2. 美国优哉公司, 芝加哥 IL60611;
3. 上海牧冠企业发展有限公司, 上海 201199
2. Oil-Dri Corporation of America, Chicago, IL60611, USA;
3. Shanghai Naseco Products Company, Shanghai 201199, China
动物机体的生长发育和维持生产不但与养分的摄入量有关，而且与其对养分的消化吸收能力紧密相关。众所周知，肠道是动物对饲粮养分消化吸收的重要器官，拥有健康的肠道对动物而言至关重要。因此，改善动物肠道健康、提高饲料利用率是畜牧业健康发展面临的重大课题。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，BS)是生产中应用广泛的微生物饲料添加剂之一，它可以优化肠道菌群、改善肠道形态、增强机体免疫力、促进养分消化吸收，进而提高动物的生产性能[1-4]。蒙脱石(montmorillonite，MMT)是一种天然的硅铝酸盐矿物，有良好的离子交换性、吸附性和黏附性，能在动物肠道中吸附霉菌毒素、重金属、细菌及其毒素，修复和保护消化道黏膜，已被证实可改善动物肠道健康[5-7]。但目前，关于MMT对饲粮养分利用影响的研究结论[8-9]不尽一致，还需进一步探讨。饲粮中养分被动物摄入后需要在消化道进行一系列消化后降解为小分子物质，再由肠道中相应的转运载体转运进入细胞被机体吸收利用。因此，转运载体的正常表达对于养分吸收至关重要，BS和MMT是否通过调节肠黏膜养分转运载体的表达而影响饲粮养分的吸收，值得探讨。另外，最近在断奶仔猪上的研究发现，嗜酸乳杆菌和MMT联用对调节肠道菌群、改善肠黏膜屏障功能和提高生长性能的作用优于这二者单独使用[10]，这提示益生菌和MMT在维护肠道健康和促进养分消化吸收等方面可能具有协同作用，可使动物表现出更好的生产性能。因此，我们推测BS和MMT联用可能更有利于提高饲粮养分利用率、改善产蛋鸡的生产性能。目前，虽然关于BS和MMT单独在产蛋鸡生产中的应用已有较多报道，但关于二者之间协同作用的研究尚未报道。鉴于此，本试验旨在探讨BS、MMT及其互作对产蛋鸡生产性能、养分表观利用率和肠道养分转运载体基因表达的影响，并观察BS和MMT是否具有协同作用，以期为其在产蛋鸡生产中的应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料BS为市售产品，活菌数≥1×109 CFU/g。MMT为市售产品，其主要成分含量为：钙型MMT>70%，无定形水合二氧化硅>15%，其他矿物元素 < 15%。
1.2 试验设计与饲养管理本试验于2017年7月21日至2017年10月7日在湖南生安赛特农牧科技有限公司进行。采用2×2双因子随机试验设计，主效应分别为BS(0、0.5 g/kg)、MMT(0、0.5 g/kg)及二者互作。选择360只29周龄健康的罗曼粉壳蛋鸡，随机分为4组(每组6个重复，每个重复15只)，分别饲喂基础饲粮(对照组)、基础饲粮+0.5 g/kg BS(BS组)、基础饲粮+0.5 g/kg MMT(MMT组)、基础饲粮+0.5 g/kg MMT+0.5 g/kg BS(MMT+BS组)。预试期7 d，正试期70 d。预试期各组产蛋鸡统一饲喂基础饲粮，每天对鸡群进行观察，并及时调整鸡群，使各组产蛋鸡的日采食量[(116.61±0.45) g，P=0.603]、产蛋率[(95.72±0.48)%，P=0.955]和蛋重[(59.90±0.21) g，P=0.689]差异不显著。试验用基础饲粮参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)并结合生产实际配制，其组成及营养水平见表 1。在基础饲粮配制好后，准确称取所需的BS和MMT添加到基础饲粮中，逐级充分混匀，在配制MMT+BS组试验饲粮时，先将所需的BS和MMT充分混匀后再逐级混匀于基础饲粮中。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
