2. 四川农业大学动物医学院, 动物生物技术中心, 成都 610043
, CHEN Daiwen1, TIAN Gang1, HE Jun1, ZHENG Ping1, MAO Xiangbing1, YU Jie1, HUANG Zhiqing1, LUO Junqiu1, LUO Yuheng1, ZHU Ling2, YU Bing1
2. Animal Biotechnology Center of Sichuan Province, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 610043, China
为了获得更高的经济效益，仔猪早期断奶已成为现代养猪生产常用的重要技术之一。然而，早期断奶仔猪肠道发育不完善，易受饲粮、环境和心理等因素的影响，进而易遭受病原微生物的侵害引起肠道结构和功能的损伤，导致仔猪腹泻和死亡[1]。产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是导致仔猪腹泻和死亡的主要病源性致病因子之一[2-3]。已有研究表明，ETEC感染会引起幼龄动物抗氧化能力降低，尤其是肠道细胞抗氧化酶活性的降低，促进脂质过氧化反应，从而破坏肠黏膜的完整性及功能，且这一过程可能是ETEC导致仔猪腹泻的重要机制之一[4-5]。饲粮中添加饲用抗生素是预防断奶仔猪腹泻的一种常用技术手段，但是抗生素长期大量使用会造成动物机体免疫力下降、细菌耐药性增强以及抗生素残留等诸多问题，严重危害人类健康[6-7]。因此，寻找一种安全、高效的抗生素替代品或替代技术显得十分重要。
前人研究发现，苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油均具有较强的抗氧化能力，并对多种应激源诱导的氧化损伤具有显著缓解作用，具有替代抗生素的可能性。Chang等[8]研究发现，苯甲酸含有羧基能够清除机体内自由基，中断自由基链式反应，抑制脂质过氧化，缓解氧化损伤。Kodali等[9]研究表明，凝结芽孢杆菌可以清除机体产生的活性氧(ROS)，抑制产生ROS的微生物，增强机体抗氧化能力。牛至油是从植物牛至中提取的一种挥发油，主要有效成分是香芹酚和百里香酚[10]。百里香酚含有苯酚羟基基团，可为脂肪氧化第一步产生的过氧化氢基团提供氢供体，延缓氢过氧化物的形成[11]。此外，牛至油进入动物机体后可激活抗氧化酶系统，提高抗氧化酶活性，增强机体清除氧自由基的能力，从而提高机体抗氧化能力[12]。但是，生产中发现苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油单独添加作用有限，且结果变异较大。近年来，有机酸、益生菌和精油在动物饲粮中组合添加的“协同”和“加性”效应已引起广泛关注[13-14]。但是，尚缺乏关于苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油在饲粮中组合添加缓解大肠杆菌攻毒诱导仔猪氧化应激的报道。因此，本研究根据苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油具有的抗氧化功能，将它们组合添加，初步考察其对大肠杆菌攻毒条件下仔猪生长性能、抗氧化能力、空肠黏膜二糖酶活性和养分转运载体mRNA表达的影响，以期为3种添加剂的合理使用积累资料，也可为仔猪饲用抗生素替代品的研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料苯甲酸：帝斯曼(中国)有限公司生产，纯度99.5%，推荐剂量3 000～5 000 g/t；凝结芽孢杆菌：昆明三正集团惠赠，含量5×109 CFU/g，推荐剂量200～400 g/t；牛至油：珠海建明工业有限公司惠赠，主要有效成分香芹酚和百里香酚含量分别大于2.2%和1.1%，推荐剂量300～500 g/t。
1.2 试验设计选取20头平均体重(7.64±0.46) kg健康的(24±1)日龄“杜×长×大”断奶仔猪，按体重相近原则，随机分为对照组(CON组)、大肠杆菌组(ETEC组)、抗生素组(AT组)和复合添加剂组(ABO组)4个组，每组5个重复，每个重复1头猪。CON和ETEC组饲喂基础饲粮，AT和ABO组分别饲喂在基础饲粮中添加抗生素(20 g/t硫酸黏菌素+40 g/t杆菌肽锌)和复合添加剂(3 000 g/t苯甲酸+400 g/t凝结芽孢杆菌+400 g/t牛至油)的试验饲粮。试验第22天早上，ETEC、AT和ABO组仔猪每头灌服含3×1011 CFU大肠杆菌的培养液，CON组仔猪灌服相同剂量的无菌培养液，试验期共26 d。
1.3 试验饲粮基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，参照NRC(2012)7～25 kg断奶仔猪营养需要配制而成，其组成及营养水平见表 1。试验饲粮由相应的添加剂产品等量替代基础饲粮中的玉米构成。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验在四川农业大学动物营养研究所实验基地进行。试验期间，仔猪自由饮水，每日饲喂4次(08:00、12:00、16:00、20:00)，少喂勤添，饲喂量以猪只吃饱后料槽内略有剩余为度。圈舍温度控制在25～28 ℃，相对湿度60%～70%。试验仔猪按是否用大肠杆菌攻毒处理分别饲养于2间代谢室，防止交叉感染。
