作为生产和使用抗生素的大国，我国每年有近一半的抗生素被用于畜牧业，由此引发的耐药性威胁也越发受到公众关注。畜牧业减用乃至停用饲用抗生素已是大势所趋，各国畜牧科技工作者致力于寻找抗生素的理想替代品。有机酸、酶、益生菌、益生元和植物提取物均具有一定地替代抗生素的潜力^[1]。植物提取物，特别是药用植物提取物，具有抗菌、抗氧化的作用，常被用于改善人类健康和治疗疾病^[2]。随着对植物提取物中活性成分的分离、鉴定以及对其作用机理的认识，越来越多的研究认为植物提取物具有替代饲用抗生素的作用^[3]。

核桃(Juglans regia Linn)是胡桃科胡桃属多年生落叶乔木，其树皮、果皮、枝叶和根部均可入药，具有消除自由基、抗肿瘤、抗氧化及杀虫等作用^[4-5]。本实验室的研究也表明，以25%乙醇提取8 h获得的核桃青皮提取物对大肠杆菌(Escherichia coli，E. coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B. subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus)具有良好的抑制作用^[6]。核桃青皮提取物中的化合物主要是植物酚类化合物、黄酮类化合物和胡桃醌；在酚类化合物中又以对羟基苯甲酸、丁香酸、鞣花酸和单宁酸含量较高，黄酮类化合物则以芦丁含量最高^[7-8]。这些活性成分是否是核桃青皮提取物具有抑菌活性的主要原因尚不清楚。本研究选用核桃青皮和叶片中7种含量相对较高的活性成分进行抑菌活性研究，为解析核桃青皮提取物的抑菌活性及开发新的饲用抗生素替代品提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验设计

本试验采用K-B法(Kirby-Bauer test)即滤纸片扩散法^[9]，以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌为受试菌，分别以1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0和0.062 5 mg/mL的绿原酸、鞣花酸、丁香酸、芦丁、单宁酸、对羟基苯甲酸和胡桃醌为研究对象，以抑菌圈直径大小反映其体外抑菌活性。

1.2 试剂与菌种

绿原酸(纯度≥98%)、鞣花酸(纯度≥95%)、丁香酸(纯度＞98%)、芦丁(纯度＞95%)、单宁酸(纯度＞98%)和对羟基苯甲酸(纯度＞98%)为BBI Life Science公司产品；胡桃醌(纯度＞97%)为Sigma-Aldrich公司产品；氨苄青霉素钠(纯度≥96%)为Genview公司产品；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌为新疆农业大学动物营养实验室保存菌种。

1.3 活化菌种及菌悬液的制备^[10]

挑取待活化菌种在LB固体培养基上划线，37 ℃恒温培养箱培养24 h，至长出菌落。挑取单菌落接种于5 mL LB液体培养基，于37 ℃、170 r/min培养过夜后用无菌LB液体培养基将细菌浓度调为10⁸ CFU/mL的菌悬液备用。

1.4 供试样品的制备

准确称取待测植物次生代谢物2.0 mg，用相应溶剂溶解使浓度为1.000 0 mg/mL后备用。绿原酸和对羟基苯甲酸用无菌生理盐水配制，鞣花酸和芦丁用0.2 mol/L氢氧化钠(NaOH)配制，单宁酸、丁香酸和胡桃醌分别用25%乙醇、50%乙醇和无水乙醇配制。取母液用相应溶剂进行2倍稀释，稀释终浓度分别为0.500 0、0.250 0、0.125 0和0.062 5 mg/mL。

1.5 药敏片的制备

用打孔器将定性滤纸制成药敏片(直径=6 mm)，药敏片在相应溶剂中室温浸泡10 min后备用。

1.6 抑菌活性的测定

取0.1 mL浓度为10⁸ CFU/mL的菌悬液均匀涂布在LB固体培养基上，待培养基将菌液吸收完全后用无菌镊子夹取药敏片置培养基表面并使药敏片完全贴服，将培养皿倒置放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h后用十字交叉法测量抑菌圈直径。试验以相应溶剂作为空白对照，以0.10 mg/mL氨苄青霉素钠为阳性对照。所有样本均重复3次。