产蛋鸡采用上、中、下3层阶梯式笼养，每笼3只，每5笼1个重复，各组的试验鸡保证分布在上、中、下层的数量相等。每日喂料2次，捡蛋2次，上午、下午各匀料2次。各组产蛋鸡饲养管理条件相同，试验第1~5周鸡舍温度、相对湿度分别为(27.06±2.27) ℃、(77.39±6.13)%；试验第6~10周鸡舍温度、相对湿度分别为(24.03±2.40) ℃、(77.07±6.21)%。产蛋鸡自由采食、饮水，每日光照时间为16 h，自然光照和人工光照相结合。每日清扫鸡舍1次，每周对鸡舍喷雾消毒2次，每隔3 d清粪1次。
1.3 检测指标与方法 1.3.1 生产性能正式试验期内，每日记录各组(以重复为单位)的产蛋数、蛋重、软破壳蛋数和死淘鸡数，每周统计1次采食量，计算统计期内的平均日采食量(ADFI)、产蛋率、平均蛋重、料蛋比、日产蛋量和死淘率。
1.3.2 养分表观利用率代谢试验进行3 d(试验第66、67、68天)，采用内源性指示剂法。每个重复随机选取1只鸡单独饲养，在鸡笼下面放干净集粪盘。每天喂料和收粪2~3次，自由采食、饮水。收粪前仔细拣去粪盘中的羽毛、饲粮和皮屑等杂物，粪样立即用10%盐酸固定，将3 d收集的粪样充分混匀并装于密封袋，做好标记，-20 ℃冰箱保存。
将粪样置于烘箱中，65 ℃烘干至恒重，然后于室温下回潮，粉碎过40目筛，制得风干粪样。将饲粮样粉碎过40目筛。粪样与饲粮样做好标记，置于干燥器中密封保存。参照张丽英[11]的方法测定饲粮和粪便中干物质、粗蛋白质、能量、粗脂肪、钙和磷的含量。参照GB/T 23742—2009测定饲粮和粪便中盐酸不溶灰分含量。养分表观利用率计算公式如下：
某养分表观利用率(%)=100-100×(粪便中某养分含量×饲粮中盐酸不溶灰分含量)/(粪便中盐酸不溶灰分含量×饲粮中某养分含量)。
1.3.3 肠黏膜养分转运载体mRNA表达量试验结束后，从每个重复中随机选取1只鸡，屠宰后迅速剖开腹腔，取空肠并挤出食糜，用灭菌生理盐水轻轻冲洗除去肠壁内容物，用灭菌载玻片小心刮取空肠黏膜1~2 g，用锡箔纸包好，立即放入液氮速冻，运回实验室后于-80 ℃冰箱冻存。
使用Trizol法提取空肠黏膜总RNA，并用蛋白核酸测定仪(ND-2000 UV，赛默飞世尔，美国)和1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量后，利用反转录试剂盒(宝生物，大连)反转录制备cDNA，并以其为模板使用荧光定量PCR试剂盒(宝生物，大连)参照其说明书进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR仪为CFX96型(伯乐，美国)，反应体系为10 μL：SYBR 5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL，单蒸水(dH2O)3.2 μL。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，39个循环；在65~95 ℃绘制熔解曲线。以β-肌动蛋白(β-actin)为参比基因，引物采用Primers软件设计，由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表 2，目的基因mRNA表达量采用2-ΔΔCt法计算。
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表 2 引物序列信息 Table 2 Information of primer sequences |
采用SAS 9.2统计软件中的一般线性模型(GLM)程序进行双因素分析，并用Duncan氏法进行多重比较。结果以平均值和集合标准误(SEM)表示，用P < 0.05表示差异显著，0.05≤P < 0.10表示有提高或降低的趋势。
2 结果 2.1 BS、MMT及其互作对产蛋鸡生产性能的影响由表 3可知，与对照组相比，各添加组产蛋鸡产蛋率均显著提高(P < 0.05)；MMT组和MMT+BS组日产蛋量较对照组显著提高(P < 0.05)；MMT+BS组料蛋比较对照组和BS组显著降低(P < 0.05)；各组间ADFI、死淘率和平均蛋重均差异不显著(P>0.05)。主效应分析表明，饲粮中添加BS显著提高了产蛋率和日产蛋量(P < 0.05)；饲粮中添加MMT显著提高了产蛋率和日产蛋量(P < 0.05)，显著降低了料蛋比(P < 0.05)，有提高平均蛋重的趋势(P=0.090)；BS和MMT互作对产蛋鸡生产性能无显著影响(P>0.05)。