1.5 大肠杆菌培养与感染本试验所用的大肠杆菌菌株为ETEC，由四川农业大学动物医学院生物技术中心重点实验室提供，其血清型包括O149、K88和K91。在试验第22天早上仔猪空腹称重后进行攻毒，攻毒组每头仔猪通过胃导管灌服含3×1011 CFU(浓度为1×109 CFU/mL)大肠杆菌培养液，未攻毒组仔猪灌服同等剂量的无菌培养液。
1.6 样品采集与处理试验第27天早上仔猪空腹称重后，前腔静脉采血20 mL，置于普通离心管，室温下放置30 min，3 500 r/min离心10 min，分离血清，置于-20 ℃保存，待测血清抗氧化指标。采血后，所有仔猪麻醉致死后迅速打开腹腔分离肠道，将空肠从其肠系膜处取下后于冰上取样。于空肠1/2处截取20 cm左右肠段，纵向剖开，用预冷生理盐水轻轻冲洗除去肠壁上的内容物，放置于滤纸上吸干水分，用载玻片沿同一方向轻轻刮取黏膜，装入EP管中，用锡箔纸包好，液氮速冻后-80 ℃保存待测。
1.7 测定指标与方法 1.7.1 生长性能以重复为单位，于试验开始后第1和27天早晨对试验猪进行空腹称重，记录每日采食量，计算仔猪平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)、平均日增重(average daily gain，ADG)和料重比(feed/gain，F/G)。
1.7.2 腹泻指标大肠杆菌攻毒后，每天观察并记录每个组仔猪腹泻状况，用于腹泻指数和腹泻率计算。粪便评分标准见表 2。当粪便评分大于或等于2时定义为仔猪腹泻。腹泻率和平均腹泻指数的计算，分别参照Yuan等[15]和廖波[16]。计算公式如下：
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表 2 腹泻评判标准 Table 2 Standard of diarrhea score |
腹泻率(%)=[试验期腹泻头次/(试验仔猪头数×试验天数)]×100；
腹泻指数=总腹泻评分/(试验仔猪头数×试验天数)。
1.7.3 血清和肠道抗氧化能力血清和肠道中总抗氧化能力(total antioxidant capability，T-AOC)，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和总超氧化物岐化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定，操作均按说明书进行。空肠黏膜匀浆操作如下：用精密电子天平称取各组空肠黏膜1 g左右，按重量:体积=1 : 9的比例加入提前预冷的生理盐水，置冰上匀浆后，匀浆液于冷冻离心机中按不同指标要求转速离心，取上清液用于T-AOC，GSH-Px、T-SOD活性及MDA含量测定。
1.7.4 空肠黏膜二糖酶活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行空肠黏膜蔗糖酶和麦芽糖酶活性测定。样品测定之前需进行匀浆预处理，称取0.5 g空肠黏膜样品，按重量:体积=1 : 9的比例加入预冷的生理盐水，冰浴条件下进行匀浆，匀浆液于4 ℃冷冻离心机中3 500 r/min离心10 min，取上清液用于蔗糖酶和麦芽糖酶活性测定。
1.7.5 空肠黏膜养分转运载体mRNA表达水平采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测空肠黏膜钠-葡萄糖共转运载体1(sodium-glucose cotransporter 1, SGLT1)、葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter type 2, GLUT2)和寡肽转运蛋白1(oligopeptide transporter 1, PepT1)mRNA表达水平。
空肠黏膜总RNA提取按照试剂盒(Trizol Reagent，TaKaRa，日本)操作说明进行，RNA浓度采用核酸蛋白检测仪(Beckman Du-800，CA，美国)检测。A260/A280表示的是RNA的纯度，该比值位于1.8～2.0之间表明RNA纯度较好。cDNA合成采用逆转录试剂盒(PrimeScriptTM reagent kit，TaKaRa，日本)进行，具体操作步骤参照说明书进行，反应结束后-20 ℃保存备用。利用NCBI搜索目的基因片段，运用Primer 5、Oligo 6.0进行引物设计，由大连宝生生物公司合成，引物序列及退火温度见表 3。用实时定量PCR仪(ABI7900HT Real-Time PCR System，ABI，美国)进行测定，RT-qPCR反应体系为10 μL：5 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×) (TaKaRa，日本)，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，3.2 μL双蒸水，1 μL cDNA模板。PCR扩增条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，适宜的退火温度30 s，共40个循环，95 ℃ 10 s。熔解曲线：55～95 ℃，温度以0.5 ℃/s速率提升。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参基因，相对荧光定量计算采用2-ΔΔCt法[17]。