1.7 数据统计分析

数据用SPSS 18.0软件进行分析，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示。当因素水平达到显著后采用Duncan氏法进行多重比较，显著水平为P≤0.05。

2 结果与分析 2.1 不同浓度绿原酸的抑菌活性

绿原酸对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱(图 1)。从表 1可以看出，绿原酸对供试菌的抑制作用由强至弱依次为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。不同浓度的绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均显著小于氨苄青霉素钠(P < 0.05)；而对枯草芽孢杆菌，绿原酸浓度为1.000 0 mg/mL时的抑菌圈直径与氨苄青霉素钠无显著差异(P>0.05)，表明绿原酸对枯草芽孢杆菌具有极强的抑制作用。

2.2 不同浓度对羟基苯甲酸的抑菌活性

在0.062 5~1.000 0 mg/mL浓度范围内对羟基苯甲酸对大肠杆菌无抑制作用，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用，其中枯草芽孢杆菌对对羟基苯甲酸较敏感(图 2)。由表 2可知，在对羟基苯甲酸浓度为1.000 0 mg/mL时，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为10.58和8.50 mm，但都显著小于氨苄青霉素钠的抑菌圈直径(P < 0.05)。随着浓度的降低，对羟基苯甲酸对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均显著下降(P < 0.05)。

2.3 不同浓度鞣花酸的抑菌活性

鞣花酸对3种受试菌均具有一定的抑制作用(图 3)。由表 3可知，鞣花酸对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用，在0.062 5~1.000 0 mg/mL浓度范围内均具有抑制作用。相比之下，鞣花酸对枯草芽孢杆菌的抑制作用强于对大肠杆菌的抑制作用，且当浓度达到0.250 0 mg/mL后，鞣花酸对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径均显著大于氨苄青霉素钠(P < 0.05)，说明对枯草芽孢杆菌的抑制作用强于氨苄青霉素钠。鞣花酸浓度达到1.0 mg/mL后对金黄色葡萄球菌才具有抑制作用，且其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径显著小于氨苄青霉素钠(P < 0.05)，说明鞣花酸对金黄色葡萄球菌的抑制作用弱于氨苄青霉素钠。

2.4 不同浓度芦丁的抑菌活性

在3种受试菌中，相比于枯草芽孢杆菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对芦丁更为敏感(图 4)。由表 4可知，芦丁浓度为1.0 mg/mL时，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为10.83、8.75和10.67 mm。由此可以看出，芦丁对供试菌的抑制作用顺序为大肠杆菌=金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌。不同浓度的芦丁对3种供试菌的抑菌圈直径均显著低于氨苄青霉素钠(P < 0.05)，随着浓度的降低，芦丁对3种受试菌的抑菌圈直径均显著下降(P < 0.05)。

2.5 不同浓度单宁酸的抑菌活性

单宁酸对3种受试菌的抑制作用均较弱(图 5)。由表 5可知，单宁酸对大肠杆菌无抑制作用。浓度为1.0 mg/mL时，单宁酸对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为9.42、8.83 mm，显著小于氨苄青霉素钠对上述受试菌的抑菌圈直径(P < 0.05)，并且随着浓度的降低，单宁酸对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径显著下降(P < 0.05)，当浓度低于0.5 mg/mL后，单宁对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌不再具有抑制作用。

2.6 不同浓度丁香酸的抑菌活性

丁香酸对3种受试菌均具于具有一定的抑制作用(图 6)。由表 6可知，丁香酸浓度为1.0 mg/mL时，3种受试菌均对丁香酸表现出不同的敏感性，其中枯草芽孢杆菌对丁香酸最敏感，抑菌圈直径最大，并显著大于阳性对照(P < 0.05)，说明1.0 mg/mL丁香酸对枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用。但当丁香酸的浓度低于0.5 mg/mL后，对枯草芽孢杆菌不产生抑制作用。与大肠杆菌相比，丁香酸对金黄色葡萄球菌具有更强的抑制作用。