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表 3 BS、MMT及其互作对产蛋鸡生产性能的影响 Table 3 Effects of BS, MMT and their interaction on performance of laying hens |
由表 4可知，BS组粗脂肪表观利用率较MMT组有提高的趋势(P=0.083)；与对照组相比，BS组和MMT+BS组能量表观利用率显著提高(P < 0.05)；BS组和MMT+BS组粗蛋白质表观利用率均高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。主效应分析表明，饲粮中添加BS显著提高了干物质、粗脂肪、能量和粗蛋白质的表观利用率(P < 0.05)；MMT、MMT和BS互作对产蛋鸡养分表观利用率均无显著影响(P>0.05)。
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表 4 BS、MMT及其互作对产蛋鸡养分表观利用率的影响 Table 4 Effects of BS, MMT and their interaction on apparent utilization of nutrients of laying hens |
由表 5可知，MMT+BS组产蛋鸡空肠黏膜易化葡萄糖转运载体2(GLUT2)mRNA表达量较MMT组有提高的趋势(P=0.072)；与对照组相比，各添加组产蛋鸡空肠黏膜碱性氨基酸转运载体1(CAT1)mRNA表达量均显著提高(P < 0.05)。主效应分析表明，饲粮中添加BS对产蛋鸡肠黏膜各养分转运载体mRNA表达量均无显著影响(P>0.05)；饲粮中添加MMT显著上调了产蛋鸡肠黏膜CAT1 mRNA表达量(P < 0.05)；BS和MMT互作对产蛋鸡肠黏膜GLUT2和CAT1 mRNA表达量有显著影响(P < 0.05)。
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表 5 BS、MMT及其互作对产蛋鸡空肠黏膜养分转运载体mRNA表达量的影响 Table 5 Effects of BS, MMT and their interaction on mRNA expression levels of nutrient transporters in intestinal mucosa of laying hens |
本试验发现，饲粮中添加MMT能提高产蛋鸡的产蛋率和日产蛋量，降低料蛋比，该结果与前人的报道[12-14]基本一致。本试验中，饲粮中添加MMT对饲粮中各养分的表观利用率均无显著影响，提示MMT可能不是通过促进养分的消化吸收而改善产蛋鸡的生产性能的。本课题组前期的研究表明，MMT明显增强了产蛋鸡的抗氧化和免疫功能，降低了血清和肠道中内毒素含量，改善了肠道菌群和肠黏膜形态[14-16]。因此，我们猜测MMT改善产蛋鸡生产性能的原因可能与其维护肠道健康和提高机体的健康水平有关。目前，关于BS对产蛋鸡生产性能影响的研究结论不尽一致，但总体上表明其能改善产蛋鸡的生产性能。Guo等[2]和Zhang等[17]均报道，BS不影响产蛋鸡的产蛋率、平均蛋重和ADFI，但会降低料蛋比；而Ribeiro等[3]研究表明，饲粮中添加BS后产蛋鸡的产蛋率提高了2.63%，日产蛋量提高了3.96%，但料蛋比无显著变化。本试验发现，饲粮中添加BS显著提高了产蛋鸡的产蛋率和日产蛋量，对平均蛋重、料蛋比和ADFI无显著影响。本试验还发现，饲粮中添加BS提高了产蛋鸡对饲粮中干物质、粗脂肪、能量和粗蛋白质的表观利用率，说明BS可通过促进饲粮养分的消化吸收而改善产蛋鸡的生产性能。以上试验结果的差异可能是由于产蛋鸡的饲养阶段、环境卫生条件、试验周期以及BS的来源、添加水平等因素的不同所致。本试验首次探讨了BS和MMT在产蛋鸡上的联用效果，结果表明，MMT+BS组产蛋率、日产蛋量和平均蛋重均高于BS组和MMT组，且料蛋比显著低于对照组和BS组，说明二者联用可获得更佳的生产性能。类似的，Cao等[10]报道，MMT-嗜酸乳杆菌复合物对仔猪促生长的效果明显优于单独添加MMT或嗜酸乳杆菌。MMT和益生菌的互作机制可能如下：MMT通过物理吸附作用，部分固定益生菌于其表面，使益生菌覆盖或埋藏于蒙脱石的颗粒中，可能为益生菌对抗消化道中的恶劣环境提供物理屏障[18]；MMT可在消化道内延展，形成连续的保护膜，且能够与消化道黏液蛋白静电结合，促进黏液量的增加和黏液质量的改善，修复和保护肠道黏膜[19]，可能利于外源益生菌短暂定植于肠道，发挥生态效应；此外，MMT可吸附肠道有害菌，优化肠道菌群[6]，或许间接提高了益生菌同有害菌的竞争力，增强益生功效。益生菌和MMT联用具有一定优势，值得进一步探讨，其联合作用机制还需深入地研究；另外，以MMT为载体固定BS，制备MMT-BS复合物，猜想其作用效果可能优于二者简单的物理混合，值得关注和探讨。