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表 3 RT-PCR引物序列及退火温度 Table 3 Primer sequences and anneal temperature for real-time PCR |
试验数据先用Excel 2013进行初步整理，然后采用SPSS 17.0统计软件的独立t检验程序检测CON和ETEC组之间的差异；大肠杆菌攻毒组(ETEC、AT和ABO组)数据先进行单因素方差分析，然后用Duncan氏法进行多重比较。所有数据均以“平均值和均值标准误(SEM)”表示，以P < 0.05为差异显著，0.05≤P≤0.10为有趋势。
2 结果 2.1 复合添加剂对大肠杆菌攻毒仔猪生长性能的影响由表 4可知，试验全期各组仔猪ADFI无显著差异(P>0.05)。与CON组相比，ETEC组仔猪ADG降低了9.91%(P>0.05)，F/G增加了5.11%(P>0.05)。与ETEC组相比，ABO组仔猪ADG显著提高(P < 0.05)，F/G显著降低(P < 0.05)。与AT组相比，ABO组仔猪ADG提高了17.21% (P>0.05)，F/G降低了5.29% (P>0.05)。
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表 4 复合添加剂对大肠杆菌攻毒仔猪生长性能的影响 Table 4 Effects of compound additive on growth performance of piglets challenged with Escherichia coli |
由表 5可知，在试验第22～26天(攻毒后)，与CON组相比，ETEC组仔猪腹泻率和腹泻指数显著提高(P < 0.05)。与ETEC组相比，ABO组仔猪腹泻率和腹泻指数显著降低(P < 0.05)，AT组腹泻率和腹泻指数一定程度降低(P>0.05)。与AT组相比，ABO组仔猪腹泻指数显著降低(P < 0.05)。
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表 5 复合添加剂对大肠杆菌攻毒仔猪腹泻的影响 Table 5 Effects of compound additive on diarrhea of piglets challenged with Escherichia coli |
由表 6可知，与CON组相比，ETEC组仔猪血清和空肠黏膜MDA含量显著提高(P < 0.05)，血清T-AOC和T-SOD活性显著降低(P < 0.05)，有降低空肠黏膜T-AOC和T-SOD活性趋势(P < 0.10)。与ETEC组相比，ABO组仔猪血清和空肠黏膜T-AOC和T-SOD活性显著升高(P < 0.05)，血清和空肠黏膜MDA含量显著降低(P < 0.05)；AT组血清T-AOC活性显著升高(P < 0.05)。与AT组相比，ABO组仔猪血清T-AOC活性显著提高(P < 0.05)。各组仔猪血清和空肠黏膜GSH-Px活性均无显著差异(P>0.05)。
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表 6 复合添加剂对大肠杆菌攻毒仔猪血清和空肠黏膜抗氧化能力的影响 Table 6 Effects of compound additive on antioxidant capacity in serum and jejunal mucosa of piglets challenged with Escherichia coli |
由表 7可知，各组仔猪空肠黏膜麦芽糖酶和蔗糖酶活性差异均不显著(P>0.05)。与CON组相比，ETEC组仔猪空肠黏膜麦芽糖酶和蔗糖酶活性分别降低了21.18%和9.46%；与ETEC组相比，ABO组仔猪空肠黏膜麦芽糖酶和蔗糖酶活性分别提高了26.17%和8.59%。
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表 7 复合添加剂对大肠杆菌攻毒仔猪空肠黏膜二糖酶活性的影响 Table 7 Effects of compound additive on disaccharidase activities in jejunal mucosa of piglets challenged with Escherichia coli |
由表 8可知，与CON组相比，ETEC组仔猪空肠黏膜SGLT1 mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)。与ETEC组相比，ABO组仔猪空肠黏膜SGLT1和PepT1 mRNA表达水平显著提高(P < 0.05)，AT组空肠黏膜PepT1 mRNA表达水平显著提高(P < 0.05)。然而，各组仔猪空肠黏膜GLUT2 mRNA表达水平均无显著差异(P>0.05)。
