NO为外源刺激源作用于PBMC时，当其作用浓度为200 μmol/L、作用时间为4 h时，即可引起PBMC的氧化应激损伤和抗氧化能力降低，并增强炎症反应。
4 结论以DETA/NO为刺激源，其在37 ℃下诱导PBMC建立PBMC氧化损伤模型的适宜作用浓度和作用时间分别为200 μmol/L和4 h。
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