2.7 不同浓度胡桃醌的抑菌活性

胡桃醌对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均表现出不同程度的抑制作用(图 7)。由表 7可知，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径，1.000 0 mg/mL胡桃醌与空白对照及阳性对照均无显著差异(P>0.05)，因胡桃醌中有1个滤纸片无抑菌圈，导致标准差较大，原因可能是试验操作较慢，无水乙醇挥发过快。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，在0.062 5~1.000 0 mg/mL浓度范围内，胡桃醌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌圈的出现，显示出较高的敏感性；当胡桃醌浓度为1.000 0 mg/mL时，抑菌圈直径与阳性对照无显著差异(P>0.05)，其抑菌圈直径甚至显著高于阳性对照(P < 0.05)，表明胡桃醌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用。

3 讨论 3.1 酚类化合物的抑菌活性及其机制

核桃青皮提取物对细菌、真菌都有较好的抑制作用^[5-6]，引起抑菌作用的主要活性物质尚不清楚。酚酸、黄酮类化合物和胡桃醌是核桃青皮的主要植物次生代谢物。Nour等^[7]利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定了核桃叶片甲醇提取物中17种酚类化合物的含量，其中主要是酚酸、黄酮和胡桃醌，发现在黄酮类化合物中杨梅素、儿茶素和芦丁的含量均较高，每100 g鲜重中分别达到141.05、212.81和99.08 mg，鞣花酸是核桃叶片中含量最高的酚酸，每100 g鲜重中达到84.62 mg，绿原酸含量并不高，每100 g鲜重中仅为5.21 mg，丁香酸和没食子酸则更低，每100 g鲜重中仅分别为0.66和0.30 mg，每100 g鲜重中胡桃醌含量为88.73 mg。然而，Chrzanowski等^[8]以80%甲醇提取核桃青皮提取物，并测定了其中的酚酸含量，结果发现对羟基苯甲酸、绿原酸、单宁酸和丁香酸含量较高，分别达到618.8、306.7、237.4和427.0 μg/g DM，而没食子酸含量最低，在叶片提取物中仅为12.6 μg/g DM，在核桃青皮提取物中未检出。因此，本研究选取了核桃次生代谢物中含量较高的7种化合物进行独立抑菌活性研究，为阐明核桃青皮提取物的抑菌活性以及开发新的饲用抗生素替代品提供参考。

从分子结构来看，绿原酸、单宁酸、鞣花酸和芦丁为多酚化合物，对羟基苯甲酸是苯甲酸的单取代酚酸，丁香酸则是对羟基苯甲酸的衍生物，胡桃醌属萘醌类化合物。大量研究表明，植物酚类化合物和黄酮类化合物对细菌具有一定的抑制作用。鞣花酸可抑制表皮葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、克氏肺炎杆菌、伤寒沙门氏杆菌，并且其抑制作用强于庆大霉素和链霉素^[11]。芦丁对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌具有一定的抑制作用^[12]，绿原酸可抑制肺炎双球菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等生长，其最小抑菌浓度(MIC)分别为20、20、40、40、80 μg/mL^[13]。大肠杆菌、变形链球菌和铜绿假单胞菌对缩合单宁敏感，而大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等对可水解单宁敏感^[14]。有关对羟基苯甲酸和丁香酸抑菌活性的研究还鲜见报道。Cho等^[15]从稻壳中提取的对羟基苯甲酸在浓度为200~400 μg/mL时可抑制包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌在内的17种细菌和2种酵母的生长。丁香酸可抑制产乙醇大肠杆菌LY01和阪崎肠杆菌的生长^[16]。在本研究中，除大肠杆菌对羟基苯甲酸和单宁酸不敏感外，其他植物次生代谢物对3种受试菌均有不同程度的抑制作用。