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表 8 复合添加剂对大肠杆菌攻毒仔猪空肠黏膜养分转运载体mRNA表达的影响 Table 8 Effects of compound additive on nutrient transporter mRNA expression in jejunal mucosa of piglets challenged with Escherichia coli |
本试验利用大肠杆菌攻毒建立仔猪腹泻模型发现，大肠杆菌攻毒导致仔猪ADG降低9.91%，F/G增加5.11%，结果与前人报道结果[18]基本一致。其可能原因，一方面与大肠杆菌攻毒后营养物质从促进机体生长转移到支持机体免疫应答有关，另一方面与肠道功能障碍以及腹泻导致对营养物质的消化吸收能力降低有关[19-20]。前人研究表明，大肠杆菌诱导的肠道抗氧化能力降低可能是其导致仔猪腹泻的重要机制[21]。本研究也发现，大肠杆菌攻毒显著提高了仔猪血清和空肠黏膜MDA含量，降低了血清T-AOC和T-SOD活性，有降低空肠黏膜T-AOC和T-SOD活性的趋势，结果与前人研究报道[4, 22]一致。因此，我们推测从饲粮途径增强仔猪的抗氧化能力可能是缓解仔猪大肠杆菌腹泻的有效措施之一。
3.2 复合添加剂对大肠杆菌攻毒仔猪生长性能和腹泻的影响前人研究发现，苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油作为饲料添加剂，具有改善畜禽生长性能和增强疾病抵抗力的效应。Papatsiros等[23]研究发现，饲粮中添加苯甲酸和蜡样芽胞杆菌混合物可显著提高断奶仔猪ADG，降低F/G和腹泻率。Hui等[24]研究发现，断奶仔猪饲粮中添加2 000 mg/kg苯甲酸和100 mg/kg百里香酚显著改善了仔猪生长性能，降低了腹泻指数。李洁云等[25]在研究酸化剂、益生菌、精油和酶制剂共同组合添加对断奶仔猪生长性能影响时发现，与AT组相比，该4种产品同时添加显著提高了断奶仔猪ADG，降低了F/G和腹泻率。本研究也发现，苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油组合添加显著改善了大肠杆菌攻毒仔猪ADG，降低了F/G、腹泻率和腹泻指数，且作用效果优于AT组。其原因可能与3种添加剂的抗氧化作用有关。
3.3 复合添加剂对大肠杆菌攻毒仔猪抗氧化能力的影响众所周知，为了抵抗氧化损伤，体内存在的酶类抗氧化系统和非酶类抗氧化系统相互作用共同维持机体自由基平衡，其中T-AOC、T-SOD、GSH-Px是酶类抗氧化系统的重要组成部分[26]。MDA则是脂质过氧化所产生的稳定终产物，其含量常常用来反映机体内的脂质过氧化程度和细胞损伤程度[27]。已有研究发现，苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油具有很强的抗氧化能力，可以缓解病理条件诱导的氧化损伤。刁慧[28]研究发现，断奶仔猪饲粮中添加0.5%苯甲酸能够显著降低仔猪血清MDA含量。唐晓溪[29]在小鼠饲粮中添加植物精油可提高肝脏GSH-Px活性及心脏过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低肝脏、肺脏MDA含量。本研究发现，饲粮添加复合添加剂显著缓解了大肠杆菌攻毒引起的血清和空肠黏膜T-AOC和T-SOD活性降低及MDA含量升高，且作用效果优于AT组。结果表明，苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油组合添加可提高机体和肠道的抗氧化能力，缓解大肠杆菌攻毒诱导的氧化损伤。
3.4 复合添加剂对大肠杆菌攻毒仔猪空肠消化吸收功能的影响小肠是机体食物消化吸收的最主要部位，肠黏膜上的二糖酶对碳水化合物的吸收起着重要作用[30]。Jang等[31]研究发现，肉鸡饲粮中添加50 mg/kg的植物精油能显著提高胰蛋白酶、α-淀粉酶和麦芽糖酶的活性。郭娟[32]研究发现，地衣芽袍杆菌能够显著提高小肠黏膜二糖酶活性。本研究发现，大肠杆菌攻毒使仔猪空肠黏膜麦芽糖酶和蔗糖酶活性分别降低了21.18%和9.46%，而饲粮添加复合添加剂则明显抑制大肠杆菌诱导的麦芽糖酶和蔗糖酶活性的下降。与此同时，在动物肠道黏膜中存在大量的养分转运载体，其表达量的高低反映出肠道对营养物质的吸收转运能力。GLUT2和SGLT1是介导葡萄糖吸收的主要载体[33]。PepT1在小肠黏膜中主要运输来自食物蛋白质消化分解产生的二肽和三肽[34]。本研究发现，大肠杆菌攻毒显著降低了仔猪空肠黏膜SGLT1 mRNA表达水平，而饲粮添加复合添加剂显著抑制了大肠杆菌诱导的SGLT1和PepT1 mRNA表达水平的降低。结果表明，饲粮添加复合添加剂可显著改善大肠杆菌攻毒仔猪肠道养分消化吸收能力，这可能与苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油组合添加可提高仔猪抗氧化能力，缓解大肠杆菌攻毒诱导的氧化损伤，进而改善肠道屏障结构和功能完整性有关。
4 结论饲粮添加苯甲酸、凝结芽孢杆菌和牛至油复合添加剂可显著抑制大肠杆菌诱导的仔猪腹泻和氧化损伤，提高仔猪抗氧化能力，改善仔猪生长性能和空肠养分消化吸收能力。
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