3.2 BS、MMT及其互作对产蛋鸡养分表观利用率的影响研究表明，BS可分泌植酸酶、纤维素酶和淀粉酶等多种酶类，补充动物内源酶的不足[20-21]；BS能够促进消化酶的分泌，提高肠道中消化酶和二糖酶的活性[4, 22]；另外，BS还能改善动物肠道形态，如提高绒毛高度、降低隐窝深度、增加养分与肠绒毛的接触面积[1, 4]。综上，BS可通过产生多种酶类、促进消化酶分泌和改善肠黏膜形态等促进养分的消化与吸收，提高饲粮养分的利用率。本试验发现，饲粮中添加BS能够提高产蛋鸡对饲粮中干物质、粗脂肪、能量和粗蛋白质的表观利用率，该结果与前人在蛋鸡[4]、肉鸡[23]和鹅[24]上的试验结果基本一致。董淑慧[8]研究发现，饲粮中添加0.5%或1.0%的MMT不影响奶牛饲粮中干物质、蛋白质、纤维和有机物的消化率，而添加2.5%以上的MMT使得养分的消化率显著降低；李静等[9]报道，肉鸡饲粮中添加0.1%的载铜MMT不影响干物质、能量和粗蛋白质的表观利用率，而添加0.2%以上的载铜MMT后养分表观利用率显著降低。上述研究表明，添加较低水平的MMT不影响饲粮养分的利用率，本试验的结果也证实了这一结论。MMT比表面积大，表面分布着无数微孔，具有很强的吸附性能，在肠道中可能会吸附饲粮养分，影响养分利用；同时，其能保护消化道黏膜，增加肠道食糜黏度，改善肠道健康，可能也利于养分消化、吸收。但是，过量添加MMT会稀释饲粮养分，且其对养分的吸附作用也会加强，进而降低养分的利用率。此外，本试验还发现，与单独添加MMT相比，MMT和BS联用显著提高了能量的表观利用率，干物质、粗脂肪和粗蛋白质的表观利用率也有所提高；然而，MMT和BS联用与单独添加BS相比并没有表现出优势，二者联用对促进饲粮养分利用是否具有协同作用还有待进一步探讨。
3.3 BS、MMT及其互作对产蛋鸡肠黏膜养分转运载体基因表达的影响糖类、蛋白质和脂类是动物生长和维持生产不可或缺的三大养分，它们被动物摄入后需要在胃肠道中进行一系列消化后降解为氨基酸、小肽、单糖和脂肪酸等小分子物质，再由肠道刷状缘膜和基底膜中相应转运载体转运进入血液循环供机体代谢使用。因此，转运载体的正常表达对于动物机体至关重要。本试验发现，BS、MMT及其联用均能上调产蛋鸡肠黏膜CAT1 mRNA表达量，二者联用还有提高GLUT2 mRNA表达量的趋势，且二者互作对CAT1和GLUT2 mRNA表达量有显著影响，提示BS和MMT联用可增强肠道对碱性氨基酸和葡萄糖的吸收能力，有利于提高饲粮养分的利用率。本试验中，虽然MMT+BS组干物质、能量和粗蛋白质的表观利用率均高于其他组，但BS和MMT对各养分的表观利用率均未产生显著的交互作用。动物体内养分代谢的过程相对复杂，尽管BS和MMT联用促进了肠道对饲粮养分的吸收，使更多的养分能够进入血液循环供机体代谢使用，但代谢过程中可能受到其他因素的影响，导致养分的利用率并没有明显提高；此外，本研究仅是从转录水平初步探讨了养分转运载体基因的表达情况，基因在转录水平上的表达与在蛋白质水平上的表达可能存在一定差异，本研究中养分转运载体基因表达的结果还需在蛋白质水平上进行验证。肠上皮细胞中转运载体的表达受小肠肠腔中养分的调节，其含量增加，相应转运载体的数量和活性也随之增加[25-26]。我们猜测MMT和BS可能是通过促进饲粮养分的消化，使肠腔中小分子养分含量增加而上调相关转运载体基因的表达。目前，关于MMT和BS对动物肠道养分转运载体基因表达影响的研究非常少，今后还需进一步探讨。
4 结论① 饲粮中单独添加BS和MMT及二者联用均能够提高产蛋鸡的产蛋率和日产蛋量。
② 饲粮中添加BS能够提高产蛋鸡对饲粮中干物质、粗脂肪、粗蛋白质和能量的表观利用率。
③ 饲粮中单独添加BS和MMT及二者联用均能够上调产蛋鸡肠黏膜CAT1的表达。
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