通过改变微生物细胞膜通透性、干扰酶活性、改变细胞代谢、抑制核酸合成等途径，这些植物源活性成分起到抑菌和杀菌的作用^{[14, 17]}。绿原酸和鞣花酸能破坏细菌的细胞壁和膜结构，增加细胞的通透性，一方面影响细胞结构的稳定性，另一方面导致金属离子、蛋白质的渗漏，使细胞内物质和能量代谢水平降低，进而起到抑菌作用^[18-20]。丁香酸可使阪崎肠杆菌细胞活力和细胞内ATP水平快速降低，这主要是由于膜通透性降低后导致钾离子(K⁺)和氢离子(H⁺)浓度梯度消失，ATP合成减少^[16]。黄酮类化合物通过抑制DNA解旋酶、拓扑异构酶、二氢叶酸还原酶活性从而抑制细菌DNA的合成^[17]。芦丁是非常强的拓扑异构酶Ⅳ抑制剂，可选择性促进大肠杆菌拓扑异构酶Ⅳ依赖的DNA切割，抑制依赖拓扑异构酶Ⅳ的DNA连接^[21]。除此以外，黄酮类化合物还通过抑制细菌细胞壁和细胞膜的合成起到抑菌活性^[22]。

3.2 胡桃醌的抑菌活性及机制

胡桃醌具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抑菌、杀虫等，目前的研究主要集中在化感作用、抑制植物病原真菌和抗肿瘤等领域^[23]，而有关其对细菌抑制作用的研究较少。吴朝霞等^[24]报道，与青霉等真菌相比，胡桃醌可较好地抑制大肠杆菌等细菌，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度约为75 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度约为37.5 μg/mL。本研究中，胡桃醌的浓度稀释至0.062 5 mg/mL时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，而当胡桃醌的浓度稀释至0.500 0 mg/mL时已对枯草芽孢杆菌没有抑制作用。这种差异可能与受试菌的浓度、溶解活性成分的溶剂、生长的培养基及pH有关^[17]。胡桃醌的抑菌作用机理与植物多酚相似，也是通过破坏大肠杆菌细胞膜完整性，增强通透性使蛋白质及K⁺、钠离子(Na⁺)等带电离子外漏，降低细胞对葡萄糖的摄入及ATP合成酶活性等^[25-26]。Wang等^[27-28]利用蛋白质组学技术研究发现，胡桃醌可提高金黄色葡萄球菌氧化还原酶的表达，诱导过氧化的发生；抑制参与蛋白质合成、三羧酸循环、DNA和RNA合成的蛋白质表达，并直接与DNA结合降低DNA的复制和转录。

3.3 不同植物次生代谢物抑菌活性的差异及原因

在本研究中，根据抑菌圈直径的大小可以看出，对大肠杆菌抑制作用的顺序为鞣花酸＞胡桃醌＞芦丁＝丁香酸＞绿原酸＞对羟基苯甲酸＝单宁酸；对枯草芽孢杆菌抑制作用的顺序为鞣花酸＞绿原酸＝对羟基苯甲酸＞丁香酸＞单宁酸＞芦丁＞胡桃醌；对金黄色葡萄球菌抑制作用的顺序为胡桃醌＞丁香酸＞芦丁＞单宁酸＞鞣花酸＞对羟基苯甲酸＞绿原酸。由此可见，7种植物次生代谢物对受试菌均具有一定的抑制作用，但不同化合物的抑菌活性又存在明显不用。这种差异可能与化合物的结构、理化性质、受试菌的细胞结构有关。分子结构中的官能团是影响抑菌活性的重要因素之一。如黄酮类化合物中的焦酚结构是强抑菌活性的指针；另外，具有抑菌活性的黄酮类化合物在其A环的C-5和C-7位上均有羟基^[12]。Kabir等^[29]报道绿原酸及其衍生物的解离常数(pK_a)和分配系数(LogP)不同，其抑菌活性存在明显差异，并发现在中性pH条件下，pK_a值越大，抑菌活性也越大；LogP值与抑菌活性呈显著的相关关系。Yang等^[2]认为，革兰氏阳性菌细胞壁含大量肽聚糖，酚类化合物等疏水性分子易穿透细胞，作用于细胞壁和细胞质，在低浓度时可干扰能量产生的酶，高浓度时可导致蛋白质变性；而革兰氏阴性菌的肽聚糖含量要少的多并且有一层外膜，因此，革兰氏阳性菌对植物源性化合物更敏感，这也是导致同一种化合物对不同细菌抑制作用不同的原因之一。

4 结论

绿原酸、鞣花酸、丁香酸、芦丁、单宁酸、对羟基苯甲酸和胡桃醌这7种植物次生代谢物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有不同的抑菌活性，其中鞣花酸对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用，胡桃醌